伍娜娜，康 超，榮 娜，劉 祥，陳春琳，陳 琛，丁 銳，吳三橋

(1.陜西理工大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院/中德天然產(chǎn)物研究所，陜西 漢中 723001；2.陜西省天麻山茱萸工程技術(shù)研究中心，陜西 漢中 723001)

大腸桿菌(Escherichiacoli，E.coli)屬于革蘭氏陰性短桿菌，是一種人畜共患的機(jī)會(huì)性病原菌，在一定條件下可引起人類(lèi)的腦膜炎、腹瀉、敗血癥[1-4]，奶牛和奶山羊的乳房炎[5]，以及雞的肝周炎、心包炎、氣囊炎和臍炎等疾病[6]，不僅威脅人類(lèi)健康，給養(yǎng)殖業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，還會(huì)對(duì)奶制品帶來(lái)巨大的安全隱患。目前，大腸桿菌引起感染性疾病的主要治療藥物是抗生素[7]，但大量使用抗生素會(huì)使細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性[8-9]，因此迫切需要深入研究其耐藥機(jī)制，并開(kāi)發(fā)疫苗來(lái)防治大腸桿菌病[10]。

在致病性的大腸桿菌中，外膜蛋白是其產(chǎn)生致病性的主要因素[11]。大腸桿菌外膜蛋白F(Outer membrane protein F，OmpF)是由16個(gè)反平行β鏈和8個(gè)連接環(huán)形成的三聚體桶狀結(jié)構(gòu)[12-13]，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和抗生素大多經(jīng)過(guò)此通道進(jìn)出菌體。研究發(fā)現(xiàn)，OmpF蛋白的表達(dá)量差異可導(dǎo)致細(xì)胞膜的通透性改變，這與細(xì)菌的耐藥性密切相關(guān)[14-16]。此外，OmpF蛋白具有高度免疫原性，WANG等[2]免疫小鼠后發(fā)現(xiàn)，大腸桿菌OmpF蛋白可激活小鼠機(jī)體免疫反應(yīng)，產(chǎn)生特異性抗體，并能有效抵抗大腸桿菌侵染，可作為大腸桿菌病的候選疫苗。

本研究通過(guò)克隆大腸桿菌ompF基因，探究OmpF蛋白表達(dá)菌株最佳的表達(dá)條件及培養(yǎng)條件，將純化后的OmpF蛋白免疫小鼠，制備小鼠OmpF多克隆抗體，然后通過(guò)Western blotting檢測(cè)抗OmpF抗體的特異性，并借助生物信息學(xué)方法進(jìn)行OmpF蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系分析，為進(jìn)一步研究OmpF蛋白結(jié)構(gòu)和功能提供基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

E.coliK12、E.coliDH5α和E.coliBL21菌株以及pET-32a質(zhì)粒由陜西理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存；Taq酶、T4-DNA連接酶、DNA Marker、限制性?xún)?nèi)切酶XhoⅠ與BamHⅠ購(gòu)于TaKaRa公司；蛋白質(zhì)Marker購(gòu)于北京安諾倫生物科技有限公司；質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)于北京佰億新創(chuàng)科技有限公司；DNA膠回收試劑盒購(gòu)于杭州博日科技有限公司；引物合成和基因測(cè)序均由北京奧科鼎盛生物科技有限公司完成；昆明鼠購(gòu)于西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 大腸桿菌ompF基因重組質(zhì)粒構(gòu)建

