王燕，王發(fā)美，張秀苑，白雪，賀紅軍

（煙臺大學生命科學學院，山東煙臺264005）

0 引 言

鼠李糖乳桿菌、瑞士乳桿菌作為應用最為廣泛的益生菌，其產(chǎn)品在美國、芬蘭、德國、澳大利亞、日本等30多個國家、地區(qū)廣泛分布[1]。這兩株菌能夠耐酸性以及膽鹽等，并且在腸道定殖能力強，能夠抑制有害菌侵入，結合并排除毒素、預防齲齒、預防和治療腹瀉、改善免疫系統(tǒng)，加速感染后的恢復，預防和治療過敏等作用[2]。鼠李糖乳桿菌和瑞士乳桿菌混合培養(yǎng)，瑞士乳桿菌對培養(yǎng)基中的蛋白的代謝能力較強，通過胞外蛋白水解酶將蛋白水解成小分子多肽和氨基酸[3-5]，鼠李糖乳桿菌具有較強的耐酸性，并能夠利用多肽及氨基酸，因此當兩株菌混合培養(yǎng)時，利用兩株菌細胞代謝差異性，提高兩株菌的存活率。本文在兩株菌混合培養(yǎng)的基礎上以MRS為基礎對碳源、氮源進行優(yōu)化，并通過真空冷凍干燥技術制備凍干菌粉，為工業(yè)化生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要儀器

SW-CJ-2FD潔凈工作臺，752N紫外可見分光光度計，BPX-272電熱恒溫培養(yǎng)箱，梅特勒FE20 pH計，MLS-3780高壓蒸汽滅菌器，eppendorf-5810高速冷凍離心機，真空冷凍干燥機。

1.2 菌種

瑞士乳桿菌、鼠李糖乳桿菌均由中國科學院煙臺海岸帶研究所分離篩選，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC），保藏號分別為QC-1 CCTCC M 2015539，QC-2 CCTCC M 2015540。

1.3 培養(yǎng)基

MRS培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，葡萄糖20 g，酵母浸膏5 g，乙酸鈉 5 g，檸檬酸氫二銨 2 g，牛肉膏 10 g，吐溫-80 1 mL，K2HPO42 g，MnSO4·4H2O 0.25 g，蒸餾水1 000 mL，pH=6.8，瓊脂15 g。

1.4 方法

1.4.1 菌種的活化

將-80℃下甘油保存的瑞士乳桿菌和鼠李糖乳桿菌在無菌操作下分別接種于液態(tài)MRS培養(yǎng)基中，后置37℃恒溫箱中培養(yǎng)12 h后，對發(fā)酵后的菌液進行分離、純化，反復活化3～4代，進行種子液制備[5-6]。

1.4.2 活菌計數(shù)的測定

本文所選用的活菌計數(shù)法為同種細菌菌液的吸光度(Abs)在一定范圍內(nèi)與菌體數(shù)量呈正比關系以及系數(shù)涂布平板計數(shù)法進行活菌計數(shù)。采用紫外可見分光光度計測定瑞士乳桿菌和鼠李糖乳桿菌混合發(fā)酵液的吸光度值。

1.4.3 碳源的優(yōu)化

將MRS液體培養(yǎng)基中的主要碳源（葡萄糖）去掉，其他成分不變[6]，分別取質(zhì)量分數(shù)為2%的葡萄糖、麥芽糖、乳糖、果糖、乳糖∶葡萄糖=1∶1、葡萄糖∶麥芽糖=1∶1。并以瑞士乳桿菌和鼠李糖乳桿菌6%的接種量，接種比例為瑞士乳桿菌∶鼠李糖乳桿菌=1∶2，且瑞士乳桿菌要早于鼠李糖乳桿菌3 h進行接種，在37℃下培養(yǎng)24 h[6-8]。同時設空白對照。

