王會(huì)聰，袁九龍，王煜恒，張 坤，陳 軍，章海鑫,2

( 1.江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院 畜牧獸醫(yī)學(xué)院，江蘇 句容 212400； 2.江西水產(chǎn)科學(xué)研究所，江西 南昌 330039 )

棘胸蛙(Ranaspinosa)是我國特有的大型兩棲類野生蛙，主要分布在我國南方山區(qū)，是江西省重點(diǎn)保護(hù)動(dòng)物。生活史有蝌蚪期和成蛙期兩個(gè)階段，蝌蚪期為3～8個(gè)月，生活于水中，用鰓呼吸。由于棘胸蛙具有極高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和營養(yǎng)保健價(jià)值[1]而受到市場的熱烈歡迎，所以人工養(yǎng)殖發(fā)展迅速，規(guī)模逐年增加。但隨著養(yǎng)殖規(guī)模的不斷增大，棘胸蛙病害開始增多，給養(yǎng)殖造成了大量的損失。如2014年鷹潭泉源石蛙養(yǎng)殖有限公司就因“腹水”導(dǎo)致春季蝌蚪大量死亡；2015年江西銅鼓棘胸蛙繁育中心幼蛙發(fā)病導(dǎo)致大量死亡；2016年宜春明月山石蛙股份公司蝌蚪出現(xiàn)“腹水”，成蛙出現(xiàn)“瞎眼”等病癥導(dǎo)致大量死亡。目前，已報(bào)道的棘胸蛙疾病有10余種[2]，分別為紅腿病、爛皮病、歪頭病、黑肝病等[3-6]，對(duì)于這些疾病的病原和防治方法等均有研究。雖然這些研究解決了很多棘胸蛙養(yǎng)殖中的病害難題，但較少涉及棘胸蛙蝌蚪的疾病研究，棘胸蛙蝌蚪病害研究鮮見報(bào)道。棘胸蛙養(yǎng)殖過程中蝌蚪期同樣受到各種疾病的侵害，如宜春明月山石蛙股份公司蝌蚪大量死亡就是因?yàn)轵蝌匠霈F(xiàn)“腹水”等問題導(dǎo)致的。這種“腹水、出血”疾病一般在當(dāng)年孵化蝌蚪上出現(xiàn)，越冬蝌蚪很少見，出膜后1個(gè)月到變態(tài)前這段時(shí)間均有發(fā)生。其傳染性強(qiáng)、死亡快，開始蝌蚪聚集在養(yǎng)殖池璧上，然后開始腹部膨脹、心跳加速，部分蝌蚪出現(xiàn)出血，繼而開始死亡，2～3 d后死亡率達(dá)到70%。這種疾病對(duì)于養(yǎng)殖造成了極大的困難，但目前尚未見有關(guān)這種癥狀疾病研究的報(bào)道。僅闕炳根[7]介紹了部分棘胸蛙蝌蚪寄生蟲病、紅腿病、爛鰓病、真菌病的一些防治方法，但并未詳細(xì)介紹蝌蚪疾病的病原，對(duì)于棘胸蛙蝌蚪出現(xiàn)“腹水、出血”等癥狀疾病的研究和防治方法亦未見報(bào)道。因此，筆者針對(duì)棘胸蛙養(yǎng)殖過程中常見的蝌蚪出現(xiàn)“腹水、出血”等癥狀的疾病進(jìn)行初步病原學(xué)研究，以期找到棘胸蛙蝌蚪“腹水病”病原并為治療這種疾病提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

患病蝌蚪取自宜春市三高綠建農(nóng)業(yè)集團(tuán)下屬養(yǎng)殖場，該養(yǎng)殖場在2016年和2017年均大面積暴發(fā)了棘胸蛙蝌蚪“腹水病”。蝌蚪表現(xiàn)為腹部脹大、心跳加速、出血、腹水，不攝食等癥狀。蝌蚪體長為(3.5±1.2) cm。健康蝌蚪(規(guī)格同患病蝌蚪)由江西省水產(chǎn)科學(xué)研究所育種室提供。試驗(yàn)所需引物由北京六合華大科技有限公司合成。

