劉軍生，羅陽蘭，解修超，鄧百萬，柏秋月，曹乃馨,張毓文

(1.陜西理工大學/陜西省食藥用菌工程技術研究中心，陜西 漢中 723001； 2.陜西理工大學 生物科學與工程學院，陜西 漢中 723001)

鎘是對環(huán)境危害較大的重金屬污染物之一，會隨著食物鏈進入人體，進而危害人體健康。物理、化學修復鎘污染土壤技術成果顯著，如鈍化、玻璃化等技術，但成本較高、修復不徹底等問題較為突出[1-2]，植物-微生物聯(lián)合修復鎘污染土壤技術成本低廉、方便易行、無二次污染[3]。因此，研究和完善植物-微生物聯(lián)合修復技術，篩選具有抗鎘促生能力的微生物菌株，對增強植物抗鎘能力，提高污染土壤修復效率具有重要意義。

植物內(nèi)生真菌(Endophyte fungi)是生活史的部分或全部階段位于健康植物組織和器官間隙內(nèi)，并與之建立和諧關系的各種真菌。內(nèi)生真菌與宿主植物的協(xié)同進化過程中可產(chǎn)生植物激素類物質(zhì)如吲哚-3-乙酸(IAA)和鐵載體等次級代謝產(chǎn)物，協(xié)助宿主植物抵御病原菌及不良的生長環(huán)境[4-6]，亦或在植物的遺傳、生理和生態(tài)水平上改變宿主植物對外界環(huán)境的應激反應[7]，提高其抗逆性，促進宿主植物的生長[8-9]，從而有利于宿主植物對重金屬的吸收、積累和轉(zhuǎn)運[10-12]。張興旭[13]研究認為，內(nèi)生真菌侵染可以緩解鎘脅迫對醉馬草的毒害作用，并提高其抗病蟲害能力。魏瑋[14]研究發(fā)現(xiàn)，堿蓬內(nèi)生真菌接入水稻后可顯著提高水稻對鎘和鹽脅迫的抗逆性，說明部分內(nèi)生真菌可以在不同宿主植物間生存并提高宿主植物的抗鎘能力。目前，我國大部分鎘污染農(nóng)田采用“邊生產(chǎn)邊修復”的方式進行耕作，在保護耕地的同時提高產(chǎn)量，篩選抗鎘菌株與大田作物共同構建植物-微生物聯(lián)合體系，成為安全環(huán)保、簡便有效的抗鎘途徑。

本研究采集秦嶺鉛鋅尾礦區(qū)優(yōu)勢植物，并從中分離篩選出5株鎘耐受性為30 000 mg/L的內(nèi)生真菌，測定鎘離子(Cd2+)去除率，研究其對小麥幼苗的促生能力，以期為植物-微生物聯(lián)合修復農(nóng)田鎘污染提供優(yōu)勢菌株，提高農(nóng)田鎘污染修復效率。

1 材料和方法

1.1 材料

供試植物杠柳(PeriplocasepiumBunge)于2017年3月采自陜西省漢中市略陽縣(東經(jīng)106°16′、北緯33°34′)。剪取健康杠柳植株的根和莖，用自封袋帶回實驗室，24 h內(nèi)分離其內(nèi)生真菌。

1.2 儀器

SW-CJ-1D型單人超凈工作臺(上海蘇凈實業(yè)有限公司)、YXQ-LS-50S型高壓滅菌鍋(上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠)、超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)、UV 2550型紫外分光光度計(日本島津公司)、A 320原子吸收分光光度計 (上海精密儀器有限公司)。

1.3 培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)分離培養(yǎng)基：馬鈴薯200.0 g/L、葡萄糖20.0 g/L、蛋白胨5.0 g/L、磷酸二氫鉀5.0 g/L、硫酸鎂3.0 g/L、瓊脂15.0 g/L、水1 000 mL、pH值自然。

