周秀錦，張 靜，邵宏宏，相興偉，冷向陽(yáng)，楊會(huì)成*

(1.舟山海關(guān)綜合技術(shù)服務(wù)中心，浙江 舟山 316000；2.浙江海洋開(kāi)發(fā)研究院，浙江 舟山316000；3.SCIEX公司，上海 200335)

黑鯛(Acathopagrusschlegelii)是我國(guó)東南沿海地區(qū)及太平洋西岸海水養(yǎng)殖的經(jīng)濟(jì)魚(yú)類(lèi)[1]，但由于其病害原因，嚴(yán)重阻礙了黑鯛養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展[2]。硒(Se)是生物必需的微量礦物元素，是谷胱甘肽過(guò)氧化物酶和脫碘酶的組成成分，在水產(chǎn)動(dòng)物生長(zhǎng)性能、抗氧化能力、免疫功能等方面有重要作用[3]。其中有機(jī)硒比無(wú)機(jī)硒具有更高的生物利用率[4]。低聚硒化氨基多糖作為一種有機(jī)硒化合物，其生物活性普遍高于多糖和硒，更易被機(jī)體吸收和利用[5]。其對(duì)小鼠單核巨噬細(xì)胞白血病細(xì)胞(RAW264.7)具有一定的免疫調(diào)節(jié)作用[6]，可作為增強(qiáng)適應(yīng)性免疫功能的潛力含硒膳食補(bǔ)充劑[7]。脾臟是魚(yú)類(lèi)重要的免疫和造血器官，包含多種非特異性免疫細(xì)胞和體液免疫因子[8]，具有造血、濾血和免疫的功能[9]。目前，關(guān)于黑鯛對(duì)低聚硒化氨基多糖的利用已有初步研究[10]，但利用代謝組學(xué)技術(shù)研究低聚硒化氨基多糖對(duì)黑鯛脾臟免疫調(diào)節(jié)機(jī)制的報(bào)道較少。

代謝組學(xué)能夠?qū)⒎从硺悠吩夹畔⒌母叻直尜|(zhì)譜(HR MS)和核磁共振(NMR)等復(fù)雜數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)一系列降維處理后，直接反映體內(nèi)生物化學(xué)過(guò)程和狀態(tài)的變化，在系統(tǒng)研究生物內(nèi)源性小分子代謝物的整體和動(dòng)態(tài)變化規(guī)律方面具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)[11-17]。本研究利用高通量、高靈敏度、高分辨的超高效液相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜檢測(cè)技術(shù)(UPLC-TOF-MS)和非靶向代謝組學(xué)方法，闡釋低聚硒化氨基多糖對(duì)黑鯛免疫調(diào)節(jié)的潛在機(jī)制和靶標(biāo)途徑，可為黑鯛免疫增強(qiáng)劑的開(kāi)發(fā)提供參考。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料與試劑

乙腈、甲醇、甲酸、間氨基苯甲酸乙酯甲磺酸鹽(MS-222，60 mg/L)均為色譜純，購(gòu)于美國(guó)Sigma-Aldrich 公司；低聚氨基多糖(LA，浙江金殼生物化學(xué)有限公司)分子量約為50 kDa；低聚硒化氨基多糖為自制，其中硒的有效含量為27.3×103mg/kg。

