郭時(shí)印，李 林，周 虹，唐忠海，蘇小軍,，李清明

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128；2.湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所，湖南 長(zhǎng)沙 410125）

糖尿病是一種常見(jiàn)、多發(fā)且與遺傳因素、環(huán)境因素相關(guān)的復(fù)雜疾病，在中國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中屬于“消渴病”的范疇，也是一組由于胰島素分泌缺陷或胰島素作用缺陷，或者兩者兼有而引起的以高血糖代謝為特征的代謝疾病。目前還沒(méi)有能夠有效根治糖尿病的特效藥物，其已經(jīng)成為繼心腦血管疾病和癌癥之后的第三號(hào)殺手和世界三大公共衛(wèi)生難題之一，嚴(yán)重危害人類健康[1]。全世界約有1.51億糖尿病患者，且發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)，其中，2型糖尿病患者約占糖尿病患者總數(shù)的90%，發(fā)病年齡多在40 歲以上，且有年輕化的趨勢(shì)。目前每年約有4 000萬(wàn) 人死于與糖尿病相關(guān)的疾病，占全球總死亡人數(shù)的9%。糖代謝紊亂是糖尿病的重要病理生理學(xué)基礎(chǔ)[2]，也是糖尿病患者血糖失衡的重要原因。調(diào)節(jié)糖代謝、維持血糖平衡是治療糖尿病的一個(gè)重要途徑。治療糖尿病的藥物很多，其雖能快速抑制血糖濃度，但毒副作用較大[3]。因此，尋找和開發(fā)具有降血糖功效的天然產(chǎn)物成為當(dāng)今醫(yī)學(xué)領(lǐng)域和食品領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。

桑葉具有很好的降血糖功能，可以抑制血糖上升，預(yù)防和治療糖尿病[4-10]。日本科學(xué)家曾報(bào)道1-脫氧野尻霉素（1-deoxynojirimycin，DNJ）是桑葉中治療糖尿病的功效物質(zhì)[7]。α-葡萄糖苷酶是一類催化水解葡萄糖基酶的總稱，在碳水化合物消化過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，通過(guò)從底物的非還原性末端依次切開α-1,4糖苷鍵，然后再緩慢水解α-1,6糖苷鍵，將淀粉轉(zhuǎn)化為葡萄糖而被人體吸收[11-13]。DNJ的分子結(jié)構(gòu)類似葡萄糖，能夠競(jìng)爭(zhēng)性抑制α-葡萄糖苷酶的活性，從而降低血糖濃度。但DNJ與α-葡萄糖苷酶通過(guò)什么作用力作用、如何作用、作用的位點(diǎn)在哪里，這些問(wèn)題還不十分清楚。

光譜法具有分析速度快、操作簡(jiǎn)便、靈敏度高等特點(diǎn)，是研究小分子與蛋白質(zhì)之間相互作用的最為典型的方法之一[14-17]。紫外吸收光譜法中，如果蛋白質(zhì)分子與底物結(jié)合之后吸收峰的位置和強(qiáng)度有明顯的差異，則可以認(rèn)為蛋白質(zhì)分子構(gòu)象與未結(jié)合時(shí)相比已經(jīng)發(fā)生變化；熒光光譜法中，具有吸收光子能力的物質(zhì)在特定波長(zhǎng)光（如紫外光）的照射下，吸收熒光光譜后發(fā)生能級(jí)躍遷，可以在瞬間發(fā)射出波長(zhǎng)比激發(fā)光長(zhǎng)的熒光，因此可以利用物質(zhì)的熒光光譜進(jìn)行定性與定量分析，通過(guò)研究小分子和蛋白質(zhì)相互作用前后發(fā)光體光譜信號(hào)（熒光強(qiáng)度、熒光峰的特征波長(zhǎng)）的變化來(lái)研究二者的相互作用。圓二色光譜（circus dichotomy，CD）法能夠在接近生理?xiàng)l件下進(jìn)行低濃度、無(wú)損傷的分析，因此可以借助其進(jìn)行定量分析，確定蛋白質(zhì)主鏈含量及其無(wú)規(guī)卷曲含量等，獲取蛋白質(zhì)主鏈的二級(jí)構(gòu)象信息。CD法在蛋白質(zhì)與酶的立體結(jié)構(gòu)分析中應(yīng)用前景廣泛，是目前解析其變化較好的方法之一。

