張媛彥， 肖云峰， 李文妍， 郭 娜， 王玉華?

（1.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010110；2.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)新藥安全評(píng)價(jià)研究中心，內(nèi)蒙古呼和浩特010110；3.內(nèi)蒙古自治區(qū)人民醫(yī)院，內(nèi)蒙古呼和浩特010110）

肉豆蔻-8散由沉香、肉豆蔻、丁香、廣棗、木香、旋覆花、阿魏、牦牛心8味藥材組成，最早收錄于 《普濟(jì)方集》中，具有鎮(zhèn) “赫依”、止痛、溫胃、祛 “巴達(dá)干”、燥“協(xié)日烏素”功效，臨床主要用于治療心 “赫依”熱、心煩、氣短、失眠、心供血不足、心區(qū)疼痛、風(fēng)濕性心臟病［1］。

現(xiàn)代研究表明，三磷酸腺苷、二磷酸腺苷、一磷酸腺苷含有量與改善心肌缺氧和能量代謝有關(guān)，其中三磷酸腺苷是心肌組織維持正常生命活動(dòng)所必需的能量物質(zhì)，而二磷酸腺苷、一磷酸腺苷是三磷酸腺苷降解產(chǎn)物，心肌組織內(nèi)三者含有量變化可直接反映心肌能量代謝水平［2-3］。本實(shí)驗(yàn)采用HPLC法測(cè)定大鼠心肌組織中三磷酸腺苷、二磷酸腺苷、一磷酸腺苷的含有量［4-6］，以探討肉豆蔻-8散與改善能量代謝的關(guān)系，以及該方抗心肌缺血再灌注損傷的作用機(jī)制。

1 材料

1.1 試藥 肉豆蔻-8散 （內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，批號(hào)201705）。復(fù)方丹參滴丸 （天士力制藥集團(tuán)股份有限公司，批號(hào) 140822）。 5′-三磷酸腺苷鈉鹽 （批號(hào) SLBQ6014V）、5′-一磷酸腺苷鈉鹽 （批號(hào)BCBT3249） （美國(guó)Sigma公司）；5′-二磷酸腺苷 （上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)M04A6Y2139）；水合氯醛 （國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)20151217）。甲醇為色譜純；KH2PO4、NaOH、KOH、HClO4均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 動(dòng)物 雄性Wistar大鼠60只，體質(zhì)量250～280 g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK （京）2014-0001。

1.3 儀器 生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng) （成都泰盟科技有限公司，型號(hào)BL-420S）；小動(dòng)物呼吸機(jī) （上海玉研科學(xué)儀器有限公司，型號(hào)V-100）；高速冷凍離心機(jī) （長(zhǎng)沙湘智離心機(jī)儀器有限公司，型號(hào)3H16R1）；高效液相色譜儀 ［賽默飛世爾科技 （中國(guó)）有限公司，型號(hào)Ultimate 3000］；電子天平（奧豪斯儀器有限公司，型號(hào) DV215CD）；旋渦混合器（美國(guó)Scientific Industries公司，型號(hào)Vortex-Genie 2）；高端超純水系統(tǒng) （美國(guó)艾科浦國(guó)際有限公司，型號(hào)ALH-6000-U）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Thermo Hypersil C18色譜柱 （250 mm×4.6 mm， 5 μm）； 流動(dòng)相甲醇-50 mmol／L 磷酸鉀緩沖液（pH 6.68） （7∶93）；柱溫25℃；UV檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)259 nm；體積流量1.0 mL／min；進(jìn)樣量10 μL。色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 各成分HPLC色譜圖

2.2 對(duì)照品溶液制備 精密稱(chēng)取三磷酸腺苷、二磷酸腺苷、一磷酸腺苷對(duì)照品適量，置于10 mL量瓶中，超純水稀釋至刻度，搖勻，制成質(zhì)量濃度分別為1.012、1.060、4.160 mg／mL的溶液，即得，4℃下避光保存。

2.3 樣品制備 于液氮中取出凍存的心肌組織，稱(chēng)取約100 mg置于研缽中， 加入300 μL 0.4 mol／L預(yù)冷 HClO4溶液勻漿，0℃下 3 500 r／min離心 10 min，取上清液，1 mol／L KOH調(diào) pH至6.5左右，0℃下3 500 r／min離心10 min，取上清液，0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，即得。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 通過(guò)SPSS 22.0軟件進(jìn)行處理，數(shù)據(jù)用（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 線性關(guān)系考察 精密吸取三磷酸腺苷、一磷酸腺苷對(duì)照品溶液 5、 10、 20、 40、 80、 160、 320 μL， 二磷酸腺苷對(duì)照品溶液 10、 20、 40、 80、 160、 320、 640 μL于量瓶中，超純水定容至2 mL，制成7個(gè)質(zhì)量濃度，在 “2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定。以峰面積為縱坐標(biāo) （Y），對(duì)照品溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo) （X）進(jìn)行回歸，結(jié)果見(jiàn)表1，可知各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表1 各成分線性關(guān)系