根據(jù)從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)獲得的E.coliK12菌株ompF基因序列(登錄號(hào)：NC_000913.3)，用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)ompF基因引物，Primer 1：5′-TTCGGATCCATGATGAAGCGCAATATT-3′；Primer 2：5′-AGTCTCGAGTTAGAACTGGTAAACGAT-3′，分別在Primer 1和Primer 2兩端加入限制性?xún)?nèi)切酶位點(diǎn)BamHⅠ和XhoⅠ(劃線序列)與保護(hù)堿基。對(duì)目的基因ompF進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸150 s，共35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃充分延伸10 min，16 ℃保存。吸取2 μL的PCR產(chǎn)物于0.8%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳。用DNA膠回收試劑盒從瓊脂糖凝膠中回收目的基因產(chǎn)物，雙酶切后將回收的片段連接到pET-32a質(zhì)粒載體，然后轉(zhuǎn)化至E.coliDH5α中，重組質(zhì)粒通過(guò)BamHⅠ及XhoⅠ限制性?xún)?nèi)切酶消化后，進(jìn)行電泳分析，對(duì)陽(yáng)性重組克隆進(jìn)行測(cè)序，將測(cè)序正確的ompF重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入E.coliBL21菌株，構(gòu)建ompF重組表達(dá)菌株。

1.3 大腸桿菌OmpF蛋白表達(dá)鑒定及純化

將轉(zhuǎn)入ompF重組質(zhì)粒的E.coliBL21菌株置于5 mL的LB培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min過(guò)夜培養(yǎng)，然后吸取500 μL轉(zhuǎn)接至5 mL新鮮LB培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)3 h，添加終濃度為0.5 mmol/L的IPTG再誘導(dǎo)6 h，8 000 r/min、4 ℃離心5 min收集菌體，沸水浴煮樣5 min后進(jìn)行12%的SDS-PAGE電泳，對(duì)OmpF蛋白進(jìn)行純化。

1.4 大腸桿菌OmpF蛋白表達(dá)條件優(yōu)化

為獲得蛋白質(zhì)最優(yōu)的表達(dá)條件，用L9(34)正交試驗(yàn)?zāi)Ｐ蚚17]，包括表達(dá)菌株的最優(yōu)培養(yǎng)條件及蛋白質(zhì)的最優(yōu)誘導(dǎo)表達(dá)條件2種，因子與水平分別如表1和表2所示。

表2 大腸桿菌OmpF蛋白誘導(dǎo)條件正交試驗(yàn)因子與水平 Tab.2 The factor and level of orthogonal experiment for E.coli OmpF induction

OmpF表達(dá)菌株培養(yǎng)條件的正交試驗(yàn)過(guò)程：將OmpF表達(dá)菌株接入5 mL的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min搖床培養(yǎng)過(guò)夜，吸取1 mL培養(yǎng)后菌液轉(zhuǎn)接入表1條件下所配置的新鮮培養(yǎng)液中，依據(jù)正交試驗(yàn)?zāi)Ｐ鸵?，培養(yǎng)OmpF表達(dá)菌株8 h后記錄所得菌液的OD600值，并對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差和極差分析，獲得菌株最佳培養(yǎng)條件。

表達(dá)菌株的蛋白質(zhì)誘導(dǎo)條件正交試驗(yàn)過(guò)程：依據(jù)表達(dá)菌株最優(yōu)的培養(yǎng)條件，將OmpF菌株接入新鮮LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min快速培養(yǎng)菌液到表2條件下不同OD600值時(shí)，再依據(jù)正交試驗(yàn)?zāi)Ｐ鸵?，加入IPTG誘導(dǎo)OmpF蛋白的表達(dá)。吸取1 mL誘導(dǎo)一定時(shí)間后的菌液于10 000 r/min離心1 min，收集沉淀并加入300 μL的2×SDS Loading buffer徹底混勻，沸水中煮樣5 min，上樣量為10 μL，用SDS-PAGE對(duì)總蛋白進(jìn)行分析。采用凝膠分析軟件(Phoretix 1D)對(duì)電泳后得到的OmpF蛋白表達(dá)圖譜進(jìn)行光密度分析，并用SPSS 21.0軟件進(jìn)行不同因子的顯著性分析[17]。

1.5 大腸桿菌OmpF蛋白多克隆抗體制備

選取體質(zhì)量約20 g的昆明鼠作為供試小鼠。取100 μg弗氏完全佐劑乳化后的純化重組蛋白對(duì)每只小鼠進(jìn)行免疫，間隔14 d后，用相同劑量的抗原和弗氏不完全佐劑進(jìn)行加強(qiáng)免疫，然后于間隔7 d后進(jìn)行第2次加強(qiáng)免疫。于末次加強(qiáng)免疫7 d后，收集小鼠血液，進(jìn)行血清分離，用于進(jìn)行Western blotting[18]。