本研究運(yùn)用紫外光譜法初步分析蛋白質(zhì)分子構(gòu)象，再運(yùn)用熒光光譜法深入探究?jī)烧叩淖饔脵C(jī)制，最后利用CD法對(duì)蛋白質(zhì)分子的變化進(jìn)行定量分析。3 種光譜方法逐步遞進(jìn)，相互補(bǔ)充。聯(lián)合運(yùn)用3 種方法能夠更全面、深入地研究蛋白與分子作用的過(guò)程。同時(shí)，本研究模擬生理?xiàng)l件（pH 6.8），考察DNJ對(duì)α-葡萄糖苷酶二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響以及二者結(jié)合點(diǎn)的部位，探索DNJ與α-葡萄糖苷酶相互作用的猝滅機(jī)理、結(jié)合模式和部位，以期闡明桑葉DNJ提取物體外降血糖的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

川芎由北京同仁堂集團(tuán)公司提供，由西安交通大學(xué)藥學(xué)院生藥教研室鑒定為傘形科植物川芎（Ligusticum chuanxiong Hort.）的干燥根莖。

正己烷（色譜純） 德國(guó)Meker公司；GF254薄層色譜硅膠 青島海洋化工廠；α-葡萄糖苷酶 上海伊卡生物科技有限公司；1-(4-硝基苯基)（1-(4-nitrophenyl)，PNP）（純度≥99%）、1-(4-硝基苯基)-1,2,3-丙三醇（1-(4-nitrophenyl)glycerol，PNPG）（純度≥99%）、磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）、超純水、DNJ（純度98%） 上海金穗生物科技有限公司；所有分離用有機(jī)溶劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

p-Quant酶測(cè)試儀 美國(guó)BioTek公司；天平 德國(guó)Sartorius公司；HZQ.C振蕩器 哈爾濱東明醫(yī)療儀器廠；Delta 320 pH計(jì) 瑞士Mettler-Toledo公司；高速低溫離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf公司；F-4600熒光光度計(jì)日本日立公司；J-815 CD儀 日本Jasco公司。

1.3 方法

1.3.1 DNJ抑制α-葡萄糖苷酶的紫外光譜測(cè)定

α-葡萄糖苷酶與PNPG反應(yīng)生成在堿性環(huán)境下顯黃色的PNP，PNP的吸光度與α-葡萄糖苷酶活力呈正相關(guān)。將0.292 mg/mL DNJ溶液50 μL、0.5 U/μL α-葡萄糖苷酶提取液50 μL、PBS 50 μL以及5 mmol/L PNPG 50 μL混合成200 μL DNJ反應(yīng)液，37 ℃下孵育40 min。取9 個(gè)離心管，第1管中加2 mL PBS作為對(duì)照，在后8 個(gè)離心管中各加1 mL PBS，用移液器吸取1 mL DNJ反應(yīng)液于第2個(gè)離心管中，吹打均勻，然后在第2個(gè)離心管中吸取1 mL溶液于第3個(gè)離心管中，以此類推，最后1 個(gè)離心管棄去1 mL溶液，構(gòu)成不同質(zhì)量濃度溶液。每個(gè)離心管中吸取50 μL溶液，與50 μL α-葡萄糖苷酶溶液一同加于酶標(biāo)板中，再向每個(gè)孔中分別加50 μL PBS，混合均勻，置于37 ℃水浴鍋中孵育20 min。孵育結(jié)束后，向上述孔中加入50 μL 5 mmol/L PNPG反應(yīng)液，置于水浴鍋中反應(yīng)15 min。向每個(gè)孔中加入200 μL 0.2 mol/L Na2CO3溶液終止反應(yīng)。用酶標(biāo)儀在400 nm波長(zhǎng)處測(cè)定OD值[18]。實(shí)驗(yàn)設(shè)置3 個(gè)平行。用公式（1）計(jì)算α-葡萄糖苷酶對(duì)樣品的抑制率。

