張家慶，武松霞，任巧玲，王獻(xiàn)偉，陳俊峰，王 璟，白獻(xiàn)曉，邢寶松

(1.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 畜牧獸醫(yī)研究所，河南 鄭州 450002； 2.河南省標(biāo)準(zhǔn)化研究院，河南 鄭州 450008； 3.河南省畜牧總站，河南 鄭州450008)

豬的繁殖力是養(yǎng)豬生產(chǎn)中一項(xiàng)重要的經(jīng)濟(jì)指標(biāo)，直接影響?zhàn)B豬成本和經(jīng)濟(jì)效益的高低。而產(chǎn)仔數(shù)是繁殖性狀中最重要的性狀，也是決定豬場經(jīng)濟(jì)效益的關(guān)鍵因素。據(jù)著名動物數(shù)量遺傳學(xué)家Chris計(jì)算，如果產(chǎn)仔數(shù)每胎提高1頭，英國養(yǎng)豬業(yè)每年就可多獲純利7億英鎊，相應(yīng)地計(jì)算，在我國則每年將增收上百億元的純利[1]。因此，找到影響產(chǎn)仔數(shù)的基因具有重要的經(jīng)濟(jì)及科研價(jià)值。但是豬繁殖性狀屬于限性表達(dá)的低遺傳力性狀，運(yùn)用常規(guī)育種方法很難取得理想的遺傳進(jìn)展[2]。從生殖的角度來看，豬窩產(chǎn)仔數(shù)的高低主要取決于排卵數(shù)和胚胎成活率，而排卵率是窩產(chǎn)仔數(shù)的第1個限制因素，決定了窩產(chǎn)仔數(shù)的上限。因此，增加排卵數(shù)量是提高窩產(chǎn)仔數(shù)的有效途徑。

豬是多胎動物，在正常發(fā)情周期中每次募集的卵泡數(shù)超過50個，但僅有10～25個卵泡可發(fā)育至成熟并排卵，約有50%的中等卵泡(3～6 mm)在選擇過程中發(fā)生閉鎖[3-4]。目前的研究表明，卵泡閉鎖的實(shí)質(zhì)是顆粒細(xì)胞的凋亡，已發(fā)現(xiàn)許多基因?qū)︻w粒細(xì)胞凋亡具有直接或間接的調(diào)控作用[5]。MicroRNA(miRNA)是一類長度為21～23 bp的非編碼RNA，可通過抑制靶基因的翻譯或降解目的基因mRNA來反向調(diào)節(jié)目的基因的表達(dá)[6]。近年來，眾多研究表明，miRNA在卵泡發(fā)育和閉鎖中起著重要的調(diào)控作用[7]。例如，研究人員發(fā)現(xiàn)，小鼠中的miR-21作為一種抗凋亡因子，能抑制排卵期顆粒細(xì)胞的凋亡[8]；雄激素可上調(diào)miR-125b的表達(dá)，進(jìn)而抑制促凋亡蛋白表達(dá)并促進(jìn)卵泡發(fā)育[9]；miR-133b可靶向插頭轉(zhuǎn)錄因子12(Forkhead box12，F(xiàn)ox12)促進(jìn)顆粒細(xì)胞中雌二醇的合成[10]。在豬顆粒細(xì)胞凋亡中，LIU等[11]研究表明，過表達(dá)胞漿內(nèi)信號級聯(lián)分子SMAD4(Similar to mothers against decapentaplegic homologue-4)可促進(jìn)顆粒細(xì)胞增殖，敲減SMAD4基因則可促進(jìn)顆粒細(xì)胞凋亡，而過表達(dá)或抑制miR-26b能顯著抑制或促進(jìn)顆粒細(xì)胞中SMAD4基因的表達(dá)，表明miR-26b可通過靶向SMAD4基因發(fā)揮促凋亡的調(diào)控作用；WANG等[12]研究表明，F(xiàn)OXO3(Forkhead box O3，F(xiàn)OXO3)轉(zhuǎn)錄因子在豬顆粒細(xì)胞凋亡中發(fā)揮關(guān)鍵作用，而miR-34c可靶向FOXO3來調(diào)控豬顆粒細(xì)胞的功能[13]。近年來，大量人類疾病相關(guān)miRNA的研究表明，miR-149參與了炎癥、凋亡、肺纖維化等關(guān)鍵過程[14]，并具有抵御外界應(yīng)激和抗凋亡的功能[15]。而炎癥、凋亡相關(guān)因子是誘發(fā)卵泡閉鎖的重要因素。目前，有關(guān)miR-149對豬顆粒細(xì)胞凋亡的影響機(jī)制尚不清楚，因此，利用生物信息學(xué)的方法對ssc-miR-149進(jìn)行轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測、物種間保守性分析、靶基因預(yù)測、靶基因GO和KEGG信號通路富集分析，揭示其可能存在的轉(zhuǎn)錄因子，以及靶基因參與調(diào)控的生物過程和信號通路，進(jìn)而對其在豬顆粒細(xì)胞凋亡中的功能進(jìn)行探索，為ssc-miR-149在豬卵泡閉鎖中的研究提供理論指導(dǎo)。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和儀器

