孫麗芳，楊海堂，衛(wèi) 偉*

(1.國家知識產權局復審和無效審理部，北京 100088；2.東南大學 化學化工學院，江蘇 南京 211189)

端粒和端粒酶在保證細胞分裂時染色體的完整復制、免于退化方面起關鍵作用。端粒酶是染色體的自然脫落物，能引發(fā)衰老和癌癥。在新細胞中，細胞每分裂一次，端粒就縮短一次。當端粒不能再縮短時，細胞即無法繼續(xù)分裂而死亡。大約90%的癌細胞都有著不斷增長的端粒及相對來說數(shù)量較多的端粒酶[1-2]。大量研究數(shù)據證明，端粒酶活性在正常體細胞中被抑制，正常組織細胞中幾乎檢測不到端粒酶的活性，但其在腫瘤細胞中高度表達，大約90%的癌細胞如膀胱癌、乳腺癌、胃癌細胞中可以檢測到高活性的端粒酶[3]。因此，端粒酶作為一種潛在的腫瘤標志物，其檢測對癌癥的預防、早期發(fā)現(xiàn)以及預后效果的判斷均具有重大意義。

早期的端粒酶活性檢測方主要有端粒重復序列擴增法(TRAP)[4-6]、端粒重復序列延伸法[7]、化學發(fā)光法[8-10]、實時定量熒光聚合酶鏈式反應(PCR)法[11]等。近年發(fā)展起來的很多新的基于各種納米材料和新技術的高靈敏檢測端粒酶活性的方法，如電化學檢測法[12-13]、比色法[14]、熒光法[15]、表面增強拉曼光譜法[16]等，為端粒酶的檢測提供了新選擇。本文重點介紹近年發(fā)展的端粒酶檢測新方法。

1 電化學檢測法

電化學分析方法作為一種經典的分析方法，具有特異性好、操作簡單、儀器價格低廉等優(yōu)點。近年來，用電化學分析方法來檢測端粒酶活性的工作[12,17-19]被大量報道。

基于DNA上的磷酸基團可與鉬酸鹽反應生成有電化學活性的磷鉬酸鹽，Wang等[12]建立了一種用于端粒酶活性測定的超靈敏電化學傳感器。該檢測體系對102～107Hela cells/mL的端粒酶活性有線性響應，檢測限為40 Hela cells/mL。Ling等[17]合成了卟啉金屬有機框架(ProMOF)材料，在表面包裹鏈霉親和素(SA)后得到ProMOF@SA材料，該材料可在接近電極表面時電催化氧氣發(fā)生還原反應，產生電流信號。該研究通過端粒酶將其引物擴增形成發(fā)卡結構，并釋放與引物互補的DNA，互補DNA與修飾在電極表面的發(fā)卡DNA雜交，發(fā)卡DNA上的生物素通過與ProMOF@SA結合，還原氧氣產生電流，從而實現(xiàn)端粒酶的檢測。

此外，研究者們還開發(fā)了端粒酶的免標記電化學檢測方法。例如，Liu等建立了一種基于T7核酸外切酶輔助靶循環(huán)的均相、靈敏、快速、簡便的電化學策略，用于癌細胞中端粒酶活性的檢測[18]。無端粒酶時，標記有亞甲基藍(MB)的發(fā)卡DNA遠離電極表面，MB的電流信號較弱；有端粒酶時，端粒酶擴增產物與發(fā)卡DNA形成互補雙鏈，T7核酸外切酶切割雙鏈DNA，此時由于正負電吸引作用，MB靠近電極表面。該方案中，端粒酶引物可以循環(huán)利用，提高了檢測的靈敏度。Wei等也發(fā)展了一系列免標記電化學檢測端粒酶活性的新方法。他們以DNA正四面探針固定端粒擴增引物并將其修飾到金電極表面，端粒酶擴增出(TTAGGG)n富G序列形成G-四鏈體后，具有過氧化物類催化活性，可催化苯胺聚合，形成具有電化學活性的聚苯胺，進而可通過示差脈沖伏安法檢測聚苯胺的電化學信號來檢測端粒酶活性。該法最低檢測限為1個細胞/10 μL，與單鏈端粒引物探針相比，信號強度提高20倍[20]。此外，他們還設計了一種基于氧化鋁納米通道的無標記端粒酶活性檢測新方法[21]，以及無標記、無電極修飾的檢測端粒酶活性的新方法[22]。

Zhang 等將聚魯米諾-鉑納米(polyluminol-PtNPs)材料修飾在氧化銦錫(ITO)電極表面，利用端粒酶引入修飾的DNA@MSN@PMA作探針，采用電致化學發(fā)光法檢測了細胞內端粒酶的活性[23]。Feng等利用硫化鎘半導體納米材料(CdS NCs)和魯米諾-金納米復合材料(L-AuNPs)間的能量轉移(ECL-RET)，實現(xiàn)了端粒酶的活性檢測[24]。Xiong等合成了釕摻雜的金屬有機骨架，并利用ECL-RET原理實現(xiàn)了端粒酶的檢測[25]。

