陳希苗，李美英，許秋莉，熊楚欣，孫遠明*

（華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東省食品質(zhì)量與安全重點實驗室，廣東 廣州 510642）

山楂（Crataegus pinnatifida Bunge）是我國傳統(tǒng)的藥食兩用資源，其味酸微澀，深受民眾喜愛。中醫(yī)記載其有行氣散瘀、消食導(dǎo)滯的功效，其藥用的歷史已有300多年[1]。現(xiàn)代研究表明，山楂具有降血脂、抗衰老、抗癌等多種藥理作用，其顯著的抗氧化能力被認為是發(fā)揮藥理學(xué)作用的重要基礎(chǔ)[2-4]。曾有學(xué)者測定了30 種水果的抗氧化活性，發(fā)現(xiàn)山楂抗氧化能力最強，其亞鐵離子還原能力為柑橘的7 倍[5]。

山楂的抗氧化活性與其含有的多酚類物質(zhì)密不可分，相關(guān)分析結(jié)果表明，山楂鮮果總多酚含量與氧自由基吸收能力（oxygen radical absorbance capacity，ORAC）存在正相關(guān)關(guān)系，相關(guān)系數(shù)r＝0.886[6]。目前，國內(nèi)外學(xué)者從山楂中分離和鑒定出逾60 種多酚類物質(zhì)，其中綠原酸、原花青素B2、表兒茶素、金絲桃苷、異槲皮苷等5 種含量較高，是山楂中主要多酚類化合物[7-8]。以往對山楂多酚的研究多關(guān)注其含量、構(gòu)成及生理學(xué)活性，關(guān)于體內(nèi)胃腸道環(huán)境對其多酚成分及抗氧化活性的影響鮮見報道。然而，多酚在體內(nèi)各種消化道酶和酸堿環(huán)境的作用下其結(jié)構(gòu)、含量及構(gòu)成可能發(fā)生改變，影響其生理活性，不同食品中由于其多酚形態(tài)及種類存在差異，導(dǎo)致其在胃腸消化中的變化規(guī)律也不相一致，如Bouayed等[9]發(fā)現(xiàn)蘋果多酚經(jīng)胃腸作用后，總多酚含量增加，抗氧化活性提高，而Pinacho等[10]的研究結(jié)果卻顯示胃消化對黑刺李多酚含量無顯著影響，腸消化后多酚中香豆素類化合物降解了90%以上。目前關(guān)于山楂多酚及其抗氧化活性在胃腸道環(huán)境下的變化還有待探究。

因此，本研究對山楂進行體外模擬胃腸消化處理，分析消化道環(huán)境對山楂總多酚、黃酮含量及抗氧化能力的影響，并利用高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法測定消化前后山楂中綠原酸、原花青素B2、表兒茶素、金絲桃苷和異槲皮苷5 種主要單體酚類化合物含量的變化，進一步探究胃腸消化中山楂多酚及抗氧化能力變化的物質(zhì)基礎(chǔ)，以期為正確認知和評價山楂對人體的生理學(xué)活性提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

山楂（Crataegus pinnatifida Bunge）品種為‘大金星’山楂，來源于山東臨朐縣偏口哥生態(tài)農(nóng)業(yè)有限公司。

標準品綠原酸、原花青素B2、表兒茶素、金絲桃苷、異槲皮苷（純度＞98%）、沒食子酸、蘆丁、水溶性VE（6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid，Trolox）、Folin-Ciocalteu試劑、2,2’-偶氮二異丁基脒二鹽酸鹽（2,2’-azobis(2-methylpropionamidine)dihydrochloride，AAPH）、熒光素鈉鹽、胃蛋白酶（活力≥250 U/mg）、胰蛋白酶（8 U/mg）、豬膽粉上海源葉生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Lab-1B-80真空冷凍干燥機 北京博醫(yī)康有限公司；LC-20AT HPLC儀 日本島津公司；MK-3酶標儀美國Thermo Labsystems公司；SRY-1230型恒溫水浴搖床、FJ-200高速分速均質(zhì)機 上海標本模型廠；OSB-2000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 埃朗科技國際貿(mào)易（上海）有限公司；LYNX4000臺式冷凍離心機 德國Eppendorf公司；C18色譜柱 上海安譜實驗科技股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 山楂粉的制備