反轉(zhuǎn)錄酶M-MLV、熒光定量PCR Mix(TaKaRa生產(chǎn))；miRNA提取試劑盒、TaqMan miRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒、反轉(zhuǎn)錄引物、定量PCR引物和U6SnRNA(哈爾濱新?；驒z測有限公司)；miRNA擬似物、抑制物(上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成)；MTT試劑盒(南京建成生物工程研究所生產(chǎn))；TRIZOL、Lipofectamine2000(Invitrogen生產(chǎn))；F12培養(yǎng)基、抗生素(GIBCO生產(chǎn))；mRNA 定量PCR引物(上海生工公司合成)；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(Roche生產(chǎn))；核酸蛋白檢測儀(NANODROP生產(chǎn))。

1.2 豬顆粒細(xì)胞分離與培養(yǎng)

供試卵巢采自于鄭州市惠濟(jì)區(qū)屠宰場體質(zhì)量約為(115±5)kg的商品母豬。選擇屠宰后處于卵泡期且發(fā)育良好的卵巢，取下后立刻放入含有雙抗(青霉素100 IU/L、鏈霉素50 mg/L)的37 ℃生理鹽水中，暫存于保溫瓶，并于1～2 h內(nèi)進(jìn)行后續(xù)操作。用含有雙抗的生理鹽水清洗卵巢3次后，用10 mL注射器選擇直徑為3～5 mm的卵泡進(jìn)行顆粒細(xì)胞采集，并將其置于15 mL離心管中，1 000 r/min離心5 min以去除卵泡液。所得顆粒細(xì)胞沉淀用PBS洗滌2次，每次洗滌后以1 000 r/min離心5 min，然后棄除PBS。用1 mL含有胎牛血清和雙抗體積分?jǐn)?shù)為10%的DMEM/F12完全培養(yǎng)基重懸顆粒細(xì)胞，將1 mL的顆粒細(xì)胞懸液接種于T25培養(yǎng)瓶中(已提前放置培養(yǎng)箱內(nèi)預(yù)熱)，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3 miR-149 mimic轉(zhuǎn)染及H2O2氧化損傷處理豬顆粒細(xì)胞

將生長對數(shù)期的豬顆粒細(xì)胞消化混勻成1×106～1.5×106個/mL的細(xì)胞懸液，取0.2 mL接種至96孔板內(nèi)，培養(yǎng)6～12 h后進(jìn)行轉(zhuǎn)染(此時(shí)所用培養(yǎng)基不含雙抗)，按照Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染說明書進(jìn)行。轉(zhuǎn)染分組如下：空白對照組(Blank)，即未轉(zhuǎn)染組；陰性對照組(NC)，即miR-149-NC空載體轉(zhuǎn)染組；轉(zhuǎn)染miR-149 mimic組。轉(zhuǎn)染48 h后，所有組別均用150 μmol/L H2O2處理6 h。qPCR檢測中ssc-miR-149引物序列為：正向5′-UCUGGCUCCGUGUCUUCACUCCC-3′，反向5′-GAGUGAAGACACGGAGCCAGAUU-3′；NC引物序列為：正向5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′，反向5′-ACGUGA

