楊治偉，劉曉剛，田 玲，馬嘉欣，田 穎，馬 鈺，田 蕾，張銀霞，楊淑琴，李培富

(寧夏大學(xué) 農(nóng)學(xué)院/寧夏優(yōu)勢(shì)特色作物現(xiàn)代分子育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，寧夏 銀川 750021)

隨著生活水平的提高，人們對(duì)稻米營養(yǎng)品質(zhì)的要求越來越高。同時(shí)，微量礦質(zhì)營養(yǎng)元素如鎂、鋅、鐵、錳、銅、硒等，在人體中普遍存在缺乏現(xiàn)象，而最突出的是鋅和鐵缺乏[1]。人體所需的礦質(zhì)元素超過22種是通過飲食來提供的，主要依賴于谷物[2]。世界上50%以上的人口以水稻為主食[3]。因此，發(fā)掘水稻籽粒鋅、鐵含量相關(guān)位點(diǎn)，培育高鋅、鐵含量水稻品種越來越重要。

常用的數(shù)量性狀位點(diǎn)(QTL)研究方法有連鎖分析和關(guān)聯(lián)分析。連鎖分析是以雙親雜交后代為遺傳作圖群體，根據(jù)雙親間遺傳差異檢測(cè)控制目標(biāo)性狀的QTL，然而2個(gè)特定的親本間不可避免地存在一些不發(fā)生分離和重組的位點(diǎn)，存在一定局限性[4]；關(guān)聯(lián)分析是通過對(duì)利用覆蓋全基因組的大量標(biāo)記獲得的目標(biāo)群體的基因型數(shù)據(jù)和關(guān)聯(lián)表型數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，掃描引起表型變異的位點(diǎn)。與傳統(tǒng)的QTL連鎖分析相比，關(guān)聯(lián)分析以自然群體為材料，無需構(gòu)建特殊的作圖群體，也能同時(shí)檢測(cè)同一基因座上的多個(gè)等位基因，提供的等位變異更加豐富[5]。

近年來,關(guān)聯(lián)分析方法在不同作物農(nóng)藝性狀的遺傳定位研究中被廣泛應(yīng)用，如豌豆[6]、油菜[7]、葡萄[8]、辣椒[9]、玉米[10]等。在水稻育種研究中，利用關(guān)聯(lián)分析發(fā)掘水稻直鏈淀粉含量、糯性、抗病性、耐貯性及粒型等有利等位變異的報(bào)道較多[11-15]，而對(duì)籽粒鋅、鐵含量的報(bào)道較少[16]。目前，對(duì)控制水稻籽粒鋅、鐵含量相關(guān)位點(diǎn)的研究主要利用的是連鎖分析方法。沈希宏等[17]利用重組自交系材料檢測(cè)到控制鋅、鐵含量的位點(diǎn)分布在水稻第1、3、4、5、7、8、11染色體上；劉杰[18]利用重組自交系材料分別在水稻第1、3、5、6、7、10、11染色體上檢測(cè)到控制鋅、鐵含量的位點(diǎn)；此外，在第2、9、12染色體上也檢測(cè)到控制鋅、鐵含量的位點(diǎn)[19-20]。目前，尚未見水稻籽粒鋅、鐵含量與SSR標(biāo)記的關(guān)聯(lián)分析研究。為此，選用57對(duì)均勻分布在水稻全基因組的SSR標(biāo)記對(duì)155份粳稻種質(zhì)資源進(jìn)行檢測(cè)，研究粳稻籽粒鋅、鐵含量與SSR標(biāo)記的關(guān)聯(lián)性，以期為改良水稻籽粒營養(yǎng)品質(zhì)的優(yōu)異親本的選擇、組配提供理論依據(jù)和材料保障。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

以155份粳稻種質(zhì)資源為供試材料，其中31份為寧夏回族自治區(qū)本地種質(zhì)資源，124份為外引種質(zhì)資源(表1)。

表1 參試粳稻種質(zhì)名稱及來源信息

續(xù)表1 參試粳稻種質(zhì)名稱及來源信息

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 鋅、鐵含量的測(cè)定 水稻籽粒鋅、鐵含量測(cè)定參照劉三銘[21]的方法。收獲后，將155份水稻種質(zhì)資源用JLGJ4.5型礱谷機(jī)磨出糙米，然后用JFSD-70磨粉機(jī)研磨成米粉，放入4 ℃冰箱備用。稱取1 g米粉置于消煮管內(nèi)，加入混合酸10 mL(HNO3∶HClO4=5∶1)，靜置12 h或過夜，直至米粉完全消解。次日將裝有樣品的消煮管在LWY-84B遠(yuǎn)紅外消煮爐上進(jìn)行消煮，直到消解液為無色或淡黃色時(shí)停止消解(此時(shí)體積大約為1 mL)。冷卻后用超純水定容至50 mL，每份種質(zhì)3次重復(fù)，設(shè)置2個(gè)空白對(duì)照。用Z-2000原子吸收分光光度計(jì)測(cè)定樣品中鋅、鐵含量。