取新鮮山楂，洗凈、去核，切成1 cm左右厚度，放入-80 ℃冰箱冷凍后凍干，用粉碎機粉碎，過60 目篩，得到鮮山楂粉末，備用。

1.3.2 化學(xué)溶劑法提取多酚

1.3.2.1 山楂游離態(tài)多酚的提取

參照文獻[11]的方法，并稍作修改。準確稱取山楂粉2 g，加20 mL正己烷去脂，重復(fù)操作3 次。再加入預(yù)冷的體積分數(shù)80%丙酮溶液，在冰浴下14 000 r/min高速勻漿5 min，4 ℃、12 000 r/min離心10 min，重復(fù)提取3 次后，合并上清液。45 ℃旋轉(zhuǎn)蒸干，用去離子水定容至20 mL，即得到山楂的游離態(tài)多酚，-20 ℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2.2 山楂結(jié)合態(tài)多酚的提取

結(jié)合酚的提取采用堿水解法。向提取完游離態(tài)多酚的殘渣中加入40 mL 2 mol/L的NaOH溶液，充入氮氣，避光室溫下振蕩消化1 h。用12 mol/L HCl溶液調(diào)pH值至2.0，加入20 mL正己烷，去脂，重復(fù)2 次。加入40 mL乙酸乙酯，混勻，重復(fù)提取5 次，合并上清液，45 ℃旋轉(zhuǎn)蒸干，去離子水定容至20 mL，即得到山楂的結(jié)合態(tài)多酚，-20 ℃儲存?zhèn)溆?。提取重?fù)3 次。

1.3.3 體外模擬胃、腸消化

1.3.3.1 體外模擬胃消化

參照文獻[12]的方法并稍作修改。取3 g山楂粉，加入200 g生理鹽水，冰浴下14 000 r/min高速勻漿3 min，制成勻漿液，向勻漿液中補充生理鹽水203 g。模擬胃液組：20 g勻漿液水浴至37 ℃后，用1 mol/L HCl溶液調(diào)至pH 2.0，再加入4 mL模擬胃液（0.2 g胃蛋白酶溶于5 mL 0.01 mol/L的HCl溶液）；胃酸對照組：20 g勻漿液加入4 mL 0.01 mol/L的HCl溶液，調(diào)至pH 2.0；空白對照組：20 g勻漿液加入4 mL的生理鹽水。避光并充入氮氣，在37 ℃恒溫水浴搖床中消化2 h。分別于0、0.5、1.0、2.0 h時取樣，4 ℃、12 000 r/min離心15 min，取上清液，-80 ℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3.2 體外模擬腸消化

向經(jīng)過胃消化2 h后的樣品中加入1 mol/L NaHCO3調(diào)至pH 7.0，模擬腸液組：加入4 mL模擬腸液（0.2 g胰蛋白酶、1.25 g膽汁提取物溶于50 mL 0.1 mol/L的NaHCO3-Na2CO3緩沖溶液）；空白對照組：等體積0.1 mol/L的NaHCO3-Na2CO3緩沖液代替腸液。

1.3.4 多酚、黃酮含量測定

多酚含量的測定采用Folin-Ciocalteu法[13]，以沒食子酸為標準品，多酚含量表示為100 g山楂中沒食子酸的質(zhì)量。黃酮含量的測定采用硝酸鋁顯色法[14]，以蘆丁為標準品，黃酮含量表示為100 g山楂中蘆丁的質(zhì)量。

1.3.5 ORAC測定

ORAC測定參照Prior等[15]的方法并加以改進。在96 孔板中加入20 μL磷酸鹽緩沖液（pH 7.4），再加待測山楂提取液或消化液20 μL，接著依次加入AAPH 140 μL（終濃度6 mmol/L）和磷酸鹽緩沖液20 μL，最后添加熒光素鈉溶液20 μL（終濃度63 nmol/L）啟動反應(yīng)并迅速將酶標板置于熒光酶標儀（預(yù)置溫度37 ℃）中開始測定。采用動力學(xué)方式，每2 min測定一個點，至熒光強度衰減至零為止。另設(shè)兩個對照組：即沒有添加自由基熒光自然衰減對照（記為-AAPH）和沒有添加抗氧化劑作用自由基對照（記為+AAPH）。以Trolox為標準品，ORAC以1 g山楂中Trolox的物質(zhì)的量表示。