1.6 Western blotting對(duì)大腸桿菌OmpF蛋白多克隆抗體特異性的檢測(cè)

以健康血清作為陰性對(duì)照，并將純化后的重組OmpF蛋白經(jīng)12%的SDS-PAGE凝膠電泳進(jìn)行分離。在4 ℃下將凝膠上出現(xiàn)單一條帶的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，將膜置于含有5%脫脂牛奶的1.5中制備的小鼠抗血清(1∶400稀釋)TNT緩沖液中，于37 ℃溫育1 h，然后用TNT緩沖液洗滌后，將膜置于山羊抗鼠二抗中，4 ℃孵育過(guò)夜，最后用TNT緩沖液清洗后使用DAB進(jìn)行顯色[19]。

1.7 大腸桿菌OmpF蛋白生物信息學(xué)分析

依據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中獲取的氨基酸序列，利用DNAMAN 8.0軟件對(duì)不同菌株OmpF蛋白序列進(jìn)行同源性分析，利用MEGA 5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，通過(guò)String蛋白質(zhì)相互作用預(yù)測(cè)網(wǎng)站http://www.string-db.org/，預(yù)測(cè)OmpF與其他蛋白質(zhì)的互作關(guān)系網(wǎng)絡(luò)。

2 結(jié)果與分析

2.1 大腸桿菌ompF基因重組質(zhì)粒的構(gòu)建

利用PCR擴(kuò)增技術(shù)從E.coliK12基因組中擴(kuò)增出1 089 bp的ompF基因產(chǎn)物(圖1)。將其克隆到表達(dá)載體pET-32a中，構(gòu)建pET-32a-ompF質(zhì)粒，并利用限制性?xún)?nèi)切酶BamHⅠ和XhoⅠ對(duì)重組表達(dá)質(zhì)粒pET-32a-ompF進(jìn)行消化，得到約1 000 bp的條帶，與目的基因大小一致(圖2)。對(duì)陽(yáng)性重組克隆進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)公布的ompF基因序列(GenBank：NC_000913.3)具有100%同源性。

M：DL2000 DNA Marker; 1：ompF基因M：DL2000 DNA Marker; 1：ompF gene圖1 大腸桿菌ompF基因的PCR擴(kuò)增Fig.1 PCR amplification of E.coli ompF gene

M：DL2000 DNA Marker; 1：pET-32a-ompF重組表達(dá)質(zhì)粒; 2：pET-32a-ompF重組表達(dá)質(zhì)粒經(jīng)BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切M：DL2000 DNA Marker; 1：pET-32a-ompF plasmid; 2：pET-32a-ompF plasmid digested by BamHⅠ and XhoⅠ圖2 pET-32a-ompF重組表達(dá)質(zhì)粒的雙酶切結(jié)果Fig.2 Identification of pET-32a-ompF recombinantplasmid by restriction enzyme analysis of BamHⅠ and XhoⅠ

2.2 大腸桿菌OmpF蛋白的表達(dá)與純化

選用測(cè)序正確的重組克隆菌株，用IPTG誘導(dǎo)重組OmpF蛋白在E.coliBL21中表達(dá)時(shí)發(fā)現(xiàn)，誘導(dǎo)6 h時(shí)可獲得OmpF蛋白的高表達(dá)，如圖3所示，SDS-PAGE電泳分離獲得分子質(zhì)量約為58.4 ku的蛋白質(zhì)條帶，表達(dá)量和純度均較高，包含理論分子質(zhì)量約為38 ku的OmpF蛋白和20.4 ku的pET-32a質(zhì)粒融合蛋白標(biāo)簽，然后用SDS-PAGE電泳切膠的方法，得到純化的OmpF蛋白。