式中：OD樣品代表不同質(zhì)量濃度的樣品液在400 nm波長(zhǎng)處的OD值；OD空白代表超純水在400 nm波長(zhǎng)處的OD值；OD對(duì)照代表對(duì)照在400 nm波長(zhǎng)處的OD值。

以抑制率為縱坐標(biāo)，樣品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，通過(guò)作圖分析抑制活性曲線，計(jì)算半抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）。

1.3.2 DNJ對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制類型的判斷

取18 個(gè)離心管分成3 組，第1組中分別加入50 μL PBS、50 μL 0.292 mg/mL DNJ溶液、50 μL PNPG溶液；第2組中分別加入50 μL PBS、50 μL 0.195 mg/mL DNJ溶液、50 μL PNPG溶液；第3組中分別加入100 μL PBS、50 μL PNPG溶液作為陽(yáng)性對(duì)照，其中PNPG溶液濃度均分別為0.500、0.625、0.833、1.250、2.500、5.000 mmol/mL。充分振蕩混合均勻后，將離心管置于37 ℃水浴鍋中保溫15 min。然后分別加入50 μL 5 mmol/L PNPG溶液，在37 ℃恒溫水浴鍋中孵育15 min，加入200 μL 0.2 mol/L Na2CO3終止反應(yīng)。吸取200 μL混合液于96 孔板上，用酶標(biāo)儀在400 nm波長(zhǎng)處測(cè)定OD值[18]。實(shí)驗(yàn)設(shè)置3 個(gè)平行。根據(jù)Lineweave-Burk雙倒數(shù)圖判斷抑制類型。

1.3.3 DNJ抑制α-葡萄糖苷酶的熒光光譜分析

分別取0.5 U/μL α-葡萄糖苷酶提取液50 μL和不同濃度（0、0.33×10-4、0.66×10-4、0.99×10-4、1.32×10-4、1.64×10-4、1.96×10-4、2.28×10-4、2.60×10-4、2.91×10-4、3.23×10-4、3.54×10-4mol/L）的DNJ溶液，配成α-葡萄糖苷酶-DNJ混合體系，取200 μL于1 mm熒光池中，設(shè)置激發(fā)波長(zhǎng)為280 nm，激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度均為2.5 nm，在273、298、310 K 3 個(gè)溫度下掃描，得到300～500 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)的熒光光譜[19]。參比溶液為PBS。

1.3.4 DNJ抑制α-葡萄糖苷酶的CD分析

在持續(xù)的氮?dú)饬骱?0 nm/min掃描速度下，分別測(cè)定180～250 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)PBS和DNJ溶液（0、1×10-4、2×10-4、4×10-4mol/L）的CD圖譜[20]，以游離的α-葡萄糖苷酶作為對(duì)照；記錄不同濃度的α-葡萄糖苷酶-DNJ混合體系分別反應(yīng)20、40、60 min的CD圖譜；通過(guò)在線Dichroweb軟件（http://dichroweb.cryst.bbk.ac.uk/html/home.shtml）的SELCON3程序[21]計(jì)算與DNJ結(jié)合前后的α-葡萄糖苷酶二級(jí)結(jié)構(gòu)（α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)卷曲）的含量。

1.4 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)采用Excel 2010軟件分析，繪圖采用Origin 8.0軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫外光譜法分析DNJ與α-葡萄糖苷酶的相互作用

如圖1所示，DNJ對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制活性隨質(zhì)量濃度增大而增加，且呈劑量依賴性。線性回歸分析得到DNJ抑制α-葡萄糖苷酶的IC50為0.297 μg/mL。

圖 1 DNJ抑制α-葡萄糖苷酶活性曲線Fig. 1 Inhibition curve of α-glucosidase by DNJ

圖 2 DNJ與α-葡萄糖苷酶的Lineweave-Burk雙倒數(shù)圖Fig. 2 Lineweaver-Burk plots for α-glucosidase inhibition by DNJ

利用Lineweave-Burk雙倒數(shù)法作圖，如圖2所示，分別對(duì)3 個(gè)不同質(zhì)量濃度DNJ與α-葡萄糖苷酶反應(yīng)相同時(shí)間時(shí)繪制3 條直線?？梢钥闯鲈摲磻?yīng)具有良好的線性關(guān)系。競(jìng)爭(zhēng)性抑制動(dòng)力學(xué)方程中Y軸的交點(diǎn)即為vmax的倒數(shù)。式中：v是反應(yīng)速率/（mol/（L·s））；Km是米氏常數(shù)/（mol/L）；vmax為酶促反應(yīng)的最大速率/（mol/（L·s））；[S]為底物（PNP）濃度/（mol/L）。