2.5.2 精密度試驗(yàn) 取 “2.5.1”項(xiàng)下溶液，在 “2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定5次，連續(xù)5 d，測(cè)得三磷酸腺苷、二磷酸腺苷、一磷酸腺苷日內(nèi)精密度RSD分別為0.13%、0.07%、0.12%，日間精密度RSD分別為8.68%、2.32%、0.81%，表明該方法符合生物樣品分析要求。

2.5.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 稱(chēng)取心肌組織約100 mg，按 “2.3”項(xiàng)下方法制備樣品， 于0、4、8、12、24 h在 “2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得三磷酸腺苷、二磷酸腺苷、一磷酸腺苷在室溫下峰面積 RSD分別為9.48%、3.08%、0.83%，冷藏下峰面積RSD分別8.81%、2.31%、0.54%，表明樣品在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5.4 加樣回收率試驗(yàn)［4］向三磷酸腺苷、二磷酸腺苷、一磷酸腺苷含有量已知的大鼠心肌勻漿樣品中加入相應(yīng)對(duì)照品，配制成低、中、高3個(gè)質(zhì)量濃度，平行3份，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 各成分加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果 （n＝9）

2.6 分組及給藥 60只大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、陽(yáng)性藥組及肉豆蔻-8散高、中、低劑量組，每組10只。假手術(shù)組、模型組均給予0.5%羧甲基纖維素鈉溶液，肉豆蔻-8散高、中、低劑量組分別給予21.6、10.8、5.4 mg／kg相應(yīng)羧甲基纖維素鈉混懸液，陽(yáng)性藥組給予0.729 mg／kg復(fù)方丹參滴丸羧甲基纖維素鈉混懸液，劑量均為10 mL／kg，每天灌胃1次，連續(xù)15 d，于末次給藥1 h后開(kāi)始造模。

2.7 造模 大鼠腹腔注射10%水合氯醛 （3 mL／kg）麻醉后仰臥固定，四肢皮下連接心電圖電極，記錄正常標(biāo)準(zhǔn)Ⅱ?qū)?lián)心電圖，待穩(wěn)定后經(jīng)口腔沿環(huán)狀軟骨走向進(jìn)行氣管插管，連接小動(dòng)物呼吸機(jī)，呼吸頻率 70次／min，潮氣量15 mL，呼吸比1∶2，呼吸穩(wěn)定后碘伏消毒，左前胸備皮，沿胸骨左緣2 mm處縱向切開(kāi)第3～4肋間皮膚，鈍性分離皮下組織、胸大肌、前鋸肌，暴露肋骨與肋間肌，鈍性分離后者，乳突撐開(kāi)器于3～4肋骨間撐開(kāi)肋骨，撕破心包，暴露心臟，用7-0帶線縫合針于左心耳與肺動(dòng)脈圓錐間即左心耳下緣1～2 mm處進(jìn)針，經(jīng)左冠狀動(dòng)脈左前降支下淺層心肌穿線結(jié)扎，進(jìn)針深度約1 mm，寬度約1～2 mm，冠狀前降支面置硅膠管連同冠脈縫合線一起結(jié)扎，45 s后剪去結(jié)扎線，連同硅膠管一同取出，恢復(fù)再灌注。然后，逐層縫合關(guān)胸，再次記錄心電圖，以心電圖ST段、T波抬高作為衡量模型制備成功與否的標(biāo)準(zhǔn)［7-8］，假手術(shù)組只在心臟相應(yīng)部位穿線不結(jié)扎。

2.8 心肌勻漿樣品含有量測(cè)定 術(shù)后24 h，大鼠腹腔注射10%水合氯醛 （3 mL／kg）麻醉，迅速剪取心臟，于液氮中凍存。檢測(cè)前取出心臟組織，切取約100 mg，按 “2.3”項(xiàng)下方法處理心肌組織，在 “2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算含有量［9］，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 各成分含有量測(cè)定結(jié)果 （±s， n＝10， μmol／g）

