趙悅含，姜夢(mèng)婷，高達(dá)，劉飛，杜鵬，侯俊財(cái)

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室食品學(xué)院，哈爾濱150030）

0 引 言

乳酸菌主要是依靠自身蛋白水解體系來為其菌體提供營養(yǎng)，不能直接利用外源蛋白質(zhì)[1-2]。乳酸菌蛋白水解體系包括胞外酶、轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)和多種胞內(nèi)酶。主要包括以下三步：大分子酪蛋白在胞外蛋白酶的作用下降解成多肽；寡肽轉(zhuǎn)運(yùn)體系將水解后的多肽轉(zhuǎn)運(yùn)至胞內(nèi)；胞內(nèi)肽酶再使轉(zhuǎn)運(yùn)至胞內(nèi)的多肽產(chǎn)生乳酸菌生長所需的各種游離氨基酸和短肽，最終進(jìn)行氨基酸代謝或合成蛋白質(zhì)[3-4]。乳酸菌通過上述的蛋白水解體系逐步將外源蛋白質(zhì)水解成供菌體自身營養(yǎng)和生長所需的肽和小分子游離氨基酸[2]。乳酸菌完全利用胞內(nèi)多肽通常需要肽鏈內(nèi)切酶、氨肽酶、二肽酶和三肽酶這幾種酶協(xié)同作用[1]，且乳酸球菌的蛋白水解能力比乳酸桿菌低，主要是因?yàn)槿樗釛U菌的胞內(nèi)肽酶多且胞內(nèi)肽酶的表達(dá)水平較高[5]。有關(guān)研究表明，不同胞內(nèi)肽酶作用于多肽的不同位點(diǎn)且即使是同一種肽酶作用位點(diǎn)也可能不同[6]。蛋白水解體系中各種關(guān)鍵蛋白酶基因的表達(dá)在不同菌株、同一菌株不同生長階段以及不同的菌體生長環(huán)境都會(huì)有所差異，如氮源含量、氮源種類、培養(yǎng)基的溫度和初始p H等都會(huì)對(duì)關(guān)鍵蛋白酶基因的表達(dá)產(chǎn)生影響?；诖?，本試驗(yàn)選取保加利亞乳桿菌作為研究對(duì)象，分析氮缺乏對(duì)保加利亞乳桿菌胞內(nèi)肽酶基因表達(dá)的影響，為進(jìn)一步深入研究保加利亞乳桿菌生長代謝變化的分子生物學(xué)機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株來源

選用保加利亞乳桿菌（Lactobacillus delbrueckiisubsp.Bulgaricus） LB08006、 LB08007、 LB08012、 L08014、LB08015、LB08016、LB08017作為研究對(duì)象，上述菌株均由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(KLDS)乳酸菌菌種庫提供。

1.2 培養(yǎng)基

培養(yǎng)基的成分詳見表1，使用前需將培養(yǎng)基pH調(diào)至6.2，并于121℃滅菌15 min，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 培養(yǎng)基

1.3 菌株的活化與保存

先將菌株接入MRS液體培養(yǎng)基中活化兩代，培養(yǎng)條件為42℃、16～18 h。而后接入MRS固體培養(yǎng)基中純化，培養(yǎng)24 h后挑取單菌落并接種于MRS液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)12 h，備用。菌株于20%甘油中-80℃保存。

1.4 基因表達(dá)的檢測方法

基因表達(dá)檢測方法采用qRT-PCR技術(shù)，現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用于鑒別乳酸菌以及檢測乳酸菌中基因的表達(dá)差異[7-10]。根據(jù)本試驗(yàn)研究目的采用qRT-PCR技術(shù)并采取熒光染料法進(jìn)行相對(duì)定量分析。

1.5 關(guān)鍵酶基因在不同菌株之間的表達(dá)測定

將7株保加利亞乳桿菌活化兩代后接種于MRS液體培養(yǎng)基（42℃發(fā)酵18 h），再分別提取菌體RNA并檢測其完整性和濃度，而后反轉(zhuǎn)錄為cDNA，再對(duì)樣品進(jìn)行qRT-PCR檢測。

1.6 胞內(nèi)肽酶基因在氮缺乏培養(yǎng)下的表達(dá)測定

將菌株活化兩代后分別接種于MRS液體培養(yǎng)基和氮缺乏液體培養(yǎng)基中42℃發(fā)酵12 h，分別提取菌體RNA并檢測其完整性和濃度，而后反轉(zhuǎn)錄為cDNA，再對(duì)樣品進(jìn)行qRT-PCR檢測。