PDA加鎘培養(yǎng)基：在PDA分離培養(yǎng)基中分別加入10 000、15 000、20 000、25 000、30 000 mg/L氯化鎘。

PDA 瓊脂斜面培養(yǎng)基：與PDA分離培養(yǎng)基配方相同。

PDA液體培養(yǎng)基：馬鈴薯200.0 g/L、葡萄糖20.0 g/L、蛋白胨5.0 g/L、磷酸二氫鉀5.0 g/L、硫酸鎂3.0 g/L、水1 000 mL、pH值自然。

溶磷培養(yǎng)基：葡萄糖10.0 g、(NH4)2SO40.5 g、NaCl 0.3 g、KCl 0.3 g、FeSO4·7H2O 0.03 g、MgSO4·7H2O 0.3 g、MnSO4·4H2O 0.03 g、Ca3(PO4)210.0 g、蒸餾水1 000 mL、瓊脂20.0 g。

解鉀培養(yǎng)基：鉀長石2.5 g、Na2HPO40.2 g、MgSO4·

7H2O 0.2 g、NaCl 0.2 g、CaCO35.0 g、葡萄糖10.0 g、CaSO4·7H2O 0.1 g。

1.4 方法

1.4.1 抗鎘內(nèi)生真菌的分離 將杠柳的根和莖用流水沖洗干凈、75%乙醇處理1 min，之后用無菌水沖洗4次、0.1%升汞處理8 min，然后用2.5%次氯酸鈉消毒4 min、無菌水沖洗5次。用無菌濾紙吸干水分，解剖刀切成1 cm小段，置于PDA分離培養(yǎng)基，于28 ℃恒溫箱倒置培養(yǎng)。對培養(yǎng)出的內(nèi)生真菌進行純化，按照純化出的先后順序?qū)⒕昃幪枮镚R1、GR2、GR3、GR4、GR5、GR6、GR7、GR8、GR9。將純化后的內(nèi)生真菌轉(zhuǎn)接入PDA加鎘培養(yǎng)基，進行抗鎘內(nèi)生真菌的篩選，篩選出的菌種接種于PDA瓊脂斜面培養(yǎng)基，4 ℃冷藏。

1.4.2 抗鎘內(nèi)生真菌菌株的鑒定

1.4.2.1 抗鎘內(nèi)生真菌形態(tài)分析 將篩選所得抗鎘內(nèi)生真菌菌株分別接種于PDA分離培養(yǎng)基和30 000 mg/L的PDA加鎘培養(yǎng)基，采用棉藍染色法[15]在光學顯微鏡下觀察菌絲體的形態(tài)和大小[16]，參考文獻[17]對其進行基本分類。

1.4.2.2 抗鎘內(nèi)生真菌內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)基因序列(Internal transcribed sequence, ITS)序列測定 利用十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)法提取抗鎘內(nèi)生真菌DNA，采用抗鎘內(nèi)生真菌通用引物ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′) 對ITS基因序列進行擴增。聚合酶鏈式反應(PCR)反應體系50 μL：2×TaqMaster Mix 25 μL、10 μmol/L引物各2 μL、模板DNA 1 μL(含量10 ng/μL)，ddH2O補齊至50 μL。反應條件：94 ℃預變性2 min，94 ℃變性30 s，59 ℃退火30 s，72 ℃ 延伸60 s，32個循環(huán)后4 ℃保存。將PCR產(chǎn)物送至生工生物工程(上海)股份有限公司測序，測序結(jié)果整理后進行Blast比對，并提交NCBI申請、獲得登錄號，利用MEGA 7.0構建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.4.3 抗鎘內(nèi)生真菌Cd2+去除率測定 采用原子吸收分光光度法測定Cd2+初始含量。將抗鎘內(nèi)生真菌活化后進行去除試驗，試驗條件設定為：轉(zhuǎn)速140 r/min、接種量2%、pH值 7.0、培養(yǎng)溫度28 ℃，在PDA液體培養(yǎng)基中加入氯化鎘使Cd2+終含量為1 000 mg/L，以含鎘但不接菌的PDA液體培養(yǎng)基為對照。培養(yǎng)15 d后，將發(fā)酵液抽濾去除菌絲體，濾液10 000 r/min離心12 min，取上清液過0.22 μm濾膜用于測定Cd2+殘留含量，以不含菌但含Cd2+的培養(yǎng)基為對照，去除率按以下公式計算：

