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(1 中國海洋大學，教育部海水養(yǎng)殖重點實驗室，山東 青島，266003；2 遼寧師范大學生命科學學院，遼寧 大連，116081)

高養(yǎng)殖密度通過擁擠脅迫影響魚類的生長和健康[1-3]。動物在脅迫情況下，代謝維持能的供給配比增加，新陳代謝從合成代謝向分解代謝轉(zhuǎn)變，以提供更多的能量抵御和應(yīng)對脅迫[4]。色氨酸(Trp)是人類食物和動物飼料中的重要組成成分[5-6]，是合成5-羥色胺(5-HT)的前體[7]，能降低動物血漿中皮質(zhì)醇、去甲腎上腺素和腎上腺素的含量。在魚類等脊椎動物[8-12]包括人類[13]的食物中，添加Trp能夠降低神經(jīng)內(nèi)分泌對脅迫的響應(yīng)，與免疫應(yīng)答[14]以及動物健康[15]存在相關(guān)性。刺參(ApostichopusjaponicusSelenka)是中國重要的海水養(yǎng)殖動物，也是俄羅斯、日本、朝鮮和韓國等國重要的漁業(yè)資源[16-17]。本項目組前期研究了高養(yǎng)殖密度對刺參生長的抑制[18]，而Trp對刺參的脅迫緩解能力未見報道。本研究定量測定刺參對密度脅迫的二級響應(yīng)指標，分析食源性Trp對密度脅迫下刺參生長和代謝的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗基礎(chǔ)飼料的組成為馬尾藻粉(70%)、海泥(20%)和魚粉(10%)，其中，灰分占59.9%、粗蛋白占16.56%、粗脂肪占8.52%，能值6.67 kJ/g。試驗用L-色氨酸購自Sigma(USA)，飼料中添加量為0%、1%、3%和5%。飼料原料過100目篩，用水和成面團后制成直徑1.0 mm顆粒，45 ℃烘干，-20 ℃儲藏、備用。試驗用刺參購自青島市即墨區(qū)田橫羊山海參專業(yè)合作社。試驗開始前，刺參用無添加色氨酸的基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)，馴化2周。

1.2 方法

經(jīng)馴化后挑選960頭體質(zhì)量(濕重)為(3.5 ± 0.1)g的健康刺參，隨機分配和養(yǎng)殖于64個40 L (53 cm×28 cm×34 cm) 的玻璃水族箱中。試驗設(shè)4個養(yǎng)殖密度組，即每箱4、8、16和32頭，分別標記為L、ML、MH和H。每個養(yǎng)殖密度組分別投喂含色氨酸0%、1%、3%和5%的飼料。共設(shè)16個處理組，每個處理4個重復。按照Dong等[19]的試驗方法，刺參經(jīng)過24 h饑餓后測定初始體質(zhì)量。飼養(yǎng)試驗75 d結(jié)束時，每個密度組的所有動物分別稱重，測定各指標。養(yǎng)殖期間，每個水族箱用氣石持續(xù)充氣，每天更換3/4體積的海水，溶氧高于5.0 mg /L，水溫控制在(17 ± 0.5)℃，pH (8.0 ± 0.2)，鹽度30，氨氮低于0.25 mg/L。

樣品采集與處理：試驗開始前，隨機選取30頭馴養(yǎng)后的刺參稱重，65 ℃烘干至恒重，計算刺參含水量。試驗期間，每天上午10：00過量投喂刺參飼料，22 h后，采用虹吸法分別收集殘飼和糞便。試驗結(jié)束時刺參禁食24 h。所有刺參均被稱重，計算生物量和增重率。

Wt-gain=100% × (W2-W1)/W1

(1)

式中：Wt-gain為增重率；W1和W2是刺參的初始和終末濕重，g。

代謝酶活力測定：用剪刀取刺參體壁貯存于-20 ℃?zhèn)溆?。體壁谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、乳酸脫氫酶(LDH)和蘋果酸脫氫酶(MDH)活力分別采用賴氏法、分光光度法、Ochoa[20]和Wrobleuiski 等[21]方法，用南京建成生物工程研究所試劑盒測定。

1.3 統(tǒng)計分析

色氨酸含量和養(yǎng)殖密度對刺參生長、呼吸代謝酶活性的影響采用雙因素方差(two-way ANOVA)分析。數(shù)據(jù)用SPSS17軟件進行統(tǒng)計分析。用Duncan多重比較分析不同處理組間的差異顯著性，顯著水平為P<0.05。

2 結(jié)果

2.1 色氨酸對密度脅迫下刺參生長的影響

由圖1可知，刺參生物量隨著養(yǎng)殖密度增加而增加，但體質(zhì)量增重率卻隨養(yǎng)殖密度的增加而下降。較低密度組(L和ML組)的體質(zhì)量增長率顯著高于較高密度組(MH和H組)(P<0.05)。