M：蛋白質(zhì)分子標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)量; 1：未誘導(dǎo)菌株; 2：IPTG誘導(dǎo)菌株; 3：純化的OmpF蛋白M：Protein marker; 1：Uninduced strain; 2:IPTG induced strain; 3:Purified OmpF protein圖3 大腸桿菌OmpF蛋白的表達(dá)與純化 Fig.3 Expression and purification of recombinant E.coli OmpF protein

2.3 大腸桿菌OmpF蛋白表達(dá)菌株的最適培養(yǎng)條件

對(duì)大腸桿菌OmpF蛋白表達(dá)菌株的培養(yǎng)條件進(jìn)行正交試驗(yàn)探索，如表3所示獲得OmpF蛋白菌株在600 nm處的OD值后，用SPSS 21.0對(duì)其進(jìn)行極差分析顯示，對(duì)OmpF蛋白表達(dá)菌株生長(zhǎng)的影響由大到小為裝液量>轉(zhuǎn)速>葡萄糖濃度，以培養(yǎng)基的裝液量為50 mL、葡萄糖濃度為0、搖床轉(zhuǎn)速為230 r/min條件下，OmpF蛋白表達(dá)菌株的量最高(表4)，表明該條件為OmpF蛋白的最佳表達(dá)條件。此外，方差分析結(jié)果表明，3個(gè)因子均達(dá)到極顯著水平，表明這些因子對(duì)重組表達(dá)菌株的生長(zhǎng)均起到重要作用(表5)。

表3 大腸桿菌OmpF蛋白表達(dá)菌株的培養(yǎng)結(jié)果 Tab.3 The results of 3 experiment for culture of E.coliOmpF protein expressing strain

表4 大腸桿菌OmpF蛋白表達(dá)菌株培養(yǎng)條件的極差分析 Tab.4 The range results for culture condition of E.coli OmpF protein expressing strain

表5 大腸桿菌OmpF蛋白表達(dá)菌株培養(yǎng)條件的方差分析 Tab.5 The variance results for culture condition of E.coli OmpF protein expressing strain

注：**表示相對(duì)于對(duì)照組，達(dá)到了極顯著水平(P<0.01),表8同。

Note：** means the difference with control group is significant (P<0.01).The same as Tab.8.

2.4 大腸桿菌OmpF蛋白表達(dá)菌株的誘導(dǎo)條件

如圖4所示，將3次重復(fù)試驗(yàn)收集到的OmpF蛋白表達(dá)菌株進(jìn)行SDS-PAGE電泳表明，不同誘導(dǎo)條件下的OmpF蛋白表達(dá)量存在差異。如表6所示，對(duì)電泳圖譜蛋白條帶進(jìn)行光密度值分析表明，相同誘導(dǎo)條件下的OmpF蛋白表達(dá)量值重復(fù)性較高。對(duì)光密度值進(jìn)行極差分析表明，在添加IPTG誘導(dǎo)菌體后，當(dāng)菌液OD600為0.5時(shí)，添加終濃度為0.1 mmol/L的IPTG，于28 ℃誘導(dǎo)8 h，OmpF蛋白的表達(dá)量最高，且在4個(gè)影響因子中，誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)OmpF蛋白表達(dá)的影響最大，其次為誘導(dǎo)溫度，再次是IPTG誘導(dǎo)菌液OD600值，最后為IPTG濃度(表7)。此外，方差分析結(jié)果顯示，添加IPTG誘導(dǎo)時(shí)的誘導(dǎo)溫度及誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)OmpF蛋白表達(dá)的影響達(dá)到極顯著水平(表8)。

M:蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1:陰性對(duì)照；2—4:OD600值為0.5時(shí)，誘導(dǎo)溫度分別為28、32、37 ℃；5—7:OD600值為0.8時(shí)，誘導(dǎo)溫度分別為28、32、37 ℃；8—10:OD600值為1.0時(shí)，誘導(dǎo)溫度分別為28、32、37 ℃M:Protein marker； 1:Negative control; 2—4:OD600 value of 0.5,inducing temperatures were 28,32,37 ℃, respectively; 5—7:OD600 value of 0.8,inducing temperatures were 28,32,37 ℃,respectively; 8—10:OD600 value of 1.0,inducing temperature were 28,32,37 ℃,respectively圖4 正交試驗(yàn)獲得的大腸桿菌OmpF蛋白SDS-PAGE電泳圖譜Fig.4 SDS-PAGE analysis of E.coli OmpFprotein from orthogonal experiment

部分試驗(yàn)編號(hào)Partial Test number試驗(yàn)組光密度(×106)Experimental group optical density value123均值±標(biāo)準(zhǔn)差(×106)Average±Standard deviationE1F1G1H11.0441.3551.1171.172±0.163E1F2G2H21.2051.4161.8241.482±0.315E1F3G3H31.3790.9791.2691.209±0.207E2F1G2H31.1961.1221.2271.182±0.054E2F2G3H11.3121.2311.5421.362±0.161E2F3G1H20.8330.5690.9240.775±0.184E3F1G3H21.4441.2761.4381.386±0.095E3F2G1H30.6060.9660.6880.753±0.189E3F3G2H11.5161.4981.4951.503±0.011

2.5 Western blotting檢測(cè)大腸桿菌OmpF蛋白多克隆抗體的特異性

如圖5所示，純化的OmpF蛋白多克隆抗體通過(guò)免疫印跡反應(yīng)產(chǎn)生單一且清晰的條帶，表明獲得的OmpF蛋白多克隆抗體具有高度特異性。

表7 大腸桿菌OmpF蛋白表達(dá)圖數(shù)據(jù)的極差分析Tab.7 The range results of E.coli OmpFprotein expressing map data

表8 大腸桿菌OmpF蛋白表達(dá)圖數(shù)據(jù)的方差分析Tab.8 The variance results of E.coli OmpFprotein expressing map data

1:陰性對(duì)照(1∶400倍稀釋的血清)；2:1∶400倍稀釋的抗血清1:Negative control (dilution proportion of antibodies was 1∶400); 2:Dilution proportion of antibodies was 1∶400圖5 Western blotting檢測(cè)大腸桿菌OmpF蛋白多克隆抗體的特異性Fig.5 Identification of the specificity of E.coli OmpFpolyclonal antibodies by Western blotting

2.6 大腸桿菌OmpF蛋白進(jìn)化關(guān)系分析

如圖6所示，用DNAMAN 8.0軟件對(duì)12種致病菌的OmpF蛋白序列進(jìn)行比對(duì)表明，曼氏假單胞菌、惡臭假單胞菌和嗜水氣單胞菌這3種細(xì)菌具有最高的同源性；除去這3種菌，其他細(xì)菌也具有較高的同源性，可能是由于OmpF蛋白的功能在這些細(xì)菌中具有相似性。如圖7所示，通過(guò)MEGA 5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)顯示，大腸桿菌與沙門(mén)氏菌、肺炎克雷伯菌、黏質(zhì)沙雷氏菌存在較近的親緣關(guān)系，其產(chǎn)生的特異性抗體，可能對(duì)親緣關(guān)系較近細(xì)菌的感染存在交叉免疫保護(hù)作用。

圖6 大腸桿菌OmpF蛋白氨基酸序列同源性分析Fig.6 Homology analysis for amino acid sequence of E.coli OmpF

圖7 MEGA 5.0軟件構(gòu)建的大腸桿菌OmpF氨基酸序列系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.7 Phylogentic tree based on E.coli OmpF amino acid sequences by MEGA 5.0

2.7 大腸桿菌OmpF蛋白作用網(wǎng)絡(luò)分析

如圖8所示，通過(guò)String方法對(duì)大腸桿菌OmpF蛋白進(jìn)行預(yù)測(cè)可知，大腸桿菌OmpF蛋白與10種蛋白質(zhì)存在相互作用，其中tut蛋白、lamB蛋白、tsx蛋白與OmpF蛋白作用更為緊密。