1.2.2 DNA的提取及SSR分子標(biāo)記檢測(cè) 采用SDS法提取各水稻種質(zhì)葉片總DNA。選取均勻分布在水稻全基因組的57對(duì)SSR引物對(duì)155份水稻種質(zhì)資源進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)。SSR引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。PCR擴(kuò)增體系參照羅天寬等[22]的方法，SSR分子標(biāo)記檢測(cè)及銀染參照高東等[23]的方法。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

每對(duì)SSR引物代表1個(gè)位點(diǎn)，視每條擴(kuò)增條帶代表1個(gè)等位變異，有條帶記為1，無條帶記為0，缺失記為9，然后建立0-1矩陣，并按照不同軟件的應(yīng)用格式進(jìn)行數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換。應(yīng)用Popgene軟件進(jìn)行相關(guān)指數(shù)計(jì)算[24]，包括Shannon’s信息指數(shù)和Nei’s遺傳多樣性指數(shù)。

群體結(jié)構(gòu)使用Structure 2.2軟件采用混合模型和等位變異發(fā)生頻率非相關(guān)模型進(jìn)行分析[25]。亞群數(shù)設(shè)為2～8，每次運(yùn)行的不作數(shù)迭代和重復(fù)次數(shù)都設(shè)置為50 000。每個(gè)參數(shù)運(yùn)行5次，以最大似然值ΔK為標(biāo)準(zhǔn)選取最佳的亞群數(shù)。根據(jù)相似性最大的運(yùn)行結(jié)果劃分組，后驗(yàn)概率大于或等于0.6的種質(zhì)被劃分到相應(yīng)的組中，后驗(yàn)概率小于0.6的種質(zhì)被劃分到混合組中。

使用Tassel 2.1軟件中的GLM程序進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析[26]，將利用Structure 2.2軟件計(jì)算的后驗(yàn)概率作為協(xié)變量，利用SSR標(biāo)記分別對(duì)水稻籽粒鋅、鐵含量進(jìn)行回歸分析。在P<0.01時(shí)，認(rèn)為SSR標(biāo)記與籽粒鋅、鐵含量的關(guān)聯(lián)性顯著，統(tǒng)計(jì)關(guān)聯(lián)位點(diǎn)對(duì)表型變異的貢獻(xiàn)率。

2 結(jié)果與分析

2.1 粳稻籽粒鋅、鐵含量與粒型的相關(guān)性分析

由表2可以看出，水稻籽粒鋅含量與鐵含量呈極顯著正相關(guān)；鋅、鐵含量分別與谷粒長呈極顯著、顯著正相關(guān)；谷粒長與谷粒長寬比、千粒質(zhì)量均呈極顯著正相關(guān)。綜上，想要獲得鋅含量和鐵含量較高的水稻種質(zhì)，應(yīng)挑選谷粒較長的種質(zhì)資源。

表2 粳稻籽粒鋅、鐵含量與粒型的相關(guān)性

注：**表示極顯著相關(guān)(P≤0.01)，*表示顯著相關(guān)(P≤0.05)。

Note:**,* mean significant correlations at 0.01,0.05 levels respectively.

2.2 粳稻種質(zhì)資源SSR標(biāo)記遺傳多樣性分析

利用57對(duì)均勻分布在水稻全基因組且多態(tài)性好的SSR引物對(duì)155份粳稻種質(zhì)資源進(jìn)行遺傳多樣性分析(表3)發(fā)現(xiàn)，共檢測(cè)到257個(gè)等位基因，其中有效等位基因有148個(gè)，有效等位基因所占比例為57.58%；各位點(diǎn)的等位基因數(shù)介于2～10個(gè)，平均每個(gè)位點(diǎn)檢測(cè)到4.51個(gè)等位基因，有效等位基因數(shù)介于1.14～7.22個(gè)，平均有效等位基因數(shù)為 2.60個(gè)。SSR標(biāo)記RM3513多態(tài)性最好，其有效等位基因數(shù)為7.22個(gè)，Nei’s遺傳多樣性指數(shù)、Shannon’s信息指數(shù)分別為0.861 5、2.099 2；RM7585的多態(tài)性最差，其有效等位基因數(shù)僅為1.14個(gè)，Nei’s遺傳多樣性指數(shù)和Shannon’s信息指數(shù)均最低。綜上可知，155份粳稻種質(zhì)資源的遺傳差異較大。