由圖2可以看出，在加酶量相同時(shí)，隨著DNJ質(zhì)量濃度的變化，反應(yīng)速率的倒數(shù)與底物濃度的倒數(shù)呈線性關(guān)系，且3 條線焦點(diǎn)在Y軸，說(shuō)明DNJ的質(zhì)量濃度變化不影響反應(yīng)的最大速率，所以抑制類型為競(jìng)爭(zhēng)性抑制。

2.2 熒光光譜法分析DNJ與α-葡萄糖苷酶的相互作用

2.2.1 熒光猝滅光譜

圖 3 不同濃度DNJ存在時(shí)α-葡萄糖苷酶的熒光光譜Fig. 3 Fluorescence spectra of α-glucosidase in the presence of DNJ at different concentrations

DNJ對(duì)α-葡萄糖苷酶有明顯的抑制活性，這意味著DNJ可能結(jié)合到α-葡萄糖苷酶上，為了進(jìn)一步探討DNJ與α-葡萄糖苷酶的相互作用機(jī)制，利用熒光光譜進(jìn)行進(jìn)一步分析。從圖3中可以發(fā)現(xiàn)，α-葡萄糖苷酶由于其蛋白質(zhì)分子中的苯丙酮酸、酪氨酸和色氨酸含有苯環(huán)共軛雙鍵，因此具有光吸收能力。所以α-葡萄糖苷酶在280 nm激發(fā)波長(zhǎng)下，在344 nm波長(zhǎng)處有峰值。隨著DNJ濃度的增大，混合物的熒光強(qiáng)度下降，說(shuō)明在DNJ與α-葡萄糖苷酶之間確實(shí)存在相互作用，且發(fā)生了能量轉(zhuǎn)移，可見(jiàn)DNJ對(duì)α-葡萄糖苷酶有熒光猝滅作用。但混合體系的最大發(fā)射波長(zhǎng)未發(fā)生位移，所以推測(cè)DNJ與α-葡萄糖苷酶所形成的復(fù)合物沒(méi)有熒光特性。

2.2.2 熒光猝滅機(jī)理的確定

熒光猝滅的類型分為動(dòng)態(tài)猝滅與靜態(tài)猝滅。無(wú)論是就能量而言還是就電子而言，靜態(tài)猝滅不會(huì)對(duì)蛋白質(zhì)生理活性或者是結(jié)構(gòu)方面產(chǎn)生明顯影響；而動(dòng)態(tài)猝滅對(duì)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響應(yīng)。熒光猝滅符合Stern-Volmer方程（式（2））。

式中：F0為不加猝滅劑的熒光強(qiáng)度；F為加猝滅劑后的熒光強(qiáng)度；Kq為表觀猝滅常數(shù)/（L/（mol·s））；Ksv為熒光猝滅常數(shù)/（L/mol），反映兩種衰變途徑之間的競(jìng)爭(zhēng)，是雙分子猝滅常數(shù)與單分子衰變速率常數(shù)的比值；τ0為沒(méi)有猝滅劑存在下的熒光分子平均壽命/s，生物大分子熒光壽命一般約為10-8s[22]；[Q]為猝滅劑（DNJ）濃度/（mol/L）。

圖 4 不同溫度下DNJ對(duì)α-葡萄糖苷酶的熒光猝滅Stern-Volmer曲線Fig. 4 Stern-Volmer plots for the fl uorescence quenching of α-glucosidase by DNJ at different temperatures

從圖4可以看出，F(xiàn)0/F與[Q]呈線性關(guān)系，由斜率可以求得Ksv及Kq。已知各種猝滅劑對(duì)生物大分子的最大擴(kuò)散猝滅常數(shù)為2.0×1010L/（mol·s）[14]。如果相互作用體系中Kq大于最大擴(kuò)散猝滅常數(shù)，則其熒光猝滅機(jī)理是相互作用產(chǎn)生了新的化合物從而發(fā)生靜態(tài)猝滅，而非動(dòng)態(tài)猝滅。