1.3.6 HPLC法測定山楂多酚類物質(zhì)消化前后含量的變化

1.3.6.1 HPLC條件

將1.3.3節(jié)中山楂模擬胃、腸消化液用0.22 μm濾膜過濾，進樣，分析山楂消化前后多酚類物質(zhì)含量變化情況。HPLC梯度洗脫條件如表1所示。液相色譜柱：CNWSIL C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相：流動相A為一級水（含體積分數(shù)0.1%甲酸）、流動相B為乙腈（含體積分數(shù)0.1%甲酸），紫外檢測波長：280 nm，流動相流速：1 mL/min，柱溫：30 ℃，進樣量：10 μL。

表 1 HPLC洗脫條件Table 1 HPLC elution conditions

1.3.6.2 標準溶液的配制

精確稱取0.5 mg的綠原酸、原花青素B2、表兒茶素、金絲桃苷、異槲皮苷標準品溶于1 mL甲醇中，配成混合標準儲備液，再用甲醇依次稀釋成不同質(zhì)量濃度的標準系列溶液。

1.3.6.3 標準曲線的繪制

取1.3.6.2節(jié)中的標準系列溶液過0.22 μm的濾膜，按1.3.6.1節(jié)的色譜條件進行分析。以樣品質(zhì)量濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，以峰面積外標法進行定量。線性關(guān)系如表2所示。

表 2 標準品測定的標準曲線回歸方程Table 2 Linear regression equations for fi ve phenolic standards

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 21.0軟件分析實驗數(shù)據(jù)，Origin 8.5軟件作圖，結(jié)果用±s表示。數(shù)據(jù)差異性采用單因素方差分析中的最小顯著差異法，P＜0.05表示差異具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義。實驗均重復(fù)3 次。

2 結(jié)果與分析

2.1 山楂中多酚、黃酮含量及抗氧化能力

食品中的多酚根據(jù)其存在形態(tài)可分為游離態(tài)和結(jié)合態(tài)多酚，其中游離態(tài)多酚易溶于水或有機溶劑，而結(jié)合態(tài)多酚因與食品基質(zhì)緊密結(jié)合，則需要通過酸、堿或酶水解才能釋放出來[16]。本研究采用體積分數(shù)80%的丙酮溶液，在冰浴高速勻漿條件下進行山楂游離態(tài)多酚的提取，剩余山楂殘渣經(jīng)堿水解后再采用乙酸乙酯進行萃取得到山楂結(jié)合酚。

表 3 山楂中多酚、黃酮含量及ORACTable 3 Contents of polyphenols and fl avonoids and oxygen radical absorbance capacity of hawthorn

如表3所示，山楂中游離酚和結(jié)合酚的含量分別為（3 124.96±41.98）mg/100 g和（32.95±0.92）mg/100 g，游離黃酮和結(jié)合黃酮的含量分別為（1 760.56±79.03）mg/100 g和（25.16±0.33）mg/100 g，由此可看出，山楂中多酚的構(gòu)成以游離酚、游離黃酮為主。研究發(fā)現(xiàn)，不同類

型食品中的多酚形態(tài)及含量存在顯著差異[17]，通常，小麥、玉米等糧谷類食品中的多酚主要以結(jié)合態(tài)的形式存在[11]，而在大多數(shù)水果中則游離酚含量顯著高于結(jié)合酚含量[18-19]，本研究山楂多酚的測定結(jié)果與以往水果多酚的研究結(jié)果一致。山楂多酚的ORAC測定結(jié)果顯示，樣品抗氧化能力與多酚含量成正比，其中游離酚的ORAC明顯高于結(jié)合酚ORAC，占總ORAC的93%，說明山楂游離酚是其抗氧化能力的主要貢獻者。

2.2 體外模擬胃消化過程中山楂多酚、黃酮及抗氧化活性的變化

圖 1 山楂模擬胃消化過程中多酚、黃酮含量及ORAC的變化Fig. 1 Changes in total polyphenol and fl avonoid contents and oxygen radical absorbance capacity of hawthorn during gastric digestion