CACGUUCGGAGAATT-3′。

1.4 MTT分析

按照1.2和1.3中方法進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染，然后按照MTT試劑盒操作說明書對細(xì)胞進(jìn)行處理，利用全波長酶標(biāo)儀測定570 nm處的吸光度。

1.5 熒光定量PCR檢測

按照miRNA 提取試劑盒提取miRNA，并用核酸蛋白檢測儀檢測純度和濃度，符合要求的miRNA進(jìn)行qRT-PCR檢測。采用TRIZOL法提取豬顆粒細(xì)胞的總RNA，通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA，核酸蛋白檢測儀檢測相應(yīng)純度和濃度，將符合要求的RNA使用反轉(zhuǎn)錄酶M-MLV進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，然后進(jìn)行qPCR檢測。擴(kuò)增體系為20 μL：cDNA 2 μL，上下游引物(10 μmol/L)各0.8 μL，2×SYBR ExTaqⅡ 10 μL，dH2O 6.4 μL；擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃ 3 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，40個循環(huán)。本研究采用相對定量qPCR法，miRNA的內(nèi)參基因?yàn)閁6SnRNA，mRNA內(nèi)參基因?yàn)镚APDH。PUMA基因擴(kuò)增引物序列為F：5′-GGATGGCTGACGATCTCA-3′；R：5′-TGGGTAAGGGCAGAAGTC-3′，產(chǎn)物大小為120 bp，其他引物序列參照已發(fā)表文獻(xiàn)[16-17]。

1.6 ssc-miR-149生物信息學(xué)分析

1.6.1 ssc-miR-149轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)(TFBS)預(yù)測 利用Ensembl和NCBI數(shù)據(jù)庫分別檢索ssc-miR-149基因前體，然后取其上游2 000 bp的序列，分別應(yīng)用JASPAR(http://jaspardev.genereg.net/)和PROMO(http://alggen.lsi.upc.es/cgi-bin/promo_v3/promo/promoinit.cgi?dirDB=TF_8.3)2個在線預(yù)測軟件對ssc-miR-149進(jìn)行TFBS預(yù)測。

1.6.2 ssc-miR-149物種間保守性分析 從miRBase(http://www.mirbase.org/search.shtml)中檢索出野豬(Susscrofa)、人(Homosapiens)、小鼠(Musmusculus)、黑猩猩(Pantroglodytes)、牛(Bostaurus)、獼猴(Macacamulatta)、狗(Canisfamiliaris)的ssc-miR-149序列，分析其保守性。

1.6.3 ssc-miR-149靶基因預(yù)測 為了探索ssc-miR-149的生物學(xué)功能，選擇TargetScan(http://www.targetscan.org/vert_71/)、miRanda(http://www.microrna.org/microrna/getGeneForm.do)和RNAhybrid(http://bibiserv.cebitec.uni-bielefeld.de/rnahybrid/)3個軟件對ssc-miR-149進(jìn)行靶基因預(yù)測。最后取3個軟件的交集，并結(jié)合miR-149的靶基因，共同組成ssc-miR-149的靶基因集合，用于下一步的研究分析。

1.6.4 靶基因GO富集性分析 利用DAVID工具[18](https://david-d.ncifcrf.gov/)對ssc-miR-149預(yù)測的靶基因集合進(jìn)行分子功能(Molecular function，MF)、所處的細(xì)胞位置(Cellular component，CC)、參與的生物過程(Biological process，BP)3個層面的GO注釋層次分類及富集分析，通過Fisher’s exact test計(jì)算得到P值，以P<0.05為閾值，獲得顯著富集的靶基因GO條目。

1.6.5 靶基因KEGG信號通路富集性分析 在DAVID網(wǎng)站中選擇“Pathways”下的“KEGG_PATHWAY”對ssc-miR-149預(yù)測的靶基因集合進(jìn)行生物學(xué)通路富集分析，通過Fisher’s exact test計(jì)算得到P值，以P<0.05為閾值，獲得顯著富集的KEGG信號通路。

1.7 數(shù)據(jù)處理

利用2-ΔΔCt方法計(jì)算各目的基因的相對表達(dá)量，計(jì)算方法參照文獻(xiàn)[19]。采用SPSS 17.0軟件one-way ANOVA方法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)，以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 過表達(dá)ssc-miR-149對H2O2誘導(dǎo)豬顆粒細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用