1.2 儀器與設(shè)備

AB SCIEX ExionLC AD & Triple TOF 5600+液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)(美國(guó)AB SCIEX公司)；XS105分析天平(瑞士Mettler Toledo公司)；ST-16R型高速冷凍離心機(jī)(美國(guó)Thermo公司)；氮吹儀(美國(guó)Organomation公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及樣品處理黑鯛幼魚(yú)由浙江省海洋水產(chǎn)研究所試驗(yàn)場(chǎng)提供，停止飼養(yǎng)1 d，挑選健康、大小均勻、體重為(13.00±0.20) g的幼魚(yú)隨機(jī)分為2組，每組3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)為25尾魚(yú)，放入容積為310 L(水體260 L)的玻璃纖維缸內(nèi)微流水式飼養(yǎng)。在普通飼料中添加0.6 mg Se/kg低聚硒化氨基多糖作為實(shí)驗(yàn)組，同時(shí)做空白組，實(shí)驗(yàn)周期為8周。結(jié)束后將魚(yú)饑餓24 h，再用MS-222(60 mg/L)麻醉，取出脾臟組織，實(shí)驗(yàn)組和空白組各取10個(gè)平行樣品，稱重后，用液氮快速冷凍，然后置于-80 ℃的超低溫冰箱中保存，備用。

1.3.2 樣品前處理取適量的樣品于15 mL離心管中，用10倍體積的甲醇(-20 ℃)進(jìn)行勻漿后，于4 ℃下以13 000 r/min離心15 min，取5.0 mL上清液40 ℃氮?dú)獯蹈?，?.0 mL的甲醇水(體積比4∶1)復(fù)溶，待測(cè)。以“1.3.1”中實(shí)驗(yàn)組和空白組為質(zhì)控樣品(QC)進(jìn)行方法驗(yàn)證，各取上述樣品的上清液1.0 mL，混合均勻，40 ℃氮?dú)獯蹈?，?.0 mL的甲醇水(4∶1)復(fù)溶待測(cè)。在樣品分析前，先運(yùn)行3次QC樣品；在樣品檢測(cè)過(guò)程中，每隔5個(gè)樣品運(yùn)行1次QC樣品。共運(yùn)行7次QC樣品，以監(jiān)控檢測(cè)系統(tǒng)的穩(wěn)定性。

1.3.3 色譜與質(zhì)譜檢測(cè)條件色譜條件：C18色譜柱：Waters HSS T3(150 mm×2.1 mm,2.5 μm)(側(cè)重分析極性小的小分子代謝物)，流動(dòng)相：A為H2O(含2 mmol/L甲酸銨+0.05%甲酸)，B為乙腈+異丙胺(體積比1∶1)；HILIC色譜柱：Acquity UPLC BEH Amide(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)(側(cè)重分析極性大的小分子代謝物)，流動(dòng)相：C為H2O(含10 mmol/L 甲酸銨+0.1%甲酸)，D為乙腈水(體積比95∶5)(含10 mmol/L 甲酸銨+0.1%甲酸),梯度洗脫程序見(jiàn)表1。流速：0.3 mL/min，進(jìn)樣盤(pán)溫度：4 ℃，柱溫：40 ℃，進(jìn)樣量：2 μL。

表1 不同色譜柱的流動(dòng)相梯度洗脫程序Table 1 Mobile phase gradient elutions in different chromatographic column

質(zhì)譜條件：采用AB SCIEX ExionLC AD & Triple TOF 5600+液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀進(jìn)行檢測(cè)，電噴霧離子化(ESI) 源正、負(fù)離子掃描模式；噴霧電壓(IS)：正離子5 500 V，負(fù)離子-4 500 V；離子化溫度(TEM)：550 ℃；霧化氣：414 kPa；輔助加熱氣：414 kPa；氣簾氣：241 kPa。一級(jí)質(zhì)譜采集范圍：m/z100～1 250，累積時(shí)間：0.10 s；去簇電壓：80 V。采用數(shù)據(jù)關(guān)聯(lián)采集(IDA)模式采集二級(jí)質(zhì)譜，采集范圍：m/z50～1 250，累積時(shí)間：0.05 s，去簇電壓：80 V；碰撞能量：(40±20) eV。IDA轉(zhuǎn)換標(biāo)準(zhǔn)為：信號(hào)強(qiáng)度>100 cps，分子量誤差為50 mDa，每個(gè)循環(huán)最多監(jiān)測(cè)10個(gè)離子，在4 Da內(nèi)排除同位素。采用Analyst TF 1.7.1軟件控制液相色譜-質(zhì)譜分析系統(tǒng)，并采集分析數(shù)據(jù)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

