楊俊卿，吳芳輝，羅祥瑞，朱海威，余愛民

(安徽工業(yè)大學(xué) 化學(xué)與化工學(xué)院，安徽 馬鞍山 243000)

Zn2+是生物體內(nèi)必需的微量元素之一，在人體中主要存在于大腦、胰腺及精細(xì)胞中，它是神經(jīng)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和病理學(xué)、金屬酶調(diào)節(jié)、基因轉(zhuǎn)錄、免疫功能和哺乳動物繁殖等許多生物學(xué)過程中的重要輔助因子[1-2]，生物系統(tǒng)中的Zn2+代謝紊亂與癲癇、糖尿病、嬰兒腹瀉和阿爾茨海默病有關(guān)[3]。同時Zn2+還屬于重金屬離子之一，鋅礦開采、冶煉加工、機(jī)械制造以及鍍鋅等工業(yè)均會對環(huán)境造成極大污染[4]，因此生態(tài)環(huán)境、飲用水和生物系統(tǒng)中Zn2+的快速靈敏特異性檢測是一個重要的研究課題[5]。近年來，基于生物和環(huán)境中重金屬和過渡金屬離子的熒光探針的設(shè)計和開發(fā)受到廣泛關(guān)注[6-9]，但這些分子探針要么結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜、合成原料價格昂貴，要么合成步驟較為復(fù)雜，識別靈敏度不高，應(yīng)對復(fù)雜的生理環(huán)境時選擇性差。因此，開發(fā)新“off-on”型結(jié)構(gòu)簡單、水溶性好、靈敏度高、選擇性強的熒光探針檢測Zn2+仍是當(dāng)務(wù)之急。

另一方面，內(nèi)源性硫在大鼠、人和牛的大腦中呈現(xiàn)較高的濃度水平時，通常與糖尿病、慢性腎病、唐氏綜合征、高血壓、肝硬化和阿爾茨海默病等許多疾病[10]有關(guān)。迄今為止，已有多種分析方法用于識別和檢測生物體內(nèi)的硫離子，其中樣品前處理過程簡單、分析儀器價廉、響應(yīng)迅速的熒光探針技術(shù)脫穎而出[11]。

眾所周知，羅丹明及其衍生物因熒光量子產(chǎn)率高、產(chǎn)量高、光穩(wěn)定性好、合成簡單、檢出限低等優(yōu)點，已被廣泛用作一類重要的熒光和顯色傳感器[12]。本文利用羅丹明衍生物熒光傳感的基本原理，通過兩步反應(yīng)、溫和的反應(yīng)條件、價廉易得的原料，導(dǎo)向性設(shè)計合成了光學(xué)性能好、結(jié)構(gòu)新穎的熒光分子探針N-(2-羥基-5-氯苯)基羅丹明B酰肼(HCPRH)。研究發(fā)現(xiàn)向含該探針的N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液中加入Zn2+會使原本無色的羅丹明化合物的內(nèi)酰胺環(huán)打開，從而發(fā)射出強烈的熒光并迅速產(chǎn)生顏色變化，可實現(xiàn)裸眼識別Zn2+的效果。根據(jù)熒光滴定曲線，獲得Zn2+的線性檢測范圍，進(jìn)一步研究了探針與Zn2+結(jié)合性能以及干擾情況，最后還發(fā)現(xiàn)該HCPRH探針在繼續(xù)加入S2-的情況下，熒光和顏色消失，從而可實現(xiàn)Zn2+與S2-的連續(xù)響應(yīng)，因此該HCPRH分子探針可發(fā)展作為具有潛在應(yīng)用價值的光學(xué)傳感材料。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Nexus-870傅立葉變換紅外光譜儀(美國Nicolet公司)，布魯克Avance Ⅲ HD系列核磁共振(NMR)波譜儀(德國布魯克公司)，日立F4600熒光分光光度計(日本日立公司)。

5-氯水楊醛、羅丹明B與水合肼均購自阿拉丁公司；無水乙醇購自南京學(xué)試劑有限公司；所用化學(xué)試劑均為分析純，使用前未經(jīng)進(jìn)一步純化。實驗用水為二次蒸餾水。

1.2 HCPRH探針的合成

圖1 HCPRH探針的合成Fig.1 Synthesis of probe HCPRH

1.3 HCPRH探針的熒光測試方法

所有實驗均在室溫下進(jìn)行，采用長度為1 cm，容積為3 mL的石英比色皿在熒光分光光度計上測試。將一定量HCPRH溶于分析純DMF溶劑中配成50 μmol/L溶液，再加入Zn2+進(jìn)行熒光滴定實驗(激發(fā)波長為420 nm)。選擇性研究中Zn2+和其它干擾金屬離子溶液均采用硝酸鹽或醋酸鹽配制。HCPRH與Zn2+的結(jié)合常數(shù)(Ka)按照Benesi-Hilderbrand方程[14]進(jìn)行測定及計算，結(jié)合比采用Job's分析法[15]測定。