如圖1A所示，與對照組相比，豬顆粒細(xì)胞經(jīng)H2O2(150 μmol/L)處理6 h，ssc-miR-149的表達(dá)量極顯著降低。由圖1B可知，與Blank(未轉(zhuǎn)染組)相比，豬顆粒細(xì)胞經(jīng)H2O2(150 μmol/L)處理6 h，其細(xì)胞活性極顯著下降；與NC(空載體轉(zhuǎn)染組)相比，ssc-miR-149過表達(dá)組能極顯著提高細(xì)胞活性。根據(jù)圖1C可知，與Blank(未轉(zhuǎn)染組)相比，H2O2處理組中凋亡相關(guān)基因(Caspase-3、FAS和PUMA等)表達(dá)水平極顯著升高；而與NC(空載體轉(zhuǎn)染組)相比，ssc-miR-149過表達(dá)組的凋亡相關(guān)基因(Caspase-3、FAS和PUMA)表達(dá)水平極顯著或顯著降低。這表明過表達(dá)ssc-miR-149可部分抑制H2O2誘導(dǎo)的凋亡相關(guān)基因的表達(dá)，從而對氧化應(yīng)激誘發(fā)的豬顆粒細(xì)胞凋亡具有保護(hù)作用。

A.H2O2處理對豬顆粒細(xì)胞中ssc-miR-149表達(dá)量的影響；B.過表達(dá)ssc-miR-149對H2O2處理下豬顆粒細(xì)胞活力的影響；C.過表達(dá)ssc-miR-149對H2O2誘導(dǎo)豬顆粒細(xì)胞凋亡相關(guān)基因表達(dá)的影響。與Blank對照組相比，**表示差異極顯著(P<0.01)；與NC對照組相比，##表示差異極顯著(P<0.01)，#表示差異顯著(P<0.05)A.Effects of GC treated with H2O2 on expression of ssc-miR-149; B.Effects of the viability of ssc-miR-149 overexpressing on H2O2-induced porcine granulosa cells; C.Effects of ssc-miR-149 overexpressing on porcine granulosa cell apoptotic genes wich induced by H2O2.**.Very significant difference (P<0.01) compared with Blank control group; ##.Very significant difference (P<0.01) compared with NC control group; #.Significant difference (P<0.05) compared with NC control group圖1 過表達(dá)ssc-miR-149對H2O2誘導(dǎo)豬顆粒細(xì)胞氧化損傷的影響Fig.1 Effects of the ssc-miR-149 overexpressing on porcine granulosa cells apoptosis induced by H2O2

2.2 ssc-miR-149轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)

利用2種在線軟件分別對ssc-miR-149的前體(表1)上游2 000 bp區(qū)域進(jìn)行轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測分析，發(fā)現(xiàn)它們的啟動子區(qū)域具有轉(zhuǎn)錄因子SP1、轉(zhuǎn)錄因子p53、核因子kappa B(Nuclear factor kappa B，NFκB)、肌分化因子(Myogenic differentiation，MyoD)、增強(qiáng)子激活結(jié)合蛋白2(Activating enhancer binding protein 2，AP-2)、傷害性信息與即刻早期基因c-fos、低氧誘導(dǎo)因子-1(Hypoxia inducible factor-1，HIF-1)、原癌基因C-Jun、轉(zhuǎn)錄共激活因子p300、信號傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子(Signal transducers and activators of transcription，STAT)、CCAAT增強(qiáng)子結(jié)合蛋白α(CCAAT/enhancer binding protein alpha，C/EBPα)等多個轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，其中SP1、p53、NFκB、c-fos、HIF-1等均參與了細(xì)胞凋亡的調(diào)控。

表1 ssc-miR-l49的前體信息Tab.1 Information of ssc-miR-149 precursor

2.3 ssc-miR-149物種間保守性

利用miRBase對7個哺乳動物成熟的miR-149搜索發(fā)現(xiàn)，不同動物的miR-149具有共同的“種子區(qū)”(CUGGCUC)(表2)，其堿基序列在各物種中呈現(xiàn)高度保守性。

表2 不同物種成熟的miR-149及種子序列 Tab.2 Mature sequences of miR-149 and seed sequences from different species

注：劃線部分表示共同的堿基序列。

Note:The underlined portion indicates a common base sequence.