Cd2+去除率=(C0-C)/C0×100%，

其中，C0為Cd2+的初始含量(mg/L)，C為Cd2+的殘留含量(mg/L)[18]。

1.4.4 抗鎘內(nèi)生真菌促生能力測定

1.4.4.1 IAA活性 進行產(chǎn)IAA抗鎘內(nèi)生真菌的初篩，發(fā)酵液與Salkowski比色液等比例混合后，混合液顏色呈粉紅色者為陽性( +)，表示抗鎘內(nèi)生真菌具有IAA活性，混合液顏色越深表示IAA活性越高；混合液不變色者為陰性( -)，表示抗鎘內(nèi)生真菌無IAA活性。將Salkowski比色液與發(fā)酵液離心后的上清液等比例混合，于暗處靜置30 min后，測定OD530值。分析純IAA梯度稀釋后，以濃度為橫坐標、OD530值為縱坐標繪制標準曲線，根據(jù)標準曲線方程計算抗鎘內(nèi)生真菌的IAA活性[19]。

1.4.4.2 鐵載體活性 用鐵載體活性(SU)表示鐵載體的產(chǎn)量，根據(jù)以下公式計算抗鎘內(nèi)生真菌鐵載體活性=(Ar-As)/Ar×100%，

其中,Ar為鐵載體檢測液的吸光值，As為鐵載體檢測液與內(nèi)生真菌發(fā)酵液混合后的吸光值[20]。

1.4.4.3 胞外過氧化氫酶(CAT)活性 CAT活性采用鉬酸銨法[21-22]測定，定義1s內(nèi)催化氧化1 μmol H2O2所需的樣品量為 1個CAT活力單位(UC)，根據(jù)以下公式計算抗鎘內(nèi)生真菌CAT活性=[(A1/A0-0.056)/0.564×V]/t，

其中,A1為樣品吸光度，A0為對照吸光度，V為反應體系體積，t為反應時間。

1.4.4.4 溶磷解鉀活性 采用透明圈法進行定性試驗[23]，采用鉬銻抗比色法及四苯硼酸鈉法進行溶磷解鉀定量試驗[24-25]。

1.5 小麥驗證試驗

1.5.1 小麥種子活力測定 采用氯化三苯基四氮唑(Triphenyl tetrazolium chloride，TTC)法測定供試小麥種子活力[26]。

1.5.2 不同含量Cd2+對小麥幼苗生長、生理指標的影響 將珍珠巖滅菌后，加入含Cd2+的Hoagland營養(yǎng)液，使Cd2+的終含量分別為1、5、10、15、20、25、20、35 mg/kg，無Cd2+的Hoagland營養(yǎng)液作空白對照，拌勻后平衡一周用于后續(xù)試驗。把小麥種子先在25～30 ℃的水中浸泡10 h，再整齊而均勻地種在不同Cd2+含量水平的珍珠巖發(fā)芽床上，每組3盆重復，置于光照培養(yǎng)箱[28 ℃、16 h(光照強度3 000 lx)，26 ℃、8 h(無光照)，相對濕度75%]培養(yǎng)，定期觀察，待小麥幼苗抽出第3片真葉后，收獲并測其苗高、根長、鮮質(zhì)量、干質(zhì)量、葉綠素含量(采用80%丙酮比色法測定[27])、可溶性糖含量(采用苯酚-濃硫酸法測定)、可溶性蛋白含量(采用考馬斯亮藍法[28]測定)等指標。

1.5.3 不同抗鎘內(nèi)生真菌發(fā)酵液對鎘脅迫條件下小麥幼苗生長、生理指標的影響 將5株抗鎘內(nèi)生真菌分別接入PDA液體培養(yǎng)基，置于恒溫水平搖床(140 r/min、28 ℃)培養(yǎng)10 d后，抽濾菌絲體，收集發(fā)酵液濾液備用。待小麥長出胚根后，用10 mL發(fā)酵液澆灌受10 mg/kg Cd2+脅迫的小麥幼苗，篩選出能提高小麥幼苗耐鎘能力的內(nèi)生真菌，以不含菌的培養(yǎng)基、無菌水為對照。每組3盆重復，培養(yǎng)條件同1.5.2，待小麥幼苗抽出第3片真葉后，收獲并測其生長、生理指標(同1.5.2)。