利用XCMSplus[16]對(duì)采集的數(shù)據(jù)進(jìn)行非靶向代謝組學(xué)分析，采用Centwave特征檢測(cè)算法(峰值寬度為5～20 s，質(zhì)量允差為5 ppm)進(jìn)行峰的發(fā)現(xiàn)和匹配，找到有差異的化合物，XCMSPlus軟件會(huì)自動(dòng)鏈接到METLIN數(shù)據(jù)庫(kù)(該庫(kù)有超過(guò)24萬(wàn)個(gè)代謝物信息，其中12 127個(gè)代謝物有高分辨二級(jí)圖譜)。結(jié)合SCIEX公司的內(nèi)源性代謝物二級(jí)譜庫(kù)(Metabolite HR MS2library，包含550多個(gè)常見(jiàn)內(nèi)源性代謝物的分子式、分子量、CAS編號(hào)、化學(xué)名、結(jié)構(gòu)圖)，通過(guò)與譜庫(kù)中化合物的精確一級(jí)m/z、同位素豐度比和二級(jí)質(zhì)譜信息比對(duì)，鑒定得到差異物，并對(duì)這些差異物進(jìn)行聚類(lèi)分析，找出差異通路。

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜分析

代謝物是根據(jù)測(cè)量的質(zhì)量數(shù)來(lái)確定，因此，持續(xù)準(zhǔn)確的質(zhì)量測(cè)量對(duì)于代謝組學(xué)實(shí)驗(yàn)至關(guān)重要。飛行時(shí)間(TOF)質(zhì)譜儀對(duì)溫度波動(dòng)很敏感，需定期校準(zhǔn)。本實(shí)驗(yàn)使用的AB SCIEX ExionLC AD & Triple TOF 5600+系統(tǒng)采用外部校準(zhǔn)方法，測(cè)量的質(zhì)量誤差控制在5 ppm以內(nèi)，可確保獲得的數(shù)據(jù)準(zhǔn)確有效。IDA模式下，在觸發(fā) TOF-MS/MS時(shí)，需要監(jiān)控TOF-MS/MS的最大數(shù)，這會(huì)影響數(shù)據(jù)采集的信息量。在最大限度地增加TOF-MS/MS事件數(shù)來(lái)提高子離子采集量的同時(shí)，也需確保色譜峰有足夠的采集數(shù)據(jù)點(diǎn)數(shù)。此外，質(zhì)量精度受離子積累時(shí)間的影響，當(dāng)積累時(shí)間設(shè)置過(guò)低時(shí)，獲得譜數(shù)較少，導(dǎo)致質(zhì)量精度較差。本實(shí)驗(yàn)采用的IDA方法為：掃描時(shí)間0.15 s和10個(gè)MS/MS事件，每個(gè)事件的子離子累積時(shí)間為0.05 s，循環(huán)時(shí)間為0.7 s，可使每個(gè)色譜峰均具有10～12個(gè)采集數(shù)據(jù)點(diǎn)，為質(zhì)譜的統(tǒng)計(jì)評(píng)價(jià)和代謝物鑒定提供了高質(zhì)量的TOF-MS和TOF-MS/MS數(shù)據(jù)。在對(duì)分析數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理前，首先對(duì)獲得的分析數(shù)據(jù)質(zhì)量和有效性進(jìn)行驗(yàn)證。數(shù)據(jù)有效性驗(yàn)證結(jié)果表明，QC樣品中分布于不同保留時(shí)間(tR)的代表性離子色譜峰強(qiáng)度的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)<5%，tR的漂移<0.1 min，m/z波動(dòng)范圍不超過(guò)5 ppm。對(duì)不同采集模式下運(yùn)行7次的QC樣品總離子流(TIC)色譜圖進(jìn)行比較，結(jié)果顯示7次QC樣品的TIC圖譜重合，無(wú)明顯偏差，確保了采集數(shù)據(jù)的有效性。