如圖1所示，模擬胃液組、胃酸對照組和空白對照組之間的多酚、黃酮含量及ORAC無顯著性差異（P＞0.05），不同時間點之間也無顯著性變化（P＞0.05），說明胃蛋白酶和胃酸環(huán)境對山楂中多酚、黃酮的釋放或降解及抗氧化活性均無顯著性影響。這與黑刺李[10]、野櫻莓[20]多酚在胃消化過程中的變化規(guī)律一致，可能是由于黑刺李、野櫻莓與山楂同屬薔薇科，富含有機酸，其多酚類物質(zhì)都以酚酸類（綠原酸、原兒茶酸、咖啡酸等）和原花青素類低聚、高聚物為主，這些多酚在以往研究中已被證實在酸性條件下性質(zhì)較穩(wěn)定，且pH值越低穩(wěn)定性越好[21-22]；因此胃液中的強酸環(huán)境對山楂多酚影響較小，同時其抗氧化活性也無顯著性變化。

2.3 體外模擬腸消化過程中山楂多酚、黃酮及抗氧化活性的變化

圖 2 山楂模擬腸消化過程中多酚、黃酮含量及ORAC的變化Fig. 2 Changes in total polyphenol and fl avonoid contents and oxygen radical absorbance capacity of hawthorn during intestinal digestion

如圖2所示，在體外模擬腸消化中，模擬腸液組的多酚、黃酮含量及ORAC均顯著高于空白對照組（P＜0.05），推測這是因為腸液組中加入的胰酶和膽汁水解了多酚與細胞內(nèi)外蛋白質(zhì)結(jié)合形成的共價鍵、氫鍵等[23-24]，促進了山楂中多酚、黃酮等抗氧化活性物質(zhì)的釋放。與0 h（腸）相比，模擬腸液組山楂多酚、黃酮含量在0.5 h內(nèi)分別下降了16.26%和7.46%，空白對照組分別下降了32.58%和10.29%，0.5 h后趨于穩(wěn)定（P＞0.05）。腸消化過程中多酚、黃酮含量顯著下降的原因可能是山楂多酚類化合物分子結(jié)構(gòu)中多具有酚羥基，偏酸性，在堿性環(huán)境中不穩(wěn)定，易發(fā)生降解生成其他物質(zhì)[25]。其次，2.1節(jié)對山楂多酚形態(tài)的研究結(jié)果表明，山楂中以游離酚為主，在腸道堿性環(huán)境下山楂游離酚大量降解，其降解量大于多酚釋放量；因此腸道中山楂多酚、黃酮含量總體仍表現(xiàn)為下降。

腸道環(huán)境中，山楂抗氧化能力隨著多酚、黃酮含量的下降而降低，模擬腸液組和空白對照組的ORAC在0.5 h內(nèi)分別從714.52 μmol/g下降到641.29 μmol/g和632.06 μmol/g，相應(yīng)降低10.25%和11.54%；1 h時分別繼續(xù)下降到632.06 μmol/g和610.06 μmol/g，1 h后無顯著性變化（P＞0.05）。結(jié)合圖1、2可發(fā)現(xiàn)，在胃腸消化中山楂抗氧化活性與多酚、黃酮含量的變化規(guī)律相似，進一步說明多酚類化合物是山楂抗氧化能力的基礎(chǔ)。

2.4 體外模擬胃腸消化過程中山楂多酚類單體化合物的變化

為進一步探究和明確在胃腸道環(huán)境下山楂多酚中具體成分的變化，本研究結(jié)合文獻[1]的報道，選取了綠原酸、原花青素B2、表兒茶素、金絲桃苷、異槲皮苷等5 種山楂中含量較高的單體酚類化合物作為代表，研究其在胃腸道消化過程中的變化情況。圖3為混合標準品及胃、腸消化0.5 h的HPLC圖。

圖 3 混合標準品、胃腸消化0.5 h山楂樣品的HPLC圖Fig. 3 HPLC chromatograms of mixed standards and hawthorn subjected to 0.5 h of simulated gastrointestinal digestion

如表4所示，在模擬胃消化中，各單體酚類化合物含量在不同時間點無顯著性差異（P＞0.05），說明胃消化對山楂中單體酚無顯著影響。

表 4 胃消化后山楂中酚類單體含量變化Table 4 Changes in contents of individual polyphenols after gastric digestion mg/g

表 5 腸消化后山楂中酚類單體含量變化Table 5 Changes in contents of individual polyphenols after intestinal digestion mg/g