1.6.1 胞內(nèi)肽酶基因及管家基因的確定

乳酸菌等細(xì)菌在熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)中所使用的管家基因選擇比較普遍且穩(wěn)定性較好的16SrRNA[11-17]。選擇保加利亞乳桿菌蛋白代謝過程中的幾種胞內(nèi)肽酶基因（見表2）作為本試驗(yàn)的目的基因。

1.6.2 PCR引物設(shè)計(jì)與合成

依據(jù)Lactobacillus delbrueckiisubsp.bulgaricusATCC 11842的DNA序列（GenBank accession number:NC_008054.1）中相應(yīng)基因序列，使用primer5.0軟件設(shè)計(jì)基因的引物序列并由上海生工生物技術(shù)有限公司合成16SrRNA，引物詳見表3。

1.6.3 RNA的提取及檢測

使用RNAprep pure培養(yǎng)細(xì)菌總RNA提取試劑盒（天根），按說明分別依次提取在氮缺乏環(huán)境和MRS液體培養(yǎng)的菌株RNA，提取時(shí)所用的槍頭和離心管需要在濃度為1/1 000的DEPC溶液中浸泡過夜，再經(jīng)121℃，30 min高溫高壓的滅菌處理。注意需使用DEPC處理水配置溶液以防止RNA酶污染。

用溴化乙錠（EB）對(duì)樣本進(jìn)行染色，取3μL RNA樣液和2μL的Loadingbuffer于1%瓊脂糖凝膠電泳(150 V，15 min)，經(jīng)CDS8000型凝膠分析系統(tǒng)成像后，觀察16 s和23 s電泳條帶，判斷RNA的完整性。

對(duì)所提取RNA在260 nm、280 nm處的吸光度進(jìn)行測定，判斷RNA的濃度[18]。

1.6.4 反轉(zhuǎn)錄合成cDNA

反轉(zhuǎn)錄使用PrimeScript?RT反轉(zhuǎn)錄試劑盒且所得的cDNA樣本（保存于-20℃）用于qRT-PCR檢測。

表2 實(shí)時(shí)定量PCR的目的基因

表3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物

表4 RT反應(yīng)液成分

利用得到的cDNA以及合成的引物先進(jìn)行普通PCR試驗(yàn)，而后進(jìn)行凝膠電泳觀察擴(kuò)增產(chǎn)物的條帶的大小和亮度，確保RNA提取成功以及引物特異性完好。

1.6.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

使用SYBR?Premix Ex TaqTM試劑盒（Takara公司）配置PCR反應(yīng)液，使用ABI 7500 Fast Real-Time PCR System進(jìn)行qRT-PCR試驗(yàn)，反應(yīng)體系及方法參照杜越歐和侯俊財(cái)?shù)姆椒╗19]。

1.7 數(shù)據(jù)處理與分析

本研究采用2-△△CT法評(píng)估目的基因的相對(duì)表達(dá)量[16,19]。先用Excel對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行初步整理，而后的方差分析采用SPSS（11.5）軟件進(jìn)行整理，P＜0.05為差異顯著。

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 RNA的純度及完整性

試驗(yàn)得到的RNA樣品經(jīng)電泳分析結(jié)果如圖1所示，由圖可見完整的23S條帶和16S條帶，這表明RNA的降解程度很小且樣品的質(zhì)量完好。經(jīng)檢測所得的OD260／OD280的數(shù)據(jù)比值均在1.8～2.0之間，這表明RNA純度較高。同時(shí)，如果RNA樣品被基因組DNA污染也會(huì)造成后續(xù)PCR實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增，導(dǎo)致RNA的表達(dá)量高于實(shí)際量，本實(shí)驗(yàn)在總RNA提取試劑盒中配備了DNA酶（DNase I），有效的取出了基因組DNA。經(jīng)以上檢測可知實(shí)驗(yàn)中所得的RNA樣品可用來進(jìn)行后續(xù)的實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)。提取的RNA樣品經(jīng)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA后，先要經(jīng)過普通PCR試驗(yàn)，通過凝膠電泳觀察到條帶亮度適宜、無雜帶且大小與目的基因相符，由此證明反轉(zhuǎn)錄過程中沒有污染且引物特異性良好。