2 比色法檢測端粒酶活性

與電化學檢測相比，比色法通過裸眼觀察溶液顏色及其深淺來判斷有無目標物和目標物含量，是一種直觀、簡便、易于快速操作的分析檢測方法。與其它分析檢測方法相比，比色法不需要借助于昂貴的儀器，對操作人員的技術要求不高，因此越來越受到人們的關注[26-27]。

在K+與hemin的存在下，端粒酶在引物3′端擴增出的富含G的DNA序列會形成hemin-G-四鏈體納米結構，該納米結構具備辣根過氧化物酶催化活性。Freeman等將制備得到的hemin-G-四鏈體用于催化3,3′,5,5′-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)，端粒酶含量越多，得到的TMB+越多，進而可通過TMB紫外吸收值的變化實現(xiàn)端粒酶的檢測，其最低檢測限為200 cells/μL[26]。納米金(AuNPs)是一種很好的比色法探針，當AuNPs之間距離很遠時，溶液呈紅色；當AuNPs距離靠近時，其紫外吸收峰發(fā)生紅移，溶液變成藍色。Willner等基于左旋半胱氨酸(L-Cysteine)的輔助作用，通過端粒酶擴增引物(TS)擴增后形成的hemin-G-四鏈體控制AuNPs的聚集和分散，并實現(xiàn)了端粒酶活性的檢測[27]。Wang等也提出了利用TS修飾AuNPs比色法檢測端粒酶活性的方法[28]。Xia等以雙功能化的金膠為探針，發(fā)現(xiàn)當膀胱癌患者尿液中端粒酶活性水平不同時，該探針可呈現(xiàn)出4種不同的狀態(tài)(藍色、紫色、紅色及沉淀)[29]。

Wei等研究了hemin復合的石墨烯(H-GNs)、金納米棒等納米材料在端粒酶檢測中的應用。H-GNs在鹽溶液中具有可調控的分散性和類過氧化氫酶活性。端粒酶活性不同時，H-GNs團聚程度不同，因而催化TMB的顯色程度不同，所以可以通過肉眼觀察溶液顏色的變化來判斷端粒酶含量[30]。他們還提出了一種基于hemin-G-四鏈體類過氧化物酶催化刻蝕金納米棒的方法來比色檢測端粒酶：以金納米棒(GNRs)為探針，端粒酶活性不同，金納米棒被刻蝕的程度不同，其溶液呈現(xiàn)紅、灰、藍、紫、粉紅等顏色，基于此可實現(xiàn)對端粒酶的快速、簡單、可視化檢測[31]。

3 熒光法檢測端粒酶活性

熒光法是生物分析中的常用方法，該法可將待測物質的有無和含量多少通過熒光信號輸出的分子光譜峰位置以及強度表示出來。與一般檢測方法相比，熒光法具有靈敏度高、能夠實時原位檢測以及可生物成像等[32-39]等優(yōu)勢。

國內外有不少利用熒光法檢測端粒酶活性的研究。Ma等設計了能特異性識別端粒酶，同時又能夠釋放出廣譜抗腫瘤藥物阿霉素(Dox)的熒光探針，基于此建立的檢測平臺能夠實現(xiàn)端粒酶活性檢測、細胞成像以及腫瘤治療的一體化[32]。Yang等設計了一種基于熒光能量共振轉移(FRET)原理的探針，用于細胞內端粒酶活性檢測和細胞成像研究[34]。他們將修飾有異硫氰酸熒光素(FITC)和四甲基羅丹明(TAMRA)的DNA(該DNA命名為 Flare)作為探針，當探針進入到含有端粒酶的細胞中時，延伸出來的序列將Flare置換出去，形成發(fā)卡結構，F(xiàn)lare離開AuNPs表面。此時FITC和TAMRA距離很近，且沒有AuNPs的猝滅作用，使得TAMRA熒光信號大大增強。Ma等發(fā)展了一種基于2-氨基嘌呤無猝滅分子信標檢測端粒酶活性的方法。當端粒酶引物被擴增后，隨著大片段(KF)聚合酶的加入，引物沿著模板延伸，與加入的發(fā)卡DNA形成雙鏈，同時分子信標被T7酶降解，釋放出游離的分子信標和引物延伸鏈，引發(fā)下一輪T7外切酶降解。該方法實現(xiàn)了雙重信號放大，具有高靈敏度和特異性，在抗腫瘤藥物的開發(fā)方面具有重要意義[35]。

還有一些科學家設計了更為巧妙的免標記法檢測端粒酶的活性。Zhou等開發(fā)了一種基于構象開關的端粒酶活性的熒光檢測方法。該法通過使擴增產物與無活性的適體分子(Spinach)雜交，觸發(fā)適體的構象轉換，隨后Spinach與熒光分子結合，產生綠色熒光，通過加入核糖核酸酶(RNase H)將雜交的雙鏈切掉，釋放端粒酶擴增產物，如此循環(huán)利用，可使熒光信號得到進一步增強。該熒光生物傳感器的檢測限為100個細胞[39]。此外，Wei等提出了基于TOTO-1對單鏈DNA中G堿基的高靈敏度和高選擇性檢測端粒酶的方法，通過引入ExoⅢ核酸外切酶對引物鏈消化，極大地提高了方法的靈敏度。該方法對端粒酶的檢測范圍為2～4 000 cells/mL，最低檢測限為2 cells/mL[40]。