1.6 數(shù)據(jù)處理與分析

用Microsoft excel 2010軟件進行數(shù)據(jù)計算和繪圖, 用SPSS 24.0軟件進行方差和數(shù)據(jù)變異分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗鎘內(nèi)生真菌形態(tài)分析

圖1、2表明，菌株GR1在PDA培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)呈淡黃色厚絨狀，邊緣整齊、呈白色，表面干燥。菌絲體有螺旋狀結(jié)構、有橫隔，分生孢子梗呈帚狀，產(chǎn)生綠色分生孢子。而在PDA加鎘培養(yǎng)基上培養(yǎng)30 d后，菌株GR1菌落形態(tài)發(fā)生了明顯變化，以基生菌絲為主，邊緣有色素沉著，分生孢子顏色加深、孢子壁加厚。

菌株GR4在PDA培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)呈淡紫色絨毛狀，氣生菌絲濃密，菌絲有隔膜、分支，不規(guī)則，部分互相纏繞成束狀。在PDA加鎘培養(yǎng)基上培養(yǎng)30 d后，菌株GR4菌落以基生菌絲為主，邊緣有色素沉著，菌絲表面附著有紅色分泌物。

菌株GR9在PDA培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)呈紫色絨毛狀,圓形、隆起，氣生菌絲濃密。而在PDA加鎘培養(yǎng)基上培養(yǎng)30 d后,菌株GR9菌落以基生菌絲為主，表面附著有白色結(jié)晶物質(zhì)。

菌株GR7、GR10在PDA培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)呈紫白色棉絮狀,圓形、隆起，氣生菌絲旺盛, 菌絲體有分隔和分枝。在PDA加鎘培養(yǎng)基上培養(yǎng)30 d后，菌株GR7、GR10菌落以基生菌絲為主，表面有淺紫色色素沉著，菌絲加粗、不規(guī)則，附著胞明顯。

圖1 PDA培養(yǎng)基上抗鎘內(nèi)生真菌菌株形態(tài)Fig.1 Morphology of cadmium resistant endophytic fungi strains in PDA medium

圖2 PDA加鎘培養(yǎng)基上抗鎘內(nèi)生真菌菌株形態(tài)Fig.2 Morphology of cadmium resistant endophytic fungi strains in cadmium-added PDA medium

2.2 抗鎘內(nèi)生真菌ITS序列測定

通過平板培養(yǎng)法篩選出5株在30 000 mg/L Cd2+含量平板上生長良好的抗鎘內(nèi)生真菌。經(jīng)測序后，提交至GenBank數(shù)據(jù)庫進行序列分析和相似性比較，建立系統(tǒng)發(fā)育樹 (圖3)。結(jié)果顯示，篩選出的抗鎘性較高的5株抗鎘內(nèi)生真菌菌株中，GR1、GR4、GR9分別與Talaromycessp.、Colletotrichumsp.、Purpureocilliumsp.中的ITS基因序列具有99%的高度相似性，而GR7、GR10與Fusariumsp.中的ITS基因序列具有99%的高度相似性。

圖3 抗鎘內(nèi)生真菌系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of cadmium resistant endophytic fungi

2.3 抗鎘內(nèi)生真菌Cd2+去除率測定

對重金屬離子的去除率是衡量內(nèi)生真菌菌株修復能力的重要指標，內(nèi)生真菌可以利用生物多聚物如胞外多糖和鐵載體將重金屬離子螯合于胞外基質(zhì)，或者利用金屬結(jié)合蛋白(多肽)等重金屬特異性結(jié)合大分子結(jié)合重金屬離子，并將其吸收、貯存在細胞內(nèi)。抗鎘內(nèi)生真菌Cd2+去除率見圖4，各菌株Cd2+去除率按大小依次排序為：GR7>GR9>GR4>GR1>GR10。其中,GR7、GR9、GR4的Cd2+去除率均達60%以上，說明GR7、GR9、GR4在高含量鎘污染環(huán)境中具有較大的修復潛力。