圖1 RNA樣品電泳圖

2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果

各樣本cDNA經(jīng)實(shí)時(shí)熒光定量PCR試驗(yàn)所得目的基因以及管家基因的熔解曲線，見圖2。由圖可見曲線均呈現(xiàn)出單一峰，由此能夠排除實(shí)驗(yàn)過程中形成引物二聚體和非特異產(chǎn)物對(duì)試驗(yàn)結(jié)果所產(chǎn)生的的影響，且引物的特異性良好。

以循環(huán)圈數(shù)為橫坐標(biāo)，熒光強(qiáng)度變化值為縱坐標(biāo)繪制擴(kuò)增曲線，經(jīng)qRT-PCR試驗(yàn)得的擴(kuò)增曲線見圖3，可以看出管家基因和各目的基因的擴(kuò)增效率較高，穩(wěn)定性和CT值的重復(fù)性較好，得到的CT值可用于分析試驗(yàn)結(jié)果。

圖2 管家基因和目的基因PCR產(chǎn)物的熔解曲線

2.3 不同菌株之間關(guān)鍵酶基因的表達(dá)情況分析

不同菌株間胞內(nèi)肽酶基因的表達(dá)情況見圖4，并將菌株LB08006作為參照菌株。與參照菌株相比其他6株菌中的PepC、PepF、PepQ這三種目的基因的表達(dá)量均下降，其中前兩種基因在菌株LB08007中表達(dá)量最低，PepQ基因在菌株LB08012中的表達(dá)量最低。PepT基因在菌株LB08007、LB08014和LB08015中的表達(dá)量上調(diào)，但是與參照菌株相比其上調(diào)幅度不顯著，并且在其他菌株中該基因的表達(dá)量下降。PepX基因在菌株LB08014中的表達(dá)量顯著上升（P＜0.05），在其他五株菌中表達(dá)量均顯著下降且在菌株LB08015中下降幅度最大。

圖4 不同菌株之間目的基因的表達(dá)情況

2.4 氮缺乏對(duì)各目的基因表達(dá)的影響

2.4.1 氮缺乏對(duì)PepC基因的表達(dá)的影響

氮缺乏對(duì)pepC基因的表達(dá)的影響見圖5。氮缺乏培養(yǎng)條件下的pepC基因表達(dá)水平呈顯著下調(diào)趨勢(shì)（P＜0.05），平均下降了2.8倍，其中菌株LB08006下降最少，菌株LB08007、LB08016和LB08017下降幅度較大。

圖5 氮缺乏培養(yǎng)下pep C基因表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化

2.4.2 氮缺乏對(duì)pepF基因的表達(dá)的影響

氮缺乏對(duì)pepF基因的表達(dá)的影響見圖6。氮缺乏培養(yǎng)條件下的pepF基因表達(dá)量顯著上調(diào)（P＜0.05），平均上調(diào)3.2倍，其中菌株LB08006、LB08014和LB08015的上調(diào)幅度較大，而菌株LB08012的上調(diào)幅度是最小的。

圖6 氮缺乏培養(yǎng)下pep F基因表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化

2.4.3 氮缺乏對(duì)pepQ基因的表達(dá)的影響

氮缺乏對(duì)pepQ基因的表達(dá)的影響見圖7。在氮缺乏培養(yǎng)條件下，菌株LB08006、LB08007和LB08015中的pepQ基因表達(dá)量顯著上升（P＜0.05），平均上調(diào)2.6倍；而在其他4株菌中顯著下調(diào)（P＜0.05），平均下調(diào)1.7倍。

圖7 氮缺乏培養(yǎng)下pep Q基因表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化

2.4.4 氮缺乏對(duì)pepX基因的表達(dá)的影響

氮缺乏對(duì)pepX基因的表達(dá)的影響見圖8，7株菌中的pepX基因的表達(dá)均呈顯著下調(diào)趨勢(shì)（P＜0.05），平均下調(diào)1.8倍。其中菌株LB08012和LB08016下調(diào)幅度較大。

圖8 氮缺乏培養(yǎng)下pep X基因表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化

2.4.5 氮缺乏對(duì)pepT基因的表達(dá)的影響

氮缺乏對(duì)pepT基因的表達(dá)的影響見圖9。在氮缺乏培養(yǎng)條件時(shí)，菌株LB08006、LB08007和LB08015中的pepT基因表達(dá)量顯著上升（P＜0.05），平均上調(diào)了1.4倍 ；而 在 菌 株 LB08012、LB08014、LB08016、LB08017中顯著下降（P＜0.05），平均下調(diào)了2.6倍。

