魏瑞麗，李曉霞

(1.延安大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院，陜西延安716000；2.銅川市環(huán)境監(jiān)測(cè)站，陜西銅川727031)

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

LK2005A型電化學(xué)工作站(天津蘭力科)，金納米修飾碳糊電極(AuNPs/CPE) 為工作電極，鉑電極為對(duì)電極，參比電極為飽和甘汞電極(SCE)。Mini-1240紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)(日本島津)。Prestige-21紅外光譜儀(日本島津)。沙丁胺醇 (Sal,中國(guó)藥品生物制品檢定所)。牛血清蛋白(BSA，北京奧博星生物技術(shù)公司)。實(shí)驗(yàn)中所有試劑均為分析純，用水均為Millipore Milli-Q超純水(大于18.2 M.cm) 。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

納米金修飾碳糊電極(AuNPs/CPE)的制備參照文獻(xiàn)方法[7]。pH 7.0 PBS緩沖溶液中，分別加入一定量的Sal、BSA，在0～1.0 V范圍進(jìn)行線性伏安法和方波伏安法掃描。紫外光譜和紅外光譜測(cè)定見(jiàn)文獻(xiàn)方法[8]。

2 結(jié)果和討論

2.1 Sal與BSA結(jié)合作用的電化學(xué)研究

AuNPs/CPE在4.07×10-5mol/L Sal溶液及分別加入不同濃度的BSA的PBS( pH 7.0)緩沖液中進(jìn)行線性伏安掃描，發(fā)現(xiàn)Sal在0.60 V處有1個(gè)靈敏的氧化峰(圖1曲線a)。當(dāng)加入BSA后，未發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生新的氧化還原峰，且Sal的峰電位未發(fā)生變化，但峰電流降低(圖1曲線b)。當(dāng)繼續(xù)增大BSA的濃度，峰電流明顯下降 (圖1曲線c)。推測(cè)加入BSA后，與Sal結(jié)合形成了非電化學(xué)活性的復(fù)合物，降低了溶液中游離Sal的濃度，導(dǎo)致AuNPs/CPE上峰電流降低。為了進(jìn)一步研究?jī)烧叩慕Y(jié)合作用，試驗(yàn)采用了檢測(cè)靈敏度更高的方波伏安法，對(duì)Sal與BSA的結(jié)合常數(shù)、結(jié)合比進(jìn)行測(cè)定。線性關(guān)系曲線如圖2所示。結(jié)果表明，當(dāng)Sal與BSA形成結(jié)合比為1時(shí)，1/ΔIpa～1/[BSA]呈良好的線性關(guān)系，線性方程：1/ΔIpa=2×10-6/[BSA] (mol/L)+0.5673，r=0.9973。計(jì)算出Sal與BSA的結(jié)合常數(shù)為2.84×105L/mol。說(shuō)明Sal與BSA之間有較強(qiáng)的結(jié)合能力。文獻(xiàn)報(bào)道3個(gè)結(jié)構(gòu)域構(gòu)成了BSA的空間結(jié)構(gòu)，每個(gè)結(jié)構(gòu)域有2個(gè)亞結(jié)構(gòu)域以槽口相對(duì)的方式形成圓筒狀結(jié)構(gòu),幾乎所有疏水性氨基酸殘基都包埋在圓筒內(nèi)部,構(gòu)成疏水性腔。而在其外表面及疏水性腔體的入口處則布滿了親水性的氨基酸殘基[9]。Sal小分子可以扦插到BSA分子疏水腔區(qū)域，Sal分子上的羥基可以與BSA主鏈的肽鍵-NH-CO-形成氫鍵，從而與BSA結(jié)合形成復(fù)合物，使溶液中游離的Sal有效濃度降低，導(dǎo)致AuNPs/CPE上氧化峰電流降低。此結(jié)論與圖1結(jié)果、文獻(xiàn)方法[10]報(bào)道一致。

(a) cBSA=0 ; (b)cBSA=2.49×10-7mol/L;

固定Sal濃度為4.07×10-5mol/L時(shí)，加入不同濃度的BSA后，發(fā)現(xiàn)峰電流的降低值ΔIpa與BSA的濃度呈良好的線性關(guān)系，線性范圍：2.47×10-7mol/L～2.00×10-5mol/L，線性方程：ΔIpa(μA)=0.349+89530c(c/(mol/L)，r=0.9912，BSA的檢出限為8.23×10-8mol/L(S/N=3)。本法測(cè)定的檢出限低于文獻(xiàn)方法[11]報(bào)道。對(duì)1.48×10-6mol/L的BSA 11次平行測(cè)定，RSD為2.3%。本方法可望用于BSA的定量測(cè)定。