在熒光檢測法中，原位檢測技術能夠在活細胞內研究癌癥標志物的動態(tài)，分析其表達的機會及表達水平，實現(xiàn)癌癥標志物的快速、靈敏檢測。目前許多研究將納米材料與信號放大技術結合形成納米探針，并以胞吞的形式進入細胞，實現(xiàn)目標物的原位檢測。如Qian等設計了對端粒酶響應的介孔硅納米粒子(MSN)探針，并實現(xiàn)了端粒酶活性的高靈敏檢測以及細胞成像研究[41]。他們在帶正電荷的MSN孔道上修飾熒光猝滅基團2,5-二特丁基對苯二酚(BHQ)和帶正電荷的熒光素，并用DNA鏈對MSN孔道進行封堵。端粒酶擴增產物通過和封堵DNA雜交，使之從MSN表面脫落，釋放熒光素，產生熒光，該方法可用于細胞成像。此外，Zhuang等利用聚集誘導發(fā)光(AIE)的特性，開發(fā)了一種快速靈敏的生物探針，利用端粒酶將引物擴增后形成的帶高密度負電荷的單鏈DNA，引起AIE分子的聚集誘導發(fā)光，并將其用于細胞內原位成像來檢測端粒酶活性[42]。

4 表面增強拉曼光譜法

表面增強拉曼法光譜(SERS)具有檢測限低、特異性好、操作簡便、待測樣品狀態(tài)不受限制等特點，在生化分析領域應用廣泛[43-44]。

Xu等以AuNPs為材料進行DNA自組裝，合成了金字塔型的拉曼探針用于端粒酶活性的檢測和細胞成像[43]。他們在4個15 nm左右的AuNPs表面修飾上4條DNA單鏈，并將其和Cy5標記的指示探針(RS)以及端粒酶引物(TS)互補配對，組成具有拉曼信號的檢測探針。端粒酶擴增產物可使RS從雙鏈上脫落，拉曼信號消失。將該探針與含有端粒酶的癌細胞進行孵育，由于AuNPs具有良好的生物相容性并且能夠進入細胞，在細胞內產生熒光信號，進而實現(xiàn)了端粒酶的細胞成像研究。

Eom等構建了基于納米孔道金納米線(AuNW)SERS檢測器檢測癌細胞和組織中端粒酶活性的平臺[44]。通過在AuNW上濺射沉積Au獲得富含納米空孔道的AuNW，AuNW具有穩(wěn)定的拉曼信號，而MB是一種可以嵌入G-四鏈體結構的具有拉曼增強效應的分子。當端粒酶擴增的富G序列形成G-四鏈體后，正電性的MB分子嵌入G-四鏈體內，增強富含納米孔道AuNW的拉曼信號，從而實現(xiàn)癌細胞和癌癥組織中端粒酶活性的檢測。該方法非常靈敏，最低檢測限可達0.2個癌細胞。

5 局域表面等離子體共振技術

免標記的局域表面等離子共振(LSPR)檢測技術具有很高的時空分辨率，能夠進行單顆粒水平原位生物過程及化學反應的研究[45-49]。

Liu等建立了基于等離子體共振散射光譜和暗場顯微鏡原位檢測端粒酶活性及細胞成像的方法。他們利用端粒酶引物將50 nm的金(核)和13 nm的金(衛(wèi)星)組裝制得Au50@Au13復合探針，該探針在暗場顯微鏡下呈橙色。當引物被端粒酶擴增后，擴增產物雜交形成發(fā)卡結構，Au50@Au13探針發(fā)生去組裝，探針發(fā)生顯著LSPR位移，散射光由橙色向綠色漸變。該設計極大提高了單粒子的檢測靈敏度，檢出限低至1.3×10-13IU，可監(jiān)測藥物誘導的細胞內端粒酶活性變化[50]。

6 結論與展望

端粒酶是重要的腫瘤生物標志物之一，實現(xiàn)簡單、準確的端粒酶活性評價是本領域研究者孜孜不倦的追求。最近幾年，端粒酶活性的檢測新方法已經克服了原位端粒酶活性檢測的挑戰(zhàn)，實現(xiàn)了從體外到活細胞內端粒酶成像的檢測。盡管方法的高靈敏度和方便快捷性尚未能很好的兼顧，穩(wěn)定性方面也有待改進，這些方法也還不能直接用于臨床診斷和癌癥患者的藥物治療效果監(jiān)測。然而熒光技術對端粒酶在活細胞中的內成像做出了巨大貢獻，可以預期，一些DNA組裝的納米探針，如AuNP/DNA和PtNPs/DNA在抗癌藥物從體外運輸進入體內方面具有巨大的潛力，實現(xiàn)端粒酶監(jiān)測、腫瘤治療與熒光成像一體仍有很大的研究空間。因此，發(fā)展對端粒酶活性分析的簡單、靈敏、低成本的原位實時監(jiān)測仍然是當前亟待解決的問題。