表3 粳稻種質(zhì)資源SSR標(biāo)記遺傳多樣性Tab.3 Genetic diversity of japonica rice germplasm resources using SSR markers

2.3 粳稻種質(zhì)資源群體結(jié)構(gòu)分析

由圖1可知，粳稻種質(zhì)資源亞群數(shù)為4時(shí)，ΔK達(dá)到最高值，參試的粳稻種質(zhì)資源分布于穩(wěn)定的類群中。后驗(yàn)概率大于或等于0.6的粳稻種質(zhì)主要分為4個(gè)亞群(圖2)，紅色區(qū)域?yàn)榈?亞群，包括31份種質(zhì)，大部分來源于寧夏回族自治區(qū)當(dāng)?shù)兀痪G色區(qū)域?yàn)榈?亞群，包括66份種質(zhì)，主要來源于黑龍江、吉林等地及澳大利亞、意大利等國家；藍(lán)色區(qū)域?yàn)榈?亞群，包括22份種質(zhì)，主要來源于江蘇、吉林、遼寧等地；黃色區(qū)域?yàn)榈?亞群，包括22份種質(zhì)，主要來源于新疆、吉林等地。剩余14份種質(zhì)的后驗(yàn)概率小于0.6，被劃分為混合類群。對(duì)4個(gè)亞群種質(zhì)的籽粒鋅、鐵含量進(jìn)行方差分析發(fā)現(xiàn)，第2亞群種質(zhì)的平均鋅含量顯著高于第3亞群，第1亞群種質(zhì)的平均鐵含量顯著高于第3亞群。

圖1 ΔK值隨亞群數(shù)的變化Fig.1 Change of ΔK value with the number of subgroups

2.4 粳稻鋅、鐵含量與SSR標(biāo)記的關(guān)聯(lián)分析

經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)，與水稻籽粒鋅含量顯著關(guān)聯(lián)的SSR位點(diǎn)有3個(gè)，分布于水稻第1、8染色體上，分別為RM5461-4、RM5647-2、RM7356-1，表型貢獻(xiàn)率分別為7.59%、5.89%、4.72%，表型效應(yīng)值介于-4.90～2.15 mg/kg，其中，RM5461-4表型效應(yīng)值為負(fù)值，是1個(gè)減效位點(diǎn)，載體種質(zhì)為長白9號(hào)；RM5647-2 和RM7356-1為增效位點(diǎn)，其中，RM5647-2的增效作用較大，為2.15 mg/kg，載體種質(zhì)為長粒-5(表4)。

圖2 155份粳稻種質(zhì)資源的群體結(jié)構(gòu)Fig.2 Population structure of 155 japonica rice germplasm resources

染色體編號(hào)Chromosome number位點(diǎn)-等位變異Locus-alleleP表型貢獻(xiàn)率/%Phenotypic contribution rate 表型效應(yīng)值/(mg/kg)Phenotypic effect value載體種質(zhì)Carrier germplasm1RM5461-44.75×10-47.59-4.90長白9號(hào)8RM5647-22.20×10-35.892.15長粒-58RM7356-16.28×10-34.721.52大粒稻

由表5可知，共檢測(cè)到與水稻籽粒鐵含量顯著關(guān)聯(lián)的SSR位點(diǎn)20個(gè)，分布于水稻第1、2、3、4、5、7、8、9、10、11染色體上，表型貢獻(xiàn)率介于2.56%～7.33%，表型貢獻(xiàn)率最高的是位于第9染色體的等位變異RM3600-1，最低的是位于第2染色體的等位變異RM145-1；表型效應(yīng)值介于-7.45～7.84 mg/kg，其中,增效最大的等位變異是I2-3(7.84 mg/kg)，載體種質(zhì)是糧香5號(hào)，減效最大的等位變異是RM530-1(-7.45 mg/kg)，載體種質(zhì)為隆優(yōu)649。不同位點(diǎn)的表型效應(yīng)值不同，且同一位點(diǎn)的不同等位變異間的表型效應(yīng)值也不同，如RM145的3個(gè)等位變異中，前2個(gè)為正值，第3個(gè)則為負(fù)值。