表 1 不同溫度下DNJ與α-葡萄糖苷酶作用的相關(guān)參數(shù)Table 1 Reaction kinetic parameters between DNJ and α-glucosidase at different temperatures

從表1中可以看出，隨著溫度的增加，Ksv呈明顯的下降趨勢(shì)，說(shuō)明DNJ對(duì)α-葡萄糖苷酶的熒光猝滅為靜態(tài)猝滅。而從它相對(duì)應(yīng)的Kq可以看出，上述兩者間所產(chǎn)生的基態(tài)復(fù)合物使內(nèi)源熒光猝滅。

2.2.3 結(jié)合常數(shù)及結(jié)合位點(diǎn)數(shù)的確定

結(jié)合常數(shù)（K）與結(jié)合位點(diǎn)數(shù)（n）是小分子與大分子蛋白相互作用的重要定量數(shù)據(jù)。在小分子對(duì)生物大分子的靜態(tài)猝滅過(guò)程中，假設(shè)小分子在生物大分子上有多個(gè)相似且獨(dú)立的結(jié)合位點(diǎn)，則DNJ和α-葡萄糖苷酶相互作用反應(yīng)體系的K和n可以通過(guò)雙對(duì)數(shù)方程（式（3））求得。

本實(shí)驗(yàn)中273、298、310 K 3 個(gè)溫度下相關(guān)系數(shù)（R）均約為1（表1），代表3 條曲線線性良好，呈完全正相關(guān)關(guān)系；K隨著溫度的升高而增加，對(duì)于α-葡萄糖苷酶來(lái)說(shuō)，表明DNJ和它的結(jié)合能力與溫度呈正相關(guān)。在3 個(gè)溫度下，n分別是1.05±0.03、1.03±0.03、1.01±0.03，說(shuō)明DNJ與α-葡萄糖苷酶間僅有一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)。

2.2.4 熱力學(xué)性質(zhì)及作用力的判斷

小分子與酶等生物大分子之間通過(guò)疏水作用、氫鍵、范德華力和靜電引力等結(jié)合。吉布斯自由能變（ΔG）能夠決定小分子與酶的結(jié)合反應(yīng)能否自發(fā)進(jìn)行；ΔG＜0表明反應(yīng)能夠自發(fā)進(jìn)行。小分子與蛋白質(zhì)的作用力類型可以通過(guò)熵變（ΔS）或者焓變（ΔH）的正負(fù)性來(lái)判斷，通過(guò)公式（4）、（5）計(jì)算。

表 2 DNJ與α-葡萄糖苷酶相互作用過(guò)程中的焓變、熵變和自由能變Table 2 Changes in enthalpy, entropy and free energy for DNJ interaction with α-glycosidase

從表2可以看出，ΔG為負(fù)值，表明DNJ與α-葡萄糖苷酶的結(jié)合反應(yīng)是一個(gè)自發(fā)的過(guò)程。298 K時(shí)ΔH和ΔS分別為-（17.56±0.10）kJ/mol和（139.22±0.05）J/（mol·K），這意味著DNJ與α-葡萄糖苷酶的相互作用形成復(fù)合物的過(guò)程是熵驅(qū)動(dòng)的吸熱反應(yīng)，并且靜電吸引力是兩者結(jié)合反應(yīng)的主要驅(qū)動(dòng)力，與劉家琴等[23]的結(jié)果相似。

2.3 CD法分析DNJ與α-葡萄糖苷酶的相互作用

圖 5 DNJ與α-葡萄糖苷酶反應(yīng)的CD圖譜Fig. 5 CD spectra of α-glucosidase with DNJ

CD法揭示了DNJ的加入對(duì)α-葡萄糖苷酶中α-螺旋含量的影響。從圖5中可以發(fā)現(xiàn)，α-葡萄糖苷酶的CD光譜圖有兩個(gè)非常明顯的負(fù)峰，一個(gè)是在222 nm波長(zhǎng)處，另一個(gè)是在是209 nm波長(zhǎng)處。其強(qiáng)度可以反映葡萄糖苷酶中α-螺旋的含量。α-螺旋的含量可以通過(guò)公式（6）、（7）計(jì)算。