如表5所示，腸消化中山楂不同單體酚類化合物的含量變化規(guī)律不一致。金絲桃苷、異槲皮苷兩者的含量無顯著性變化（P＞0.05），但表兒茶素、原花青素B2和綠原酸含量則均發(fā)生顯著下降，其中表兒茶素降幅最大，在0.5 h內(nèi)完全降解；原花青素B2次之，在0.5 h內(nèi)降低了28.99%，1 h時已無法檢測到；綠原酸在0.5 h內(nèi)下降了40.78%，1 h較0.5 h繼續(xù)降低22.95%，1 h后無顯著性變化（P＞0.05）。

由以上結(jié)果可知，金絲桃苷、異槲皮苷在胃腸消化中均較穩(wěn)定，這可能是因為金絲桃苷和異槲皮苷互為同分異構(gòu)體，在植物體內(nèi)通常以糖苷鍵與糖基結(jié)合成苷類的形式存在，穩(wěn)定性較強，在胃腸環(huán)境下不易分解[26]。

原花青素B2是表兒茶素的二聚體，但目前關(guān)于這兩者在胃腸消化中變化規(guī)律的研究結(jié)果卻各有不同。盛華剛等[27]發(fā)現(xiàn)金蕎麥多酚中原花青素B2和表兒茶素經(jīng)胃消化后含量均明顯增加，而Kahle等[28]關(guān)于蘋果多酚的研究結(jié)果卻顯示原花青素B2在胃消化中含量下降，表兒茶素含量增加，這是原花青素B2在胃液中降解成表兒茶素所致。Kahle等[28]的研究同時還發(fā)現(xiàn)表兒茶素在腸液中會進一步異構(gòu)化生成兒茶素，而在Bouayed[29]和Zhu Qinyan[30]等的研究中卻發(fā)現(xiàn)腸環(huán)境中，原花青素B2含量下降，表兒茶素和兒茶素含量卻沒有相應(yīng)增加，據(jù)此他們認為原花青素B2在腸液中并未分解成表兒茶素，表兒茶素也未轉(zhuǎn)化成兒茶素，而是可能生成了其他化合物。各項研究結(jié)果不一致的原因可能與不同食品中多酚構(gòu)成、性質(zhì)存在差異有關(guān)；此外，多酚之間可能存在的相互作用也是導(dǎo)致胃腸道消化對其影響不同的原因之一。本研究中，原花青素B2和表兒茶素在胃消化后含量并未發(fā)現(xiàn)顯著變化（P＞0.05），在腸消化過程中含量卻均顯著降低（P＜0.05），說明腸道環(huán)境下，兩者發(fā)生了降解，但具體的降解途徑和降解產(chǎn)物還有待進一步確認。

綠原酸是由咖啡酸和奎寧酸縮合形成的酚酸，因此在偏酸性的胃環(huán)境中較穩(wěn)定。但其分子結(jié)構(gòu)中含有酯鍵和不飽和雙鍵等不穩(wěn)定部分，易被堿水解或分子內(nèi)酯基遷移異構(gòu)化生成同分異構(gòu)體新綠原酸和隱綠原酸[31]，故綠原酸在腸液中含量降低。

3 結(jié) 論

山楂中以游離酚為主，結(jié)合酚含量較低。山楂多酚在模擬胃消化中較穩(wěn)定，其總多酚、黃酮含量及抗氧化活性均無顯著性變化，而在腸消化中，山楂多酚不穩(wěn)定，發(fā)生降解，0.5 h時腸液組總多酚、黃酮含量均顯著降低，分別降低了16.26%和7.46%，抗氧化能力下降了10.25%，抗氧化能力下降與多酚含量降低成正比。進一步分析單體酚類化合物在胃腸消化中含量的變化規(guī)律發(fā)現(xiàn)，5 種單體酚在胃消化中含量均無顯著性變化，在腸消化中變化卻不相一致；其中金絲桃苷、異槲皮苷較穩(wěn)定，含量無顯著性變化（P＞0.05），而表兒茶素在0.5 h內(nèi)完全降解，原花青素B2、綠原酸在0.5 h內(nèi)則分別下降了28.99%和40.78%。綜上，經(jīng)胃腸道消化后，山楂總多酚含量下降，伴隨抗氧化能力顯著下降；不同多酚單體因其自身性質(zhì)差異在胃腸道環(huán)境表現(xiàn)出不同的穩(wěn)定性，其降解途徑、代謝產(chǎn)物及各多酚之間是否存在相互作用值得進一步探究。