圖1 不同養(yǎng)殖密度及色氨酸水平下刺參的生物量和增重率

2.2 色氨酸對刺參代謝酶活力的影響

2.2.1 ALT和AST酶活力

本試驗中，較高養(yǎng)殖密度的MH和H組刺參的ALT酶活力與較低養(yǎng)殖密度的L和ML組差異顯著(P<0.05)(圖2)。各養(yǎng)殖密度下，添加色氨酸組刺參的酶活力均高于未加色氨酸的對照組，MH對照組酶活性顯著高于其他密度的對照組(P<0.05)。較高密度組，隨著色氨酸添加量的增加，ALT活力呈下降趨勢。色氨酸對較低密度組刺參的ALT活力無顯著影響。AST呈現(xiàn)與ALT相似的趨勢。

2.2.2 LDH和MDH酶活力

隨著養(yǎng)殖密度增大，刺參乳酸脫氫酶(LDH)活力升高，但到了H組卻下降(圖3)。較低密度組與較高密度組的LDH酶活力差異顯著(P<0.05)。與AST和ALT相似，MH組的LDH和蘋果酸脫氫酶(MDH)的活力高于對照組，而在MH和H組，添加色氨酸的處理組酶活力下降(圖3)。在MH和H組，投喂3%色氨酸處理組的LDH活力低于其他處理組。MDH活力趨勢與LDH相似。在各養(yǎng)殖密度下，添加3%色氨酸的處理組，酶活力低于其他處理組。

圖2 不同養(yǎng)殖密度及色氨酸水平下刺參的ALT、AST酶活力

圖3 不同養(yǎng)殖密度和投喂不同色氨酸水平刺參MDH和LDH酶活力

3 討論

3.1 高密度養(yǎng)殖抑制刺參個體生長

研究人員對卡特拉魚(Catlacatla)[22]、銀鯰(Rhamdiaquelen)[23]和鱸(Dicentrarchuslabrax)[24]的研究發(fā)現(xiàn)，高養(yǎng)殖密度使動物個體生長率下降。本研究中，對照組低養(yǎng)殖密度組刺參的增重率高于高養(yǎng)殖密度組。這表明高養(yǎng)殖密度的脅迫效應(yīng)抑制了刺參生長(圖1、圖2)。

3.2 食源色氨酸提高刺參生長性能

色氨酸為必需氨基酸，是生物合成5-HT的限速性底物。5-羥色胺(5-HT)是大腦中主要的神經(jīng)遞質(zhì)[25-26]，能夠調(diào)節(jié)動物復雜的行為、心理和生理過程[7]。色氨酸羥化酶是利用色氨酸合成5-HT所需要的酶，因此，色氨酸含量的增加可提高5-HT的合成效率[27]。另一方面，迅速消耗色氨酸已廣泛作為一種安全有效地降低大腦5-HT的生理學方法[28]。給動物喂養(yǎng)色氨酸可降低動物的進攻行為和高密度引起的脅迫。本研究中，與對照組相比，添加食源色氨酸能夠顯著促進刺參個體生長(P<0.05)(圖1)。添加食源色氨酸后，低養(yǎng)殖密度組刺參的增重率高于高養(yǎng)殖密度組；而飼料中添加3%色氨酸后，刺參呈現(xiàn)出最大增重率。Walton等[29]和Tejpal等[30]對虹鱒(Oncorhynchusmykiss)和鯪(Cirrhinusmrigala)的研究顯示，喂色氨酸的幼魚能夠提高魚類生長性能和存活率。而本研究中，飼料添加5%色氨酸，刺參生長性能下降，這可能是由于色氨酸過量造成的。過量氨基酸對生物產(chǎn)生毒性，對生長產(chǎn)生負面影響[31-33]。

3.3 食源色氨酸影響刺參代謝酶活性

代謝反映生物能量消耗的生理過程。在糖異生作用中，谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)和谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)是蛋白質(zhì)代謝中轉(zhuǎn)氨作用的主要酶[30]。Chatterjee等[34]報道，魚類受脅迫期間，轉(zhuǎn)氨酶活性的升高會引起攝入酮酸增加，進而通過氧化代謝進入三羧酸循環(huán)。本研究中，AST和ALT活力都隨著色氨酸含量從1%添加至3%而下降，而相應(yīng)的對照組AST和ALT活力則較高(圖2)。轉(zhuǎn)氨酶活力降低可認為是添加色氨酸對刺參脅迫的緩解。對照組中的蘋果酸脫氫酶(MDH)和乳酸脫氫酶(LDH)活力也比色氨酸添加組要高(圖3)。MDH活力增高表明，動物通過提高三羧酸循環(huán)代謝水平來滿足能量需求的增加，以應(yīng)對脅迫。

4 結(jié)論

較高刺參放養(yǎng)密度(16和32頭/40 L)與低密度(4、8頭/40 L)相比，對刺參明顯造成脅迫，雖然生物量增加，但生長率下降。飼料中添加1%～3%食源色氨酸能夠緩解脅迫，降低代謝酶AST、ALT、MDH、LDH活力，提高刺參生長率。

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