1.4.4 有機氮源的優(yōu)化

將MRS液體培養(yǎng)基中的有機氮源（蛋白胨）去掉，其他成分不變，分別取質(zhì)量分數(shù)為1%的大豆蛋白胨、蛋白胨、胰蛋白胨、酪蛋白胨作為氮源。培養(yǎng)條件同1.4.3，同時設空白對照[8-11]。

1.4.5 凍干離心條件的優(yōu)化

在無菌環(huán)境下，將發(fā)酵液菌體移入50 mL無菌離心管中，配平，利用冷凍離心機（4℃）對菌液進行離心，設置不同轉速（4 000 r/min、6 000 r/min、8 000 r/min、10 000 r/min），不同的時間（10 min、15 min）下進行離心，離心后所得的上層菌液倒入無菌瓶中，使用滅菌處理后的0.85%的生理鹽水洗滌沉淀2～3次，并稀釋沉淀到原體積，混合均勻，測定活菌數(shù)，并計算離心損失率和存活率，得出活菌收得率的最佳離心條件[12]。

離心損失率（%）=（初始活菌數(shù)-沉淀中活菌數(shù)）/初始活菌數(shù)×100%

離心收得率（%）=（沉淀中活菌數(shù)/初始活菌數(shù)）×100%

1.4.6 凍干保護劑的優(yōu)化

冷凍干燥過程中對凍干保護劑的種類以及添加量進行優(yōu)化，向菌泥中分別添加無菌的脫脂奶粉(4%、8%、12%、16%)、海藻糖(2%、4%、6%、8%)、甘油（2%、4%、6%、8%）、L-谷氨酸鈉（0.5%、1%、1.5%、2%）、β-環(huán)糊精（4%、8%、12%、16%）、蔗糖（3%、6%、9%、12%），菌泥與無菌保護劑以1∶3的比例進行混合，將混合均勻的樣品進行凍干前預凍處理，將樣品放置于-80℃下預凍3 h，使樣品中的水分以固態(tài)的形式存在，并將預凍后的樣品放置于真空冷凍干燥機進行冷凍干燥[13]。

2 結果與討論

2.1 碳源的優(yōu)化結果

在不含碳源的MRS培養(yǎng)基中分別加入質(zhì)量分數(shù)為2%的葡萄糖、麥芽糖、乳糖、果糖、乳糖：葡萄糖=1∶1、葡萄糖∶麥芽糖=1∶1，其他因素不變的條件下，在37℃下培養(yǎng)24 h，結果如圖1所示。

如圖1所示，兩株菌在含有不同的碳源的MRS培養(yǎng)基中，培養(yǎng)24 h小時后，菌液的吸光值存在差異，瑞士乳桿菌和鼠李糖乳桿菌在以麥芽糖為碳源的培養(yǎng)基中生長的最好，其次是葡萄糖，而在以乳糖、混合糖（乳糖∶葡萄糖=1∶1、麥芽糖∶葡萄糖=1∶1）為碳源的培養(yǎng)基中則生長相對于緩慢，因此選擇麥芽糖為增菌培養(yǎng)基的碳源。

2.2 氮源的優(yōu)化結果

在不含有機氮源的MRS培養(yǎng)基中分別加入1%的大豆蛋白胨、蛋白胨、胰蛋白胨、酪蛋白胨，其他因素不變的條件下，在37℃下培養(yǎng)24 h，結果如圖2所示。

圖2 氮源對瑞士乳桿菌和鼠李糖乳桿菌生長的影響

如圖2所示，在不同種類的蛋白胨培養(yǎng)條件下時兩株菌吸光值（OD600）存在差異，大豆蛋白胨為有機氮源時，吸光值（OD600）明顯高于蛋白胨、胰蛋白胨及酪蛋白胨，大豆蛋白胨因含有豐富的氨基酸和生長因子等營養(yǎng)物質(zhì)，因此添加大豆蛋白胨有利于菌體生長，所以增菌培養(yǎng)基的有機氮源為大豆蛋白胨。