表5 與鐵含量顯著關(guān)聯(lián)的SSR位點(diǎn)及其表型貢獻(xiàn)率、表型效應(yīng)值和載體種質(zhì)Tab.5 SSR loci which were significantly associated with grain iron content and their phenotypiccontribution rate,phenotypic effect value,and carrier germplasm

3 結(jié)論與討論

種質(zhì)資源的遺傳多樣性是遺傳改良及新品種培育中雜交親本選擇的重要依據(jù)。利用分子標(biāo)記對(duì)水稻種質(zhì)遺傳多樣性和群體結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究的報(bào)道較多[27-28]。本研究利用57個(gè)SSR標(biāo)記分析155份粳稻種質(zhì)資源的遺傳多樣性和群體結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，該群體被分為4個(gè)亞群；Nei’s遺傳多樣性指數(shù)和Shannon’s信息指數(shù)平均值分別為0.539 5和1.023 8，均高于伍豪等[29]的結(jié)果，與張曉麗等[30]的研究結(jié)果比較接近，低于湯翠鳳等[31]和張科等[32]的研究結(jié)果。造成這種差異的原因可能與試驗(yàn)群體的大小、來源以及所選用分子標(biāo)記數(shù)量的多少有關(guān)。

隨著分子標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展，QTL定位在微量元素含量研究方面的報(bào)道很多[33-35]。本研究檢測(cè)到控制籽粒鋅含量的位點(diǎn)分布在第1、8染色體上，控制籽粒鐵含量的位點(diǎn)分布在第1、2、3、4、5、7、8、9、10、11染色體上。在水稻第8染色體上檢測(cè)到的與籽粒鋅含量相關(guān)聯(lián)的位點(diǎn)RM7356，與崔文剛[36]檢測(cè)到的QTL位于相同的染色體區(qū)間(RM447—RM7356)，而RM5461和RM5647兩個(gè)位點(diǎn)未見報(bào)道，為新發(fā)現(xiàn)的2個(gè)與鋅含量相關(guān)聯(lián)的位點(diǎn)。與孫明茂[37]的研究結(jié)果相比，本研究與其均在水稻第2、5、8、9、11染色體上檢測(cè)到了與鐵含量相關(guān)聯(lián)的位點(diǎn)，雖然在相同染色體上但是位置不盡相同；另外，本研究發(fā)現(xiàn)的與鐵含量相關(guān)聯(lián)的等位變異I2-3位于王輝[38]報(bào)道的水稻籽粒鐵含量QTL區(qū)間RM6997—RM3367內(nèi)。由于微量元素含量是由微效多基因控制的數(shù)量性狀，所以檢測(cè)結(jié)果受試驗(yàn)材料和環(huán)境影響較大。有研究表明，同一位點(diǎn)可與作物多個(gè)性狀同時(shí)關(guān)聯(lián)，多個(gè)位點(diǎn)也可與作物同一性狀相關(guān)聯(lián)[39]。本研究也得到了類似的結(jié)果，RM7356同時(shí)與鋅、鐵含量相關(guān)聯(lián)，這可能是數(shù)量性狀基因在遺傳上的一因多效所致[40]。

基因聚合分子育種是作物遺傳改良的有效手段，通過多個(gè)有效基因的聚合，不僅可以提高作物的抗性，而且可以提高作物的產(chǎn)量和營養(yǎng)品質(zhì)[41]。在水稻基因聚合分子育種中，抗病基因的聚合育種報(bào)道最多，如抗白葉枯病，PRADHAN等[42]和趙天龍等[43]利用分子標(biāo)記分別將3個(gè)抗水稻白葉枯病基因進(jìn)行了聚合，聚合植株的抗病性均明顯增強(qiáng)；很多學(xué)者也開展了多種病害抗性基因的聚合[44]或抗病、抗蟲基因的聚合[45]，均得到了良好的改良效果。在水稻品質(zhì)方面，張光恒等[46]利用分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)育成了千粒質(zhì)量高、籽粒飽滿具有降血壓作用的功能稻新品系；陳濤等[47]利用相似的方法同時(shí)改良了武育粳3號(hào)的抗病性和食味品質(zhì)。本研究發(fā)現(xiàn)的與籽粒鋅、鐵含量顯著關(guān)聯(lián)且表型效應(yīng)值較高的RM5647-2、I2-3、RM569-3等優(yōu)異等位變異可在基因聚合分子育種中作為選擇標(biāo)記，指導(dǎo)親本組合選配，用于籽粒高鋅、鐵含量后代材料的選擇，為水稻籽粒營養(yǎng)品質(zhì)性狀的改良提供了理論依據(jù)。