2.2 脾臟代謝輪廓分析

針對(duì)脾臟樣品中極性小和極性大的小分子代謝物，本研究分別采用C18和HILIC兩種不同的色譜柱進(jìn)行分離，以甲酸銨、甲酸與乙腈(添加異丙胺或水)為流動(dòng)相[17-18]梯度洗脫，并結(jié)合TOF-MS技術(shù)分別在正、負(fù)離子模式下對(duì)脾臟樣品進(jìn)行分離和數(shù)據(jù)采集，提高了非靶向分析的準(zhǔn)確性。圖1為不同采集模式下各組樣品典型的總離子流色譜圖(TIC)。由圖1可知，空白組和飼喂低聚硒化氨基多糖實(shí)驗(yàn)組相比，后者的指紋圖譜均多于前者，表明低聚硒化氨基多糖對(duì)黑鯛脾臟的內(nèi)源性代謝物有一定的影響。

通過(guò)XCMSplus軟件分析質(zhì)譜采集的數(shù)據(jù)，采用有監(jiān)督的主成分分析(PCA)法自動(dòng)進(jìn)行PCA輪廓分析，在正、負(fù)離子模式下，飼喂低聚硒化氨基多糖實(shí)驗(yàn)組和空白組的黑鯛脾臟代謝輪廓分析的PCA結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖2可知，在4種采集模式下，實(shí)驗(yàn)組與空白組均可明顯區(qū)分，無(wú)交叉和重疊，表明飼喂低聚硒化氨基多糖后，黑鯛脾臟代謝產(chǎn)物的指紋圖譜均發(fā)生了顯著變化。

2.3 潛在生物標(biāo)志物的鑒定

通過(guò)一級(jí)質(zhì)譜信息確定相對(duì)分子量，利用二級(jí)質(zhì)譜信息獲得其結(jié)構(gòu)碎片數(shù)據(jù)以鑒定潛在生物標(biāo)志物。將C18色譜柱和HILIC色譜柱在正、負(fù)離子模式下的質(zhì)譜檢測(cè)結(jié)果通過(guò)檢索Metabolite HR MS2library數(shù)據(jù)庫(kù)，共準(zhǔn)確鑒定出36個(gè)有差異的潛在生物標(biāo)志物(見(jiàn)表2)。以C18色譜柱在正離子掃描模式下的離子m/z148.060 1為例，該離子的保留時(shí)間為1.20 min，質(zhì)譜圖符合[M+H]+模式，其提取離子色譜圖與一級(jí)質(zhì)譜圖見(jiàn)圖3A和圖3B，與標(biāo)準(zhǔn)品的二級(jí)質(zhì)譜圖(3C)完全一致，確定該潛在生物標(biāo)志物為L(zhǎng)-谷氨酸。由表2可知，與空白組相比，實(shí)驗(yàn)組有27種生物標(biāo)志物的水平升高，有9種降低，說(shuō)明低聚硒化氨基多糖對(duì)黑鯛脾臟代謝水平具有顯著的調(diào)節(jié)作用。

圖3 正離子模式下L-谷氨酸的提取離子色譜圖(A)、一級(jí)質(zhì)譜圖(B)及標(biāo)準(zhǔn)品的二級(jí)質(zhì)譜圖(C)Fig.3 Extraction ion chromatogram(A),full MS spectrum(B) and standard MS/MS spectrum(C) of L-glutamic acid in positive ion mode