2.4 ssc-miR-149的靶基因

選擇TargetScan、miRanda和RNAhybrid 3種計(jì)算方法預(yù)測ssc-miR-149的靶基因，取預(yù)測結(jié)果交集，同時(shí)結(jié)合文獻(xiàn)中報(bào)道的靶基因，總共獲得793個基因，作為后續(xù)GO和KEGG分析的靶基因集合，部分靶基因見表3。同時(shí)，從中篩選出了ssc-miR-149與細(xì)胞凋亡相關(guān)的靶基因PUMA/BBC3(p53 upregulated modulator of apoptosis)、FAF1(Fas associated factor 1)和Caspase-9(Cysteine-containing aspartate-specific proteases 9)，具體的結(jié)合位點(diǎn)見圖2。

表3 ssc-miR-149的部分靶基因統(tǒng)計(jì)Tab.3 Statistics on some target genes of ssc-miR-149

圖2 ssc-miR-149與PUMA、FAF1、Caspase-9基因在3′UTR的結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測Fig.2 The prediction of binding sites betweenssc-miR-149 and PUMA,FAF1,Caspase-9 at 3′UTR

2.5 GO靶基因富集分析結(jié)果

針對上述793個相應(yīng)靶基因進(jìn)行GO注釋分類和富集分析，結(jié)果如表4—6所示。在生物學(xué)過程(BP)層面，ssc-miR-149靶基因主要富集于細(xì)胞黏附調(diào)控、雌二醇分泌正調(diào)控、細(xì)胞遷移負(fù)調(diào)控等相關(guān)GO條目中(P<0.05)；在分子功能(MF)層面，靶基因主要富集于鋅離子結(jié)合、ATP結(jié)合、泛素蛋白連接酶活性等相關(guān)的GO條目中(P<0.05)；在細(xì)胞組分(CC)層面，靶基因顯著富集于胞液、溶酶體膜、細(xì)胞間連接、突觸體等相關(guān)的GO條目中(P<0.05)。

表4 ssc-miR-149靶基因在生物學(xué)過程(BP)層面富集結(jié)果(前12個)Tab.4 Enrichment results of ssc-miR-149 target genes in BP level (top 12)

表5 ssc-miR-149靶基因在分子功能(MF)層面富集結(jié)果Tab.5 Enrichment results of ssc-miR-149target genes in MF level

表6 ssc-miR-149 靶基因在細(xì)胞組分(CC)層面富集結(jié)果Tab.6 Enrichment results of ssc-miR-149target genes in CC level

2.6 KEGG信號通路富集結(jié)果

為進(jìn)一步探索ssc-miR-149的功能，在GO注釋基礎(chǔ)之上，利用DAVID中“Pathways”下的“KEGG_PATHWAY”對ssc-miR-149預(yù)測的靶基因集合進(jìn)行生物學(xué)通路富集分析發(fā)現(xiàn)，ssc-miR-149靶基因顯著富集于TNF信號通路、磷脂酰肌醇信號系統(tǒng)、Rap1信號通路、RNA降解、卵子減數(shù)分裂、NOD樣受體信號通路等(P<0.05)(表7)。其中，TNF信號通路、Rap1信號通路和NOD樣受體信號通路是與凋亡和炎癥相關(guān)的通路，故推測ssc-miR-149可能參與了凋亡和炎癥的調(diào)控。

表7 ssc-miR-149預(yù)測靶基因的KEGG信號通路數(shù)據(jù)庫富集分析結(jié)果(前10個)Tab.7 KEGG enrichment results of ssc-miR-149predicted target genes (top 10)