表3 各成分含有量測(cè)定結(jié)果 （±s， n＝10， μmol／g）

注：與假手術(shù)組比較，?P＜0.05，??P＜0.01；與模型組比較，＃＃P＜0.01；與陽(yáng)性藥組比較，△△P＜0.01

組別 三磷酸腺苷 二磷酸腺苷 一磷酸腺苷假手術(shù)組 0.161±0.009 20 0.675±0.318 2.209±0.230模型組 0.029 8±0.003 80?? 0.345±0.051 8?? 3.942±0.382??肉豆蔻-8散低劑量組 0.039 7±0.009 60??＃?！鳌?0.377±0.041 9??△△ 3.060±0.461??＃?！鳌魅舛罐?8散中劑量組 0.077 0±0.006 97??＃＃△△ 0.507±0.050 4??＃?！鳌?3.011±0.163??＃＃△△肉豆蔻-8散高劑量組 0.129±0.009 63??＃?！鳌?0.658±0.085 3＃＃ 2.667±0.331??＃＃陽(yáng)性藥組 0.146±0.010 6??＃＃ 0.667±0.092 7＃＃ 2.540±0.218?＃＃

3 討論

3.1 流動(dòng)相及其pH考察 色譜條件篩選結(jié)果顯示，不同pH對(duì)色譜峰峰形和分離度有很大影響，當(dāng)pH在6.00～6.50之間時(shí)，三磷酸腺苷、二磷酸腺苷、一磷酸腺苷無(wú)法完全分離，而pH 6.68時(shí)三者峰形和分離效果最佳，但磷酸鹽緩沖液 （pH＝6.68）作為流動(dòng)相時(shí)，對(duì)色譜柱的損傷較大，而加入甲醇后對(duì)其損傷程度減小。再比較2%～10%甲醇對(duì)色譜圖的影響，發(fā)現(xiàn)隨甲醇體積分?jǐn)?shù)增加，出峰時(shí)間提前，而且7%甲醇出峰時(shí)間適宜，分離效果最優(yōu)。最終確定，流動(dòng)相為甲醇-50 mmol／L磷酸鉀緩沖液 （7∶93）。

3.2 肉豆蔻-8散對(duì)心肌缺血再灌注損傷大鼠心肌能量代謝的影響 心肌組織中三磷酸腺苷、二磷酸腺苷、一磷酸腺苷含有量變化直接反映心肌能量代謝水平，心肌能量缺乏是缺血缺氧引起細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能異常的根本原因［10］。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，心肌缺血再灌注損傷大鼠心肌損傷后心肌組織內(nèi)三磷酸腺苷含有量下降最明顯，二磷酸腺苷也顯著下降，而一磷酸腺苷顯著升高，表明三磷酸腺苷、二磷酸腺苷均發(fā)生降解，引起心肌能量代謝障礙，線粒體功能下降；與假手術(shù)組比較，肉豆蔻-8散組三磷酸腺苷、一磷酸腺苷含有量均有極顯著變化 （P＜0.01），而陽(yáng)性藥組三磷酸腺苷含有量有極顯著變化 （P＜0.01），一磷酸腺苷有顯著變化（P＜0.05），表明大鼠治療后心肌細(xì)胞損傷仍不可恢復(fù)至正常水平；與模型組比較，肉豆蔻-8低劑量組二磷酸腺苷含有量無(wú)顯著變化 （P＞0.05），三磷酸腺苷、一磷酸腺苷有極顯著變化 （P＜0.01），而高、中劑量組及陽(yáng)性藥組三者含有量均有極顯著變化 （P＜0.01），其中一磷酸腺苷與三磷酸腺苷比例下降，表明肉豆蔻-8散可增加能量生成，降低能量消耗，并呈劑量依賴(lài)性；與陽(yáng)性藥組比較，肉豆蔻-8散低、中劑量組三者含有量有極顯著變化 （P＜0.01），而高劑量組二磷酸腺苷、一磷酸腺苷含有量無(wú)顯著變化（P＞0.05），表明高劑量肉豆蔻-8散中腺苷酸含有量接近陽(yáng)性藥 （復(fù)方丹參滴丸）。

4 結(jié)論

肉豆蔻-8散可明顯增加心肌缺血再灌注損傷大鼠心肌能量?jī)?chǔ)備，緩解心肌組織動(dòng)力不足，從而起到心肌保護(hù)作用，在高劑量下效果最強(qiáng)，其機(jī)制可能與促進(jìn)三磷酸腺苷合成、降低其水解、改善能量代謝有關(guān)，可為該制劑臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)支撐。