2.4 抗鎘內(nèi)生真菌促生能力測定

2.4.1 IAA活性 如表1所示，5株抗鎘內(nèi)生真菌中有1株菌株IAA分泌能力為“+++”，3株菌株IAA分泌能力為“+”。菌株GR9無IAA活性，其余4株抗鎘內(nèi)生真菌的 IAA活性之間有顯著性差異，IAA活性在13.641～99.417 mg/L，其中,GR4的IAA活性最強，為99.417 mg/L，其后依次是GR1、GR7、GR10，說明GR4對宿主植物有較強的促生潛力。

圖4 抗鎘內(nèi)生真菌Cd2+去除率Fig.4 Cd2+ removal rate of cadmium resistantendophytic fungi

菌株 Strains IAA分泌能力IAA secretion abilityIAA活性/(mg/L)IAA activityGR1+17.458±0.42bGR4+++99.417±0.59aGR7+14.443±0.39cGR9--GR10+13.641±0.06d

注：不同小寫字母代表差異顯著(P<0.05)，下同。

Note: Different lowercase letters indicate significant differences(P<0.05),the same below.

2.4.2 鐵載體活性 在內(nèi)生真菌的代謝過程中，鐵元素作為激活劑和催化基團，在酶作用過程中起到重要的作用[29]，為了更好地適應環(huán)境，微生物會合成和分泌一種對三價鐵離子具有高螯合力的小分子物質(zhì)——鐵載體，以滿足自身生長需求[30]。同時鐵載體還可以結(jié)合重金屬離子，降低環(huán)境中有效態(tài)重金屬含量。如圖5所示，5株抗鎘內(nèi)生真菌發(fā)酵液中均含有鐵載體，且SU值在38.68%～84.64%，活性較高。其中，GR7的SU值為84.64%，GR4的SU值為78.50%，而且GR7和GR4對Cd2+也有較高的去除率，說明鐵載體活性在內(nèi)生真菌抗鎘性能方面可能也有重要作用，且具有活性的鐵載體可以為內(nèi)生真菌和宿主植物提供生長發(fā)育所必需的鐵元素，促進內(nèi)生真菌和宿主植物的生長。

圖5 抗鎘內(nèi)生真菌鐵載體活性Fig.5 Siderophore activity of cadmiumresistant endophytic fungi

2.4.3 胞外CAT活性 CAT是生物防御系統(tǒng)的關鍵酶之一，可把對植物生長有害的過氧化氫分解為水和氧氣, 是降低過氧化氫毒害作用及合成腐殖質(zhì)的重要氧化還原酶。如圖6所示，4株抗鎘內(nèi)生真菌發(fā)酵液的UC值為6.14～10.01 U/mL，活性較高。其中，GR9的UC值為10.01 U/mL，GR1的UC值為8.04 U/mL，而GR10未檢測到胞外CAT活性。

圖6 抗鎘內(nèi)生真菌胞外CAT活性 Fig.6 Extracellular CAT activity of cadmiumresistant endophytic fungi

2.4.4 溶磷解鉀活性 磷、鉀是植物生長所必需的營養(yǎng)元素，土壤中雖含有豐富的磷、鉀，但由于大部分磷、鉀以難溶性鹽或氧化物的形式存在，導致植物無法直接吸收利用[31]。溶磷解鉀微生物可將礦物態(tài)磷、鉀轉(zhuǎn)變?yōu)榭梢员恢参镂盏挠行Я?、有效鉀，為植物及其他微生物提供磷源和鉀源，在土壤磷、鉀循環(huán)中起重要作用[32]。微生物的溶磷解鉀活性越強，將礦物態(tài)磷、鉀轉(zhuǎn)變?yōu)榭扇軕B(tài)、有效態(tài)磷鉀的能力越強，測定溶液中有效態(tài)磷、鉀的含量可確定微生物溶磷解鉀活性的大小。如表2所示，5株抗鎘內(nèi)生真菌中，GR1、GR9菌株發(fā)酵液中有效磷含量分別為201.67、195.09 mg/L，具有較強的溶磷能力；GR4、GR9發(fā)酵液中有效鉀含量分別為105.11、97.22 mg/L，具有較強的解鉀能力。菌株GR9既有溶磷能力又有解鉀能力。