No.CompoundFormulaColumn/ioniza-tion modeTheoretical mass(Da)Experimental mass(Da)Error(ppm)tR(min)P-valueTrend1Ornithine(鳥(niǎo)氨酸)C5H12N2O2C18/-131.083 0131.082 62.951.088.93×10-12↓2L-Histidine(L-組氨酸)C6H9N3O2C18/-154.062 4154.062 20.991.081.15×10-12↑3L-Arginine(L-精氨酸)C6H14N4O2C18/+175.119 0175.118 7-1.511.082.21×10-9↓4Dimethylglycine(二甲基甘氨酸)C4H9NO2C18/+104.070 6104.070 4-1.921.148.64×10-12↓5L-Glutamine(L-谷氨酰胺)C5H10N2O3C18/+147.076 4147.076 3-0.471.172.30×10-12↑6L-Glutamic acid(L-谷氨酸)C5H9NO4C18/+148.060 4148.060 1-2.101.204.85×10-21↑7Betaine(甜菜堿)C5H11NO2C18/+118.086 3118.086 40.971.202.00×10-13↑8Creatine(肌酸)C4H9N3O2C18/+132.076 8132.076 5-2.141.213.37×10-20↑9L-Proline(L-脯氨酸)C5H9NO2C18/+116.070 6116.070 5-0.491.231.40×10-9↑10Glyceric acid(甘油酸)C3H6O4C18/-105.019 4105.019 30.691.262.11×10-10↑114-Guanidinobutanoic acid(4-胍基丁酸)C5H11N3O2C18/+146.092 4146.092 1-2.131.297.89×10-12↑12Adenine(腺嘌呤)C5H5N5C18/+136.061 8136.061 4-2.391.335.52×10-14↑13Uracil(尿嘧啶)C4H4N2O2C18/+113.034 6113.034 60.131.382.05×10-7↑

(續(xù)表2)

No.CompoundFormulaColumn/ioniza-tion modeTheoretical mass(Da)Experimental mass(Da)Error(ppm)tR(min)P-valueTrend14L-Methionine(L-蛋氨酸)C5H11NO2SC18/+150.058 3150.058 0-2.291.482.39×10-5↓15Uridine(尿苷)C9H12N2O6C18/-243.062 4243.062 30.641.633.41×10-8↑16L-Tyrosine(L-酪氨酸)C9H11NO3C18/+182.081 2182.081 30.631.641.11×10-10↓17Inosine(肌苷)C10H12N4O5C18/+269.088 0269.088 0-0.171.748.65×10-8↑18Guanosine(鳥(niǎo)嘌呤核苷)C10H13N5O5C18/+284.098 9284.099 10.411.771.53×10-16↑19L-Leucine(L-亮氨酸)C6H13NO2C18/+132.101 9132.101 8-0.951.943.85×10-12↑20L-Isoleucine(L-異亮氨酸)C6H13NO2C18/+132.101 9132.101 8-0.661.952.08×10-12↓21Deoxyguanosine(脫氧鳥(niǎo)苷)C10H13N5O4C18/+268.104 0268.104 10.321.962.27×10-11↑22Thymine(胸腺嘧啶)C5H6N2O2C18/-125.036 0125.035 72.832.041.91×10-9↑23L-Phenylalanine(L-苯丙氨酸)C9H11NO2C18/-164.072 1164.071 72.262.791.18×10-14↓24L-Tryptophan(L-色氨酸)C11H12N2O2C18/-203.083 4203.082 64.053.796.53×10-8↓25Succinic acid(琥珀酸)C4H6O4HILIC/-117.019 6117.019 32.673.837.84×10-13↓26Adenosine(腺苷)C10H13N5O4HILIC/+268.103 9268.104 0-0.394.882.04×10-12↑27Deoxycytidine(脫氧胞苷)C9H13N3O4HILIC/-226.083 5226.083 30.875.914.59×10-5↑28L-Threonine(L-蘇氨酸)C4H9NO3HILIC/+120.065 4120.065 5-0.957.801.11×10-19↑29L-Serine(L-絲氨酸)C3H7NO3HILIC/+106.049 9106.049 9-0.038.111.25×10-16↑30Adenosine monophosphate(腺苷一磷酸)C10H14N5O7PHILIC/+348.070 1348.070 4-0.898.171.40×10-21↑31γ-Aminobutyric acid(γ-氨基丁酸)C4H9NO2HILIC/-102.057 6102.057 3-2.728.191.87×10-24↑32Deoxyadenosine monophosphate(脫氧腺苷一磷酸)C10H14N5O6PHILIC/+332.074 8332.075 4-1.918.232.31×10-13↑33Uridine 5′-monophosphate(尿苷-5磷酸)C9H13N2O9PHILIC/-323.028 4323.028 6-0.618.231.96×10-18↑34D-Ribose 5-phosphate(D-核糖-5-磷酸)C5H11O8PHILIC/-229.012 0229.011 90.738.577.59×10-9↑35Guanosine monophosphate(鳥(niǎo)苷一磷酸)C10H14N5O8PHILIC/+364.066 6364.065 33.778.808.03×10-12↑36Argininosuccinic acid(精氨琥珀酸)C10H18N4O6HILIC/-289.115 6289.115 40.829.491.88×10-16↑