圖8 大腸桿菌OmpF相互作用蛋白質(zhì)預(yù)測(cè)Fig.8 Protein-protein interaction prediction of E.coli OmpF protein

3 結(jié)論與討論

致病性大腸桿菌可分為腸致病性、腸產(chǎn)毒性、腸侵襲性、腸出血性、腸黏附性和彌散黏附性大腸桿菌，是臨床感染中的主要病原體[20]。目前，臨床上主要采用抗生素防治大腸桿菌病，但極易出現(xiàn)耐藥性。對(duì)大腸桿菌引起的疾病尚無(wú)理想的疫苗來(lái)預(yù)防，開(kāi)發(fā)蛋白質(zhì)疫苗并研究其耐藥機(jī)制是預(yù)防和控制大腸桿菌病的最有效途徑之一[10]。

多克隆抗體以其成本低、周期短及效果好而應(yīng)用廣泛[21]，且使用原核表達(dá)蛋白免疫小鼠制備多克隆抗體是最為常見(jiàn)的方法之一[22]。本研究利用純化蛋白制備了特異性較好的大腸桿菌OmpF蛋白多克隆抗體，為研究大腸桿菌OmpF蛋白的生物學(xué)功能與相關(guān)疫苗開(kāi)發(fā)提供了良好的生物學(xué)基礎(chǔ)材料。

本研究探索了大腸桿菌OmpF蛋白菌株的培養(yǎng)條件和表達(dá)條件。結(jié)果表明，在未誘導(dǎo)時(shí)，培養(yǎng)基裝液量為50 mL，不添加葡萄糖，搖床轉(zhuǎn)速230 r/min時(shí)菌株表達(dá)水平最高；培養(yǎng)基中添加IPTG誘導(dǎo)時(shí)，菌液OD600為0.5，添加0.1 mmol/L的IPTG，誘導(dǎo)時(shí)間和誘導(dǎo)溫度分別為8 h和28 ℃時(shí)，OmpF蛋白表達(dá)量最高。研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)速較高或裝液量較小，培養(yǎng)基中的溶氧濃度較大，有利于菌的生長(zhǎng)[17]。此外，當(dāng)菌體處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期，菌體活性較高，生長(zhǎng)代謝能力強(qiáng)，蛋白質(zhì)合成旺盛[23]，此時(shí)加入IPTG誘導(dǎo)利于大量表達(dá)OmpF蛋白，與本試驗(yàn)在600 nm波長(zhǎng)處吸光度為0.5時(shí)添加IPTG結(jié)果一致。IPTG對(duì)細(xì)菌有毒性，高濃度的IPTG會(huì)影響細(xì)菌的生長(zhǎng)和蛋白質(zhì)的表達(dá)[24]，本研究進(jìn)一步證實(shí)添加低濃度的IPTG，利于OmpF蛋白的表達(dá)。有研究發(fā)現(xiàn)，降低菌體的生長(zhǎng)溫度，利于活性蛋白的表達(dá)，可有效減少不溶性包涵體的形成[25]。本研究也發(fā)現(xiàn)低溫利于OmpF蛋白的表達(dá)。適度的誘導(dǎo)時(shí)間，不僅更有利于融合蛋白的表達(dá)[26-27]，而且降低了成本，這與本研究結(jié)果一致。本研究為大量獲得OmpF蛋白用于其功能研究奠定了基礎(chǔ)。

此外，本研究發(fā)現(xiàn)多種細(xì)菌OmpF蛋白具較高的同源性，表明這些種類(lèi)細(xì)菌中OmpF蛋白參與的抗生素耐藥機(jī)制可能相近；OmpF蛋白產(chǎn)生的抗體，可能為多種細(xì)菌感染提供交叉免疫保護(hù)作用，從而實(shí)現(xiàn)單次免疫OmpF蛋白同時(shí)抵御不同種細(xì)菌的感染，為開(kāi)發(fā)廣譜抑菌的OmpF蛋白疫苗制劑提供了依據(jù)。