2.3 離心條件對菌體存活率的影響

離心速度以及離心時間對于菌體的存活率有很大的影響，實驗主要對離心速度以及離心時間進行了比較，通過離心前和離心后的菌種的存活率的大小進行比較，得出最適的離心時間以及離心速度[14]。

圖3 離心條件對兩株菌離心效果的影響

由圖3可知，隨著離心速度的增加兩株菌的離心收得率降低，同時在相同的轉速不同的時間下菌株的存活率也相差很大，在離心轉速為6 000 r/min，時間為15 min時菌株的離心收得率最高，而在10 000 r/min，離心時間為15 min時菌株的離心收得率最小，菌株在這種長時間以及高轉速的環(huán)境中容易發(fā)生細胞的破碎，進而影響了它的存活率，因此選擇離心轉為6 000 r/min，離心時間15 min對菌液進行離心。

2.4 凍干保護劑的篩選

冷凍干燥過程中菌泥中分別添加無菌的凍干保護劑的種類及添加量分別為，脫脂奶粉(4%、8%、12%、16%)、海藻糖(2%、4%、6%、8%)、甘油（2%、4%、6%、8%）、L-谷氨酸鈉（0.5%、1%、1.5%、2%）、β-環(huán)糊精（4%、8%、12%、16%）、蔗糖（3%、6%、9%、12%）進行冷凍干燥，將凍干后的菌粉進行同體積復水，稀釋涂板計數(shù)，求得凍干后的活菌數(shù)以及菌的凍干存活率，如圖4所示。

圖4 不同凍干保護劑對瑞士乳桿菌和鼠李糖乳桿菌凍干存活率的影響

由圖4可知，以脫脂奶粉、海藻糖、甘油作為保護劑時兩株菌的凍干存活率最高，說明在凍干過程中，細胞損傷較小，保護效果較好。因此選取脫脂奶粉(4%、8%、12%、16%)、海藻糖(2%、4%、6%、8%)、甘油（2%、4%、6%、8%）作為兩株混合菌的凍干保護劑[15-17]。

2.4.1 凍干保護劑的交互作用研究

通過Box-Behnken中心組合設計實驗方案，確定因素水平及編碼見表1，并按照表所給方案完成17組實驗，結果如表2所示。

表1 Box-Behnken實驗設計因素水平及編碼表

表2 Box-Behnken實驗設計方案及結果

將表2數(shù)據(jù)利用Design Expert.8.0.5軟件進行二次多元回歸擬合得到模型的二次多項回歸方程如下：

活菌數(shù)=+7.62+0.13A+0.014B+0.11C+0.095AB+0.068AC-0.14BC-0.20A2-0.27B2-0.21C2

為檢驗方程的有效性，對兩株菌凍干后活菌數(shù)的數(shù)學模型進行統(tǒng)計分析，得到的方差分析結果，結果如表3所示。

P＞0.10，說明模型或考察因素影響不顯著；P＜0.05說明模型影響顯著；P＜0.01說明模型影響極顯著。從表3可以看出，根據(jù)回歸方差分析顯著性的檢驗，回歸模型顯著性檢驗P＜0.01，說明該模型的預測性良好；并且失擬項P值為0.1192（P＞0.10），說明實驗的誤差較小，回歸方程與實際情況吻合程度較高，因此，可用此回歸方程來代替實驗中真實點對實驗結果的預測。一次項中A的偏回歸系數(shù)顯著（P＜0.05），說明脫脂奶粉對兩株菌凍干存活率有顯著影響。從分析中可以看出一次項A、C差異均達到極顯著水平。在所確定的試驗水平范圍內(nèi)，各因素對響應值的影響程度順序為：A＞C＞B，即脫脂奶粉＞甘油＞海藻糖。3個因素中，海藻糖和甘油之間有極顯著的交互作用。交互項AC的偏回歸系數(shù)不顯著（P＞0.10），說明脫脂奶粉與甘油的交互作用對兩株菌凍干存活率沒有顯著影響。二次項A2、B2、C2偏回歸系數(shù)均顯著，說明其對兩株菌凍干存活率的影響均極顯著（P＜0.01）。