表2 抗鎘內(nèi)生真菌溶磷解鉀活性Tab.2 Phosphorus and potassium dissolution activity ofcadmium resistant endophytic fungi mg/L

2.5 小麥驗證試驗

2.5.1 小麥種子活力測定 小麥種子活力介于97% ～99%，平均值為98%，可用于試驗。

2.5.2 不同含量Cd2+對小麥幼苗生長、生理指標的影響 鎘脅迫會影響小麥幼苗的生物量、葉綠素含量、可溶性糖含量、可溶性蛋白含量等生長、生理指標。如表3所示，隨著Cd2+含量的增加，小麥幼苗的生長總體呈下降趨勢，在Cd2+含量為1 mg/kg時，小麥幼苗的株高、根長、鮮質(zhì)量、干質(zhì)量、葉綠素含量、可溶性糖含量、可溶性蛋白含量與對照相比無顯著差異。Cd2+含量增加到5 mg/kg時小麥幼苗的生長受到明顯抑制,株高、根長、鮮質(zhì)量、干質(zhì)量、葉綠素含量與對照相比顯著降低，而可溶性糖含量、可溶性蛋白含量顯著增加，說明5 mg/kg的Cd2+不僅對小麥幼苗的生長產(chǎn)生明顯的抑制作用，并且使其氧化應激產(chǎn)物含量顯著上升。當Cd2+含量增加到10 mg/kg時，小麥幼苗的株高、根長、鮮質(zhì)量、干質(zhì)量、葉綠素含量、可溶性糖含量、可溶性蛋白含量與對照相比均顯著下降。

表3 不同含量Cd2+對小麥幼苗生長、生理指標的影響 Tab.3 Effects of different content of Cd2+ on growth and physiological index of wheat seedlings

2.5.3 不同抗鎘內(nèi)生真菌發(fā)酵液對鎘脅迫條件下小麥幼苗生長、生理指標的影響 如表4所示，加入不同抗鎘內(nèi)生真菌發(fā)酵液后，與空白相比，對照的株高、鮮質(zhì)量、葉綠素含量、可溶性蛋白含量均顯著增加，這是因為培養(yǎng)基中含有部分對小麥幼苗生長有益的營養(yǎng)物質(zhì)。與對照相比，添加GR1、GR4、GR7、GR9發(fā)酵液后的小麥幼苗的生長、生理指標均有顯著增加。與對照相比，添加GR1發(fā)酵液的小麥幼苗株高增加了80.22%，根長增加了61.26%，鮮質(zhì)量增加了27.66%，干質(zhì)量增加了60.87%，葉綠素含量增加了28.42%，可溶性糖含量增加了7.83%，可溶性蛋白含量增加了13.28%，整體促進效果顯著。與對照相比，添加GR10發(fā)酵液的小麥幼苗的鮮質(zhì)量和干質(zhì)量差異不顯著，其余生長、生理指標均顯著增加。由此可見，抗鎘內(nèi)生真菌能夠通過提高宿主植物的葉綠素含量、可溶性糖含量、可溶性蛋白含量來幫助小麥幼苗抵抗逆境，增加小麥幼苗的生物量，并提高其耐鎘能力。

表4 不同抗鎘內(nèi)生真菌發(fā)酵液對鎘脅迫條件下小麥幼苗生長、生理指標的影響 Tab.4 Effects of fermentation broth of different cadmium resistant endophytic fungi on growth and physiologicalindex of wheat seedlings under cadmium stress

3 結(jié)論與討論

當植物受到鎘脅迫時，其抗氧化酶系統(tǒng)能夠減少自身受到的傷害，但當逆境脅迫負荷過大時，會使其生長受到抑制，甚至造成死亡[33]。內(nèi)生真菌的加入可以提高植物對鎘的耐受和吸收能力，同時改變植物體內(nèi)部分活性物質(zhì)的含量，增強其抗逆能力，促進植物的生長發(fā)育。內(nèi)生真菌與宿主植物經(jīng)過長期的協(xié)同進化，對宿主植物具有促生、抗逆作用而又不造成危害，利用抗鎘內(nèi)生真菌構建植物-微生物聯(lián)合修復體系，方便高效、安全環(huán)保，是一種具有潛力的生物修復技術。