圖2 1/ΔIpa～1/[BSA]的線性關(guān)系圖

2.2 Sal與BSA結(jié)合作用的紫外光譜研究

圖3為4.07×10-5mol/L Sal、BSA和Sal-BSA的紫外光譜圖。BSA在278 nm處有一吸收峰(a)，此特征吸收峰主要是BSA肽鏈上氨基酸分子大鍵的吸收峰。Sal在276 nm處有一吸收峰(b)，Sal和BSA完全結(jié)合后，吸光度明顯增大(c)。固定BSA濃度為4.07×10-5mol/L，加入一系列不同濃度的Sal，隨著Sal濃度的增加，BSA的最大吸收峰略微紅移(2 nm)且有增色效應(yīng)(ABSA+Sal>ABSA)，說(shuō)明Sal與BSA存在相互作用。原因可能是Sal與BSA結(jié)合作用后，改變了BSA中氨基酸的構(gòu)象微環(huán)境的變化，引起吸收峰增色紅移。BSA分子中含有色氨酸、酪氨酸及苯丙氨酸等殘基，能發(fā)射較強(qiáng)的內(nèi)源熒光。在290 nm激發(fā)波長(zhǎng)下，Sal在300～500 nm熒光范圍內(nèi)無(wú)熒光發(fā)射。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)加入的Sal濃度不斷增加，BSA的內(nèi)源熒光強(qiáng)度降低，說(shuō)明Sal能顯著地猝滅BSA的熒光強(qiáng)度。溫度分別為20 ℃，25 ℃，30 ℃和37 ℃時(shí)，考察了BSA熒光強(qiáng)度隨Sal的變化，結(jié)果表明，隨著溫度的升高，方程的斜率猝滅常數(shù)Ksv逐漸降低了，說(shuō)明Sal對(duì)BSA的熒光猝滅作用不是動(dòng)態(tài)猝滅，而是生成了Sal-BSA復(fù)合物的靜態(tài)猝滅，此結(jié)果與文獻(xiàn)方法[10]報(bào)道一致。

考察了4種常見(jiàn)金屬離子Zn2+，Mg2+，F(xiàn)e3+和Cu2+對(duì)Sal與BSA結(jié)合作用的影響。結(jié)果表明，分別加入Zn2+，Mg2+，F(xiàn)e3+和Cu2+后，Sal的紫外光譜曲線未發(fā)生變化，說(shuō)明這些金屬離子對(duì)Sal沒(méi)有影響。分別將Zn2+，Mg2+，F(xiàn)e3+和Cu2+加入BSA中，278 nm處BSA的吸收峰發(fā)生藍(lán)移，說(shuō)明4種金屬離子與BSA發(fā)生了結(jié)合，生成了金屬離子-BSA復(fù)合物，復(fù)合物的形成會(huì)改變了BSA的構(gòu)象。從而影響到Sal與BSA的結(jié)合。

(a) BSA;(b) Sal;(c) BSA-Sal

2.3 Sal與BSA結(jié)合作用的紅外光譜研究

圖4 Sal、BSA和Sal-BSA的紅外光譜圖

在4000～500 cm-1區(qū)域測(cè)定了Sal、BSA及Sal-BSA復(fù)合物的紅外光譜(圖4)。從圖4可以看出，Sal的vN-H為2 548 cm- 1，vC-H為2 966 cm- 1，在Sal-BSA結(jié)合物中分別移至2 550 cm- 1、2 969 cm- 1，變化不明顯。而在2 300 cm- 1～500 cm- 1區(qū)域，BSA分子中S-H的伸縮振動(dòng)頻率vs-H移動(dòng)最為明顯，BSA的vs-H為2 341 cm-1，Sal-BSA結(jié)合物的vs-H為2 391 cm-1，說(shuō)明Sal分子與BSA分子中氨基酸殘基的硫形成鍵合作用。BSA的δN-H=1 394 cm- 1、Sal-BSA結(jié)合物的δN-H=1 340 cm- 1，BSA分子中N-H變形振動(dòng)頻率δN-H的移動(dòng)，表明BSA端基及殘基中的氮原子也參與Sal的成鍵且有氫鍵締合作用。此結(jié)果說(shuō)明Sal與BSA發(fā)生了作用，使得BSA的多肽鏈的S-H和N-H作用，改變了BSA的構(gòu)象。

3 結(jié)論

采用納米金修飾碳糊電極電化學(xué)方法并結(jié)合紫外光譜、紅外光譜法研究了Sal與BSA的結(jié)合作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Sal通過(guò)疏水作用扦插到BSA疏水微區(qū)內(nèi)部，與BSA形成了非電化學(xué)活性的復(fù)合物。紫外光譜和紅外光譜說(shuō)明Sal與BSA結(jié)合引起B(yǎng)SA氨基酸的構(gòu)象發(fā)生改變。4種常見(jiàn)金屬離子Zn2+，Mg2+，F(xiàn)e3+和Cu2+對(duì)沙丁胺醇與牛血清蛋白的結(jié)合起抑制作用。