表3 以兩株混合菌的活菌數(shù)為響應值的回歸模型方差分析

表4 方程相關系數(shù)

由表4可知決定系數(shù)R2＝0.9718，校正決定系數(shù)R2Adj＝0.9356，說明該模型擬合度較好；信噪比較大說明模型有較高的可信度；變異系數(shù)CV=0.45%＜5%，說明方程的重現(xiàn)性較好。這表明該模型自變量與指標值之間的線性關系顯著，模型與實際實驗的擬合性較好。因此，能夠用此模型預測響應值隨自變量的變化規(guī)律。

2.4.2 響應面分析

根據(jù)軟件分析結果得出二次多項回歸方程，做出三維立體響應面圖，預測上述三個因素對兩株菌冷凍干燥時菌得凍干存活率的影響。

圖5 海藻糖和脫脂奶粉對兩株菌凍干存活率的影響

如圖5可知，隨著脫脂奶粉添加量的增加，活菌數(shù)呈現(xiàn)出先增加后減少的趨勢，而隨著海藻糖添加量的增加，活菌數(shù)呈現(xiàn)緩慢增加的趨勢，其中海藻糖添加量相對于茶多酚的添加量對活菌的影響不顯著。由等高線圖可以看出，等高線接近于橢圓，表明它們的交互作用顯著，這與表3的結果一致。

由圖6可知，在研究范圍內(nèi)，活菌數(shù)隨著甘油和脫脂奶粉添加量的增加而增加，一定程度后開始減少。其中在凍干保護中甘油的添加量相對于脫脂奶粉的添加量的影響不顯著，前者增大或減少的趨勢不如后者明顯。由等高線圖可以看出，等高線接近于圓，表明它們的交互作用不顯著，這與表3的結果一致。

圖6 脫脂奶粉和甘油對兩株菌凍干存活率的影響

圖7 海藻糖和甘油對兩株菌凍干后活菌數(shù)的影響

由圖7可知，在研究范圍內(nèi)，隨著海藻糖和甘油添加量的增加活菌數(shù)前期增加，后期減小。其中在海藻糖的添加量相對于甘油的添加量對活菌數(shù)的影響不顯著，前者增大或者減少的趨勢不如后者明顯。由等高線圖可以看出，等高線接近于橢圓，交互作用顯著，這與表3的結果一致。

采用中心組合實驗原理設計實驗，得出了二次多元回歸方程，對于方程求解得出的凍干保護劑的最佳組合為：脫脂奶粉添加量為14%、海藻糖添加量為6%、甘油添加量為4%。因最佳工藝條件不在表中，故需進一步的驗證實驗。在對兩株菌進行冷凍干燥過程中，脫脂奶粉添加量為14%、海藻糖添加量為6%、甘油添加量為4%的凍干保護劑作用下兩株菌的活菌數(shù)最高[18-19]，活菌數(shù)約為5.9×109cfu/mL，因此確定凍干保護劑的最佳組合為脫脂奶粉添加量為14%、海藻糖添加量為6%、甘油添加量為4%。

3 結論

本實驗研究在MRS培養(yǎng)基的基礎上對碳源、氮源的進行優(yōu)化，提高混合菌株的存活率；對培養(yǎng)后的菌液進行真空冷凍干燥，并對凍干過程中離心條件以及凍干保護劑進行優(yōu)化。實驗結果表明，兩株菌在MRS培養(yǎng)基的碳源為麥芽糖，有機氮源為大豆蛋白胨，其他條件不變的情況下混合菌的存活率提高，通過真空冷凍干燥技術制備的凍干菌粉的活菌存活率高，可應用與食品、飼料等行業(yè)[20]，同時也為工業(yè)化益生菌凍干菌粉制備提供理論依據(jù)。