3 結(jié)論與討論

本研究通過對ssc-miR-149在豬顆粒細(xì)胞凋亡中的功能進(jìn)行探索，挖掘出Caspase-9、PUMA/BBC3、FAF1、IL-6、ULK1、ULK2、ATG4C、CCNI等關(guān)鍵靶基因以及TNF信號通路、Rap1信號通路、NOD樣受體信號通路等。通過初步研究并結(jié)合相關(guān)研究報(bào)道，推測ssc-miR-149可能通過靶向Caspase-9、PUMA/BBC3、FAF1對豬顆粒細(xì)胞凋亡發(fā)揮重要作用，這為今后有關(guān)ssc-miR-149的后續(xù)研究提供了一定的數(shù)據(jù)支持和理論指導(dǎo)。

miRNA廣泛存在于動物組織和細(xì)胞內(nèi)，在轉(zhuǎn)錄組水平上大約有60%的基因被調(diào)控修飾過，因此，miRNA的作用相當(dāng)廣泛且重要，它與眾多生理學(xué)過程密切相關(guān)，如分化、增殖、凋亡與發(fā)育等[20]。目前，關(guān)于miR-149的功能研究多集中在癌癥方面。WANG等[21]研究發(fā)現(xiàn)，在胃癌中miR-149靶向調(diào)控鋅指蛋白437(Zinc finger and BTB domain-containing protein 2，ZBTB2)，可阻斷細(xì)胞周期來抑制癌細(xì)胞的增殖；PAN等[22]研究證實(shí)，miR-149可通過阻斷蛋白激酶B(Protein kinase B，AKT1)信號通路來抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖和侵襲；在乳腺癌中，miR-149亦可通過靶向調(diào)控G蛋白偶聯(lián)受體激酶相互作用蛋白1(G protein-coupled receptor kinase-interactor 1，GIT1)來抑制整合素信號通路，從而影響乳腺癌的轉(zhuǎn)移[23]；miR-149還可調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子叉頭盆蛋白質(zhì)M1(Forkhead box protein M1，F(xiàn)OXM1)來抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞遷移和侵襲[24]；在卵巢癌細(xì)胞中，miR-149能靶向作用于X連鎖凋亡抑制蛋白(X-linked inhibitor of apoptosis protein，XIAP)來抑制癌細(xì)胞增殖和提高其對鉑化合物的敏感性[25]。通過這些研究可知，miR-149是調(diào)控癌癥細(xì)胞增殖和凋亡的關(guān)鍵因子，因此，推測它可能在豬顆粒細(xì)胞的增殖和凋亡中也起到了重要作用。