抗鎘內(nèi)生真菌在植物-微生物聯(lián)合修復體系中主要有兩方面的作用，其一為吸附、固定環(huán)境中或植物體內(nèi)的Cd2+，降低植物的鎘脅迫壓力；其二為促進植物生長。研究抗鎘內(nèi)生真菌的耐鎘和促生能力有利于篩選出適用于構建植物-微生物聯(lián)合修復體系的優(yōu)勢菌株。本研究結(jié)果顯示，5株抗鎘內(nèi)生真菌中菌株GR4的IAA活性最高(99.417 mg/L)，菌株GR7的鐵載體活性最高(84.64%)，菌株GR9的胞外CAT活性最高(10.01 U/mL)，菌株GR1的有效磷含量最高(201.67 mg/L)，菌株GR4的有效鉀含量最高(105.11 mg/L)。5株抗鎘內(nèi)生真菌均能顯著提高小麥幼苗的耐鎘能力，與對照相比，添加GR1發(fā)酵液的小麥幼苗株高增加了80.22%，根長增加了61.26%，鮮質(zhì)量增加了27.66%，干質(zhì)量增加了60.87%，葉綠素含量增加了28.42%，可溶性糖含量增加了7.83%，可溶性蛋白含量增加了13.28%，整體促進效果較為顯著。尹藝等[34]研究發(fā)現(xiàn)，堿蓬內(nèi)生真菌EF11-01可以提高水稻對鎘脅迫的抗性，促進水稻生長,提高葉綠素含量，增強抗氧化防御能力，與本研究的結(jié)果相一致。

本研究分離篩選到的5株內(nèi)生真菌，經(jīng)鑒定GR1為Talaromycessp.，GR4為Colletotrichumsp.，GR9為Purpureocilliumsp.，而GR7和GR10均為Fusariumsp.。其中，踝節(jié)菌屬(Talaromycessp.)作為一個重要的內(nèi)生真菌屬，產(chǎn)生了多種新的天然產(chǎn)物如生物堿類[35]、蒽酮類[36]和聚酯類化合物[37]，但作為抗鎘內(nèi)生真菌尚屬首次報道。刺盤孢屬(Colletotrichumsp.)多為植物病原菌，引起植物炭疽病等[38-40]。淡紫擬青霉屬(Purpureocilliumsp.)的生防潛力巨大[41-42]，鐮刀菌屬(Fusariumsp.)的生態(tài)學功能比較復雜，既可致病又可防病，還有良好的重金屬吸附能力。徐在超等[43]研究發(fā)現(xiàn)，油菜內(nèi)生真菌Fusariumsp.CBRF14對鎘的最大吸附量為20.5 mg/g，對鉛的最大吸附量為299.8 mg/g，對鋅的最大吸附量為28.4 mg/g。楊亮等[44]研究發(fā)現(xiàn)，鐮刀菌PY在鉛離子質(zhì)量濃度為750 mg/L時吸附率為77.9%，具有較高的抗鉛性。本研究篩選到GR7和GR10，也有一定的鎘去除率。

本研究篩選的內(nèi)生真菌均具有較強的鎘抗性，同時又具有一定的促生潛力，可為植物-微生物聯(lián)合修復鎘污染農(nóng)田提供優(yōu)勢菌株，提高鎘污染修復效率。本試驗并未測定珍珠巖中剩余的有效態(tài)鎘和總鎘含量，以及小麥地上部分和地下部分有效態(tài)鎘和總鎘含量，因此，小麥抗鎘能力的提升是否與小麥吸收了更多的鎘，并使之在體內(nèi)以無效態(tài)沉積下來有關，尚需進一步研究。另外，小麥抗鎘能力增加是否會使小麥種子中的鎘含量增加，需要進一步研究。