式中：θobs是橢圓度/mdeg；n為氨基酸殘基數(shù)（583）；l是比色皿的寬度/mm；Cp是葡萄糖苷酶濃度/（mol/L）；MRE表示氨基酸殘基平均摩爾橢圓度（mean residue ellipticity）/mdeg，MRE209nm為在209 nm處的MRE。

在DNJ濃度不斷增大的情況下，α-葡萄糖苷酶222、209 nm波長(zhǎng)的CD光譜強(qiáng)度有所下降。但從峰形上來(lái)看仍保持原狀。這說(shuō)明α-葡萄糖苷酶的α-螺旋結(jié)構(gòu)含量下降。

表 3 α-葡萄糖苷酶和α-葡萄糖苷酶-DNJ體系的蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)含量Table 3 Percentages of protein secondary structures in α-glucosidase and α-glucosidase-DNJ complex

在對(duì)相關(guān)數(shù)據(jù)深入研究的基礎(chǔ)上，借助于Dechoiwrb網(wǎng)站對(duì)α-葡萄糖苷酶二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行精確計(jì)算。如表3所示，在加入4.1×10-4mol/L DNJ后，其α-螺旋結(jié)構(gòu)含量已經(jīng)下降至30.1%。而此時(shí)β-折疊、β-轉(zhuǎn)角、無(wú)規(guī)卷曲含量都有了不同程度的上升。說(shuō)明在DNJ作用下，α-葡萄糖苷酶構(gòu)象中的二級(jí)結(jié)構(gòu)含量會(huì)發(fā)生變化。且上述構(gòu)象變化可以誘導(dǎo)酶活性口袋的關(guān)閉，這不利于活性位點(diǎn)與底物的相互結(jié)合。

CD法研究發(fā)現(xiàn)，DNJ誘導(dǎo)改變了α-葡萄糖苷酶的構(gòu)象，并使其二級(jí)結(jié)構(gòu)含量發(fā)生變化，α-螺旋含量明顯降低，活性中心口袋關(guān)閉，抑制了α-葡萄糖苷酶對(duì)底物的催化。Peng Xin等[24]通過(guò)CD法測(cè)定也發(fā)現(xiàn)，黃酮類化合物抑制α-葡萄糖苷酶活性的原因是其令α-葡萄糖苷酶的多肽結(jié)構(gòu)部分展開，使其構(gòu)象發(fā)生改變。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)采用紫外光譜法、熒光光譜法和CD法研究蛋白質(zhì)與分子作用的過(guò)程，逐步遞進(jìn)、相互補(bǔ)充；研究了DNJ與α-葡萄糖苷酶的相互作用機(jī)制，得到DNJ與α-葡萄糖苷酶反應(yīng)的IC50為0.297 μg/mL。利用Lineweave-Burk雙倒數(shù)法作圖，分析得到DNJ對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制類型為競(jìng)爭(zhēng)型抑制，這與Yang Zhenzhong等[25]的研究結(jié)果一致。DNJ與α-葡萄糖苷酶反應(yīng)為生成配合物的靜態(tài)猝滅，兩者形成基態(tài)復(fù)合物，使α-葡萄糖苷酶的內(nèi)源熒光猝滅。DNJ與α-葡萄糖苷酶相互作用形成復(fù)合物的過(guò)程是熵驅(qū)動(dòng)的吸熱反應(yīng)，靜電吸引力是兩者結(jié)合反應(yīng)的主要驅(qū)動(dòng)力[26-28]。不同溫度（273、298、310 K）下Ksv分別為1.48×104、1.29×104、1.12×104L/mol。DNJ使α-葡萄糖苷酶的α-螺旋含量降低，二級(jí)結(jié)構(gòu)含量發(fā)生變化。表明DNJ降低α-葡萄糖苷酶活性的機(jī)理是使α-葡萄糖苷酶的構(gòu)象發(fā)生變化，且使二級(jí)結(jié)構(gòu)重新排列；而這種酶構(gòu)象的變化能夠誘導(dǎo)酶活性口袋關(guān)閉，不利于底物結(jié)合到活性位點(diǎn)。