圖9 氮缺乏培養(yǎng)下pep T基因表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化

3 討 論

目前對(duì)乳酸乳球菌的蛋白水解系統(tǒng)已經(jīng)進(jìn)行了一系列的研究，對(duì)參與酪蛋白降解、寡肽的利用以及一些肽的分解路徑有了深入的了解[20]。保加利亞乳桿菌蛋白水解體系中關(guān)鍵肽酶基因的表達(dá)不僅僅與菌株差異有關(guān)，還會(huì)受到其他因素影響，如pH[21-22]、菌株生長階段[23]、培養(yǎng)溫度[24]等。雖然關(guān)于瑞士乳桿菌和保加利亞乳桿菌的研究也有一定的進(jìn)展，但是還有許多問題沒有探明，尤其是菌株間胞內(nèi)肽酶基因表達(dá)差異及氮環(huán)境對(duì)菌株胞內(nèi)肽酶基因表達(dá)影響還未涉及。

本試驗(yàn)結(jié)果表明，胞內(nèi)肽酶基因的表達(dá)水平在不同菌株之間差異顯著，這與呂加平等[25]研究結(jié)果一致，主要是因?yàn)榫觊g的差異性，但規(guī)律性不強(qiáng)，足以說明胞內(nèi)肽酶基因表達(dá)情況不僅受菌體自身影響還會(huì)受到外界因素影響。在進(jìn)行乳酸菌培養(yǎng)時(shí)，氮源供給量對(duì)于菌體蛋白水解體系中胞內(nèi)肽酶基因的表達(dá)是一個(gè)限制性因素，氮缺乏對(duì)胞內(nèi)肽酶基因表達(dá)產(chǎn)生影響。Guédon等[3]詳細(xì)分析了不同環(huán)境中Lactococcus lactisMG1363蛋白水解體系16個(gè)基因的表達(dá)變化，研究發(fā)現(xiàn)表達(dá)水平較高的蛋白水解酶基因受氮源的影響，表達(dá)水平較低的基因不受肽供應(yīng)的影響，本試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)氮缺乏環(huán)境下各胞內(nèi)肽酶基因的表達(dá)量的表達(dá)情況因菌株不同而不同，這正如Guédon等認(rèn)為的受菌株自身的生物學(xué)特性影響。除了pepC和pepX基因，其他三個(gè)目的基因的表達(dá)量在氮缺乏培養(yǎng)時(shí)均顯著升高（P＜0.05），這與Vermeulen等[7]研究結(jié)果一致，Lactobacillus sanfranciscensisDSM 20451T在面團(tuán)中生長至對(duì)數(shù)期時(shí)，oppF、dtpT和pepT三個(gè)基因的表達(dá)量與添加肽的面團(tuán)基因表達(dá)相比，基因的表達(dá)量都在未添加肽的面團(tuán)中最高。這種情況可能是因?yàn)槔业鞍纂撕痛蠖沟鞍纂酥泻腥樗峋L所需的各種氨基酸、寡肽及生長因子等。菌體在生長初期利用這些氮源大量繁殖，使游離氨基酸和短肽大量積累，縮短菌體進(jìn)入對(duì)數(shù)期所用的時(shí)間，使其提前進(jìn)入穩(wěn)定期。但與方芳等研究結(jié)果有所不同，研究發(fā)現(xiàn)有機(jī)復(fù)合氮源能夠促進(jìn)菌體的生長，為菌體提供多種營養(yǎng)物質(zhì)且產(chǎn)酶活力高，而在無機(jī)氮源培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)菌體生長緩慢[26]，主要原因是無機(jī)氮源使培養(yǎng)基pH值過低、氮源缺乏，從而抑制乳酸菌生長。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)結(jié)果表明，氮缺乏培養(yǎng)條件下，pepF基因表達(dá)量比MRS液體培養(yǎng)條件下顯著上調(diào)（P＜0.05），平均上調(diào)3.2倍，而pepX和pepC基因表達(dá)水平呈顯著下調(diào)趨勢(shì)（P＜0.05）；氮缺乏培養(yǎng)條件下，菌株LB08006、LB08007和LB08015中pepT和pepQ基因表達(dá)量上調(diào)，而在菌株 LB08012、L08014、LB08016和LB08017pepT和pepQ基因表達(dá)量則是下調(diào)的。因此，氮缺乏可顯著影響保加利亞乳桿菌胞內(nèi)關(guān)鍵肽酶基因的表達(dá)，且在不同菌株間表現(xiàn)出不同的表達(dá)量,培養(yǎng)基中氮源的供給是保加利亞乳桿菌的胞內(nèi)肽酶基因表達(dá)限制性因素之一。