利用miRBase在線數(shù)據(jù)庫檢索了野豬、人、小鼠、黑猩猩、牛、獼猴、狗共7個哺乳動物中成熟的miR-149序列發(fā)現(xiàn)，這7個物種均具有相同且高度保守的種子序列(CUGGCUC)，提示此miRNA可能具有重要的生物學(xué)功能。通過整合Targetscan、miRanda和RNAhybrid靶標(biāo)預(yù)測軟件結(jié)果的交集，ssc-miR-149調(diào)控著凋亡、炎癥、自噬、細(xì)胞周期相關(guān)基因的表達(dá)，如Caspase-9、PUMA/BBC3、FAF1、IL-6、ULK1、ULK2、ATG4C、CCNI等。生物學(xué)通路富集分析顯示，ssc-miR-149調(diào)控著炎癥、凋亡、增殖等相關(guān)信號通路，包括TNF信號通路、Rap1信號通路、NOD樣受體信號通路等，由此推測ssc-miR-149可能在氧化應(yīng)激或脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)所致的豬顆粒細(xì)胞凋亡及炎癥中發(fā)揮著非常重要的作用。ssc-miR-149對豬顆粒細(xì)胞凋亡的負(fù)調(diào)控作用是通過靶基因如Caspase-9、PUMA/BBC3、FAF1等的抑制作用來實(shí)現(xiàn)的。PUMA/BBC3是近年來發(fā)現(xiàn)的促凋亡作用最強(qiáng)的BH3-only蛋白家族成員之一，在細(xì)胞凋亡中發(fā)揮著重要作用[26-27]。眾多研究表明，PUMA是細(xì)胞凋亡途徑的重要分子，也是應(yīng)激導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的重要靶點(diǎn)[28-29]。LIU等[30]研究發(fā)現(xiàn)，氧化應(yīng)激誘導(dǎo)小鼠顆粒細(xì)胞凋亡時(shí)，可顯著上調(diào)PUMA蛋白的表達(dá)量。DING等[15]研究證實(shí)，在氧化應(yīng)激誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的小鼠心肌細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)，PUMA表達(dá)量顯著上調(diào)，而過表達(dá)miR-149能促進(jìn)小鼠心肌細(xì)胞的存活，敲減miR-149能使其對凋亡刺激更為敏感。因此，進(jìn)一步探明調(diào)控PUMA表達(dá)的上游因子及其在豬顆粒細(xì)胞凋亡過程中的分子機(jī)制，很可能成為一種新的研究方向或突破點(diǎn)。FAS也稱CD95或Apo-l，是腫瘤壞死因子和神經(jīng)生長因子受體(TNF/NGF-R)家族的細(xì)胞表面分子，是FASL的受體；FAS/FASL的結(jié)合能夠誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。FASL是腫瘤壞死因子家族(TNF superfamily)的一員，也FAS的天然配體，并且FAS與FASL的交聯(lián)激活是導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的重要途徑之一[31]。FAF1是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種能夠增強(qiáng)FAS誘導(dǎo)凋亡作用的蛋白質(zhì)，而XIAP是新發(fā)現(xiàn)的一個IAP家族中的成員，是最強(qiáng)的凋亡抑制因子，CABALLERO-LPEZ等[32]研究發(fā)現(xiàn)，XIAP可通過抑制Caspase活性從而抑制FAF1介導(dǎo)的凋亡。Caspase-9作為Caspase家族中最重要的起始因子，在線粒體通路凋亡的啟動中發(fā)揮重要作用，在豬顆粒細(xì)胞中，MATSUI等[33]研究表明，Caspase-9的表達(dá)及活性在豬卵泡閉鎖中起著關(guān)鍵的調(diào)控作用。IL-6是一種炎癥因子，是炎癥介質(zhì)網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵成分，在炎癥反應(yīng)中起重要作用[34]，在FAN等[35]構(gòu)建的SiO2粉塵誘導(dǎo)小鼠肺纖維化模型中，miR-149可負(fù)調(diào)控細(xì)胞中IL-6的表達(dá)水平。TIAN等[36]研究發(fā)現(xiàn)，miR-149可靶向FASLG，而抑制miR-149可誘導(dǎo)急性骨髓白血病細(xì)胞系凋亡。根據(jù)這些研究報(bào)道，可推測在豬顆粒細(xì)胞中，ssc-miR-149通過對TNF信號通路、Rap1信號通路、NOD樣受體信號通路中相關(guān)靶基因的靶向抑制，影響這些通路信號的傳遞，從而影響豬顆粒細(xì)胞的增殖和凋亡過程。

近年來眾多研究表明，卵泡中顆粒細(xì)胞凋亡是導(dǎo)致卵泡閉鎖的主要原因，而氧化應(yīng)激是誘發(fā)顆粒細(xì)胞凋亡的重要因素[37]。miR-149具有抵御外界應(yīng)激和抗凋亡的功能，也是調(diào)控PUMA表達(dá)的關(guān)鍵miRNA，這在小鼠研究中已得到證實(shí)[15]。H2O2是一種常用的氧化劑，已被廣泛用于誘導(dǎo)顆粒細(xì)胞凋亡[38-39]。本研究采用H2O2誘導(dǎo)豬顆粒細(xì)胞凋亡，探究過表達(dá)ssc-miR-149對其誘導(dǎo)豬顆粒細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用。研究發(fā)現(xiàn)，豬顆粒細(xì)胞經(jīng)氧化應(yīng)激處理后活性顯著降低，但通過在豬顆粒細(xì)胞內(nèi)過表達(dá)ssc-miR-149，能夠顯著提高顆粒細(xì)胞的存活率，可以有效抑制H2O2誘導(dǎo)的凋亡相關(guān)基因的表達(dá)。因此，ssc-miR-149在H2O2誘導(dǎo)的顆粒細(xì)胞凋亡中起著抗凋亡作用。由此推測，ssc-miR-149在豬顆粒細(xì)胞的凋亡以及卵泡閉鎖過程中發(fā)揮重要的作用。