2.4 代謝途徑分析

根據(jù)鑒定出的潛在生物標(biāo)志物，利用MetaboAnalyst 4.0網(wǎng)站，選擇魚(yú)為分析模型進(jìn)行相關(guān)的代謝通路分析。經(jīng)過(guò)軟件分析，上述36種潛在生物標(biāo)志物主要指向9條代謝通路(P<0.05)，包括氨酰-轉(zhuǎn)運(yùn)RNA(tRNA)合成、氨基酸代謝、核苷酸代謝、氮代謝等(見(jiàn)表3)。

表3 36種潛在生物標(biāo)志物的代謝通路分析結(jié)果Table 3 Metabolic pathways results of 36 potential biomarkers

(續(xù)表3)

No.PathwayTotalHitsCompoundsP-Value8Alanine,aspartate and glu-tamate metabolism245Argininosuccinic acid,L-glutamic acid,γ-aminobutyric acid,L-glutamine,succinic acid0.041 030 09Pyrimidine metabolism416L-Glutamine,uridine 5′-monophosphate,uridine,deoxycytidine,uracil,thymine0.045 112 0

2.5 潛在生物標(biāo)志物的功能性分析

氨基酸是構(gòu)成機(jī)體免疫系統(tǒng)的基本物質(zhì)，與免疫系統(tǒng)的形成、器官發(fā)育以及功能的發(fā)揮有著密切關(guān)系。經(jīng)代謝通路分析發(fā)現(xiàn)，低聚硒化氨基多糖實(shí)驗(yàn)組與空白組相比，在氨基酸合成或代謝、氨酰-tRNA生物合成、嘌呤代謝、氮代謝上存在較顯著的差異(P<0.05)，潛在標(biāo)志物(表2)結(jié)果表明，在給予低聚硒化氨基多糖后共有 27個(gè)潛在標(biāo)志物的濃度水平顯著上調(diào)。代謝通路(表3)結(jié)果表明，有13個(gè)氨基酸代謝產(chǎn)物參與黑鯛脾臟的氨酰-tRNA生物合成通路，每種tRNA分子均需與相應(yīng)的氨基酸結(jié)合，將氨基酸運(yùn)送到核糖體進(jìn)行蛋白質(zhì)合成，若氨酰-tRNA合成通路發(fā)生障礙，蛋白質(zhì)的合成必受影響，進(jìn)而降低脾臟的免疫能力。有3個(gè)潛在標(biāo)志物參與了纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸的生物合成，亮氨酸和異亮氨酸屬于支鏈氨基酸，具有促進(jìn)蛋白質(zhì)合成、抑制蛋白質(zhì)分解的多種生理功能，其合成所需的碳骨架來(lái)源于糖無(wú)氧代謝和有氧代謝的中間產(chǎn)物，L-蘇氨酸和L-亮氨酸上調(diào)可能是通過(guò)參與機(jī)體能量代謝來(lái)促進(jìn)乳酸-葡萄糖的循環(huán)和通過(guò)促進(jìn)糖異生來(lái)維持糖原水平、緩解肌肉酸痛并延緩疲勞的發(fā)生發(fā)展[19-20]。結(jié)果顯示黑鯛脾臟的免疫功能與氨基酸代謝有密切關(guān)系。