圖2 HCPRH探針對不同濃度Zn2+的熒光響應(yīng)Fig.2 Fluorescence response of probe HCPRH to diverse concentrations of Zn2+ in DMFconcentrations of Zn2+(1-17):0,1,2,4,6,8,10,15,20,30,40,50,100,150,200,250,300 μmol/L

圖3 HCPRH探針對Zn2+熒光響應(yīng)的機(jī)理Fig.3 Fluorescence response mechanism of the probe HCPRH to Zn2+

2 結(jié)果與討論

2.1 HCPRH探針對Zn2+的熒光響應(yīng)研究

研究發(fā)現(xiàn)，在含有50 μmol/L HCPRH探針的DMF溶液中，緩慢加入Zn2+會使原本在512 nm處幾乎無熒光的HCPRH探針在365 nm的紫外燈下發(fā)射出強烈的亮黃色熒光，且熒光峰強度隨著Zn2+濃度增加不斷增大，并由512 nm逐漸藍(lán)移至507 nm，當(dāng)Zn2+濃度為300 μmol/L時，體系熒光峰強度達(dá)到最大，繼續(xù)增加Zn2+，HCPRH探針的熒光強度反而略有下降(圖2)，表明此時HCPRH探針與Zn2+結(jié)合已經(jīng)達(dá)到飽和。另外，根據(jù)熒光滴定結(jié)果發(fā)現(xiàn)探針熒光強度變化值(ΔIF=IF-IF0)與Zn2+濃度(c)在10～250 μmol/L之間呈良好的線性關(guān)系，線性方程為ΔIF=1.091 67c(μmol/L)+13.802 46(r=0.993 0)，按照3σ/S(σ為空白溶液測定的標(biāo)準(zhǔn)偏差，S為線性方程的斜率)計算得Zn2+的檢出限為3.6 μmol/L，滿足其微量檢測要求。

2.2 HCPRH探針對Zn2+的熒光響應(yīng)機(jī)理研究

2.3 HCPRH探針與Zn2+的結(jié)合性能研究

根據(jù)熒光光譜數(shù)據(jù)計算作Benesi-Hilderbrand圖[14]，結(jié)果顯示，HCPRH探針在512 nm處熒光強度差值的倒數(shù)(1/(IF-IF0))與Zn2+濃度的倒數(shù)(1/[Zn2+])呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)(r)為0.998 5，由此計算出HCPRH探針與Zn2+之間結(jié)合常數(shù)為6.962×103L/mol，由于該數(shù)值較大，理論上表明HCPRH探針與Zn2+所形成的產(chǎn)物較穩(wěn)定，熒光不易猝滅[17]。

圖4 HCPRH探針與Zn2+之間的Job's圖Fig.4 Job's plot of probe HCPRH and Zn2+in DMF

采用Job法[17]分析HCPRH探針與Zn2+之間的結(jié)合比。分別吸取一定量探針與Zn2+溶液(濃度均為1 mmol/L)，保持總體積為100 μL，溶于2 mL DMF溶液中，使用1 cm熒光比色皿中進(jìn)行測定。結(jié)果顯示，當(dāng)Zn2+及探針的摩爾分?jǐn)?shù)均為0.5時，熒光強度變化值達(dá)到峰值(圖4)，表明HCPRH探針與Zn2+以1∶1的摩爾比配位。

圖5 含有Zn2+的HCPRH探針體系對不同濃度S2-的熒光響應(yīng)Fig.5 Fluorescence response of probe HCPRH containing Zn2+ to diverse concentrations of S2-in DMF concentrations of S2-(1-9):0,1,2,3,4,5,6,7,8 μmol/L

2.4 HCPRH探針對Zn2+熒光響應(yīng)的選擇性研究

2.5 HCPRH探針對Zn2+及S2-的連續(xù)響應(yīng)研究

3 結(jié) 論

本文采用簡單的兩步反應(yīng)制備了一種新型HCPRH分子探針，并采用多種手段表征了其結(jié)構(gòu)和熒光性能。研究發(fā)現(xiàn)，在HCPRH探針的DMF溶液中加入Zn2+會導(dǎo)致其熒光峰強度顯著增強，在365 nm 紫外燈下可裸眼觀察到原本無色的HCPRH探針迅速轉(zhuǎn)變成亮黃色，且其它可能的共存離子(如Na+、K+、Al3+等)不干擾HCPRH對Zn2+的熒光響應(yīng)。結(jié)合熒光滴定實驗結(jié)果計算了HCPRH探針與Zn2+之間的結(jié)合常數(shù)和結(jié)合比，并獲得了HCPRH探針微量檢測Zn2+的線性范圍和檢出限，最后利用Zn2+與S2-之間的穩(wěn)定結(jié)合能力實現(xiàn)了HCPRH探針對Zn2+和S2-的連續(xù)熒光識別，該HCPRH探針可發(fā)展作為實時在線識別和檢測離子的傳感材料。