在精氨酸和脯氨酸代謝通路中，與空白組相比，實(shí)驗(yàn)組中精氨酸的含量呈下降趨勢(shì)。精氨酸是魚(yú)類(lèi)的必需氨基酸之一，可促進(jìn)免疫系統(tǒng)分泌自然殺手細(xì)胞、吞噬細(xì)胞、白血球內(nèi)烯素等內(nèi)生性物質(zhì)，通過(guò)作用于哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)復(fù)合體Ⅰ[21-22]參與對(duì)抗癌細(xì)胞及預(yù)防病毒感染，提高機(jī)體免疫力。精氨酸代謝在調(diào)節(jié)先天免疫和適應(yīng)性免疫中同樣具有重要作用[23]。精氨酸及其代謝產(chǎn)物一氧化氮(NO)、鳥(niǎo)氨酸和瓜氨酸可通過(guò)生長(zhǎng)激素等內(nèi)分泌激素起到增強(qiáng)細(xì)胞吞噬和殺菌、促進(jìn)免疫球蛋白的合成等免疫調(diào)節(jié)作用[24-26]。在機(jī)體中精氨酸主要通過(guò)2個(gè)代謝途徑參與免疫調(diào)控[27-28]：其一為精氨酸酶途徑，即精氨酸轉(zhuǎn)化成鳥(niǎo)氨酸并進(jìn)一步生成多胺，鳥(niǎo)氨酸和多胺在動(dòng)物的免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要作用；另一途徑為精氨酸代謝成NO，NO不僅對(duì)巨噬細(xì)胞發(fā)揮吞噬效應(yīng)有重要作用，還對(duì)巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的連接和激活有影響，有助于提高免疫細(xì)胞的呼吸爆發(fā)活性、吞噬作用和溶菌酶的活力[29-30]。本實(shí)驗(yàn)中精氨酸含量的降低可能是由于硒化氨基多糖促進(jìn)精氨酸酶解為鳥(niǎo)氨酸和代謝為NO，從而增強(qiáng)機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)作用。谷氨酰胺[31-32]可以促進(jìn)巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的有絲分裂和分化增殖，增加機(jī)體的免疫功能。實(shí)驗(yàn)組和空白組中多種代謝生物標(biāo)志物的含量存在顯著差別，表明低聚硒化氨基多糖的免疫增強(qiáng)作用可能與氨基酸代謝密切相關(guān)。

3 結(jié) 論

本文采用UPLC-TOF-MS技術(shù)對(duì)飼喂低聚硒化氨基多糖的黑鯛脾臟進(jìn)行了代謝組學(xué)研究。采用C18和HILIC兩種色譜柱結(jié)合XCMSPlus軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，共篩選出36個(gè)有差異的潛在生物標(biāo)志物，均呈現(xiàn)一定的上調(diào)或下調(diào)趨勢(shì)。經(jīng)MetaboAnalyst4.0網(wǎng)站分析，發(fā)現(xiàn)飼喂低聚硒化氨基多糖對(duì)黑鯛的氨基酸合成或代謝、氨酰-tRNA生物合成、嘌呤代謝、氮代謝通路產(chǎn)生了影響，低聚硒化氨基多糖發(fā)揮免疫增強(qiáng)作用可能與氨基酸代謝有較為密切的關(guān)系。本研究從整體水平上反映了飼喂低聚硒化氨基多糖后黑鯛脾臟內(nèi)源性小分子的代謝變化，為深入探討低聚硒化氨基多糖的免疫增強(qiáng)機(jī)制奠定了一定基礎(chǔ)，并有助于黑鯛免疫增強(qiáng)劑的開(kāi)發(fā)。