主要試劑：普通營養(yǎng)瓊脂、營養(yǎng)肉湯、生化試驗(yàn)所需試劑盒藥品均購自國藥集團(tuán)；細(xì)菌DNA提取試劑盒購自大連寶生物公司。細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、PCR擴(kuò)增細(xì)菌16S rDNA 試劑盒、TaqDNA聚合酶均購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；藥敏紙片購自杭州微生物試劑有限公司。

1.2 病原菌分離

在無菌條件下將采集到的患病蝌蚪用75%的酒精體表消毒后解剖，分別將在肝臟、腹水和鰓部采集到的細(xì)菌接種于營養(yǎng)瓊脂固體培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)24 h。挑取形態(tài)、顏色、大小等一致且數(shù)量占優(yōu)勢的菌株進(jìn)一步純化培養(yǎng)。純化2次后接種于營養(yǎng)瓊脂斜面，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。同時(shí)將優(yōu)勢菌株培養(yǎng)液與等體積50%甘油混合，于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 人工感染試驗(yàn)

1.3.1 菌株毒性研究

選取健康的棘胸蛙蝌蚪在23 ℃水溫條件下暫養(yǎng)7 d后，分組飼養(yǎng)于 90 cm×60 cm×30 cm的玻璃缸中，每日正常投喂蝌蚪飼料，保持滴水，水溫為22～24 ℃。將純化出來的病原菌擴(kuò)大培養(yǎng)，用無菌生理鹽水配制成菌懸液。將菌懸液制成密度分別為0(生理鹽水為對(duì)照)、2.8×104、2.8×105、2.8×106、2.8×107、2.8×108、2.8×109cfu/mL的菌液，用砂紙輕輕摩擦蝌蚪皮膚使之具有輕微傷痕，將劃傷蝌蚪分別放入各密度菌液中，浸泡20 min后放入原水缸中進(jìn)行暫養(yǎng)，每個(gè)密度菌液10尾蝌蚪，每個(gè)菌液重復(fù)3次。觀察每個(gè)水缸中蝌蚪的死亡情況。并使用Bliss法[8]計(jì)算24、48、96 h菌株半數(shù)致死密度。

1.3.2 蝌蚪回感試驗(yàn)

使用病原菌48 h半數(shù)致死密度進(jìn)行回感試驗(yàn)。用砂紙輕輕摩擦蝌蚪皮膚使之具有輕微傷痕，將劃傷蝌蚪分別放入各密度菌懸液中，浸泡20 min，對(duì)照組在0.65%生理鹽水中浸泡20 min，然后分別放入原水缸，每缸10尾，每日記錄蝌蚪活動(dòng)情況。并從感染患病個(gè)體分離細(xì)菌進(jìn)行純化研究，根據(jù)柯赫法則確定病原菌。

1.4 病原菌鑒定

1.4.1 生化鑒定

病原菌經(jīng)進(jìn)一步純化后，進(jìn)行革蘭氏染色并參照文獻(xiàn)[5]的方法進(jìn)行形態(tài)學(xué)和生理生化檢測鑒定。生化鑒定管及相關(guān)試劑均購自杭州微生物有限公司。

1.4.2 分子鑒定

參照文獻(xiàn)[9]方法對(duì)病原菌進(jìn)行分子鑒定，16S rDNA序列PCR擴(kuò)增，克隆轉(zhuǎn)化后的陽性克隆送上海生工進(jìn)行核苷酸序列測定。將菌株測定的16S rDNA序列與美國國立生物技術(shù)信息中心數(shù)據(jù)庫中細(xì)菌的16S rDNA進(jìn)行比對(duì)。采用Clustal w軟件進(jìn)行多序列匹配分析，用Mega 6.0軟件包中的鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，通過1000次自舉檢驗(yàn)置信度，鑒定病原菌的種類。

1.5 藥敏試驗(yàn)

藥敏試驗(yàn)采用K-B法，將菌株接種于營養(yǎng)肉湯液體培養(yǎng)基，于28 ℃搖床培養(yǎng)20 h后分別涂布營養(yǎng)瓊脂平板。選擇24種藥敏紙片均勻貼于平板，每個(gè)平板貼5片，28 ℃下培養(yǎng) 24 h后測量抑菌圈直徑。參照抗菌藥物敏感試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)[8]確定各種藥物對(duì)病原菌株的敏感性。

2 結(jié) 果

2.1 病原的分離與回感

2017年7—8月自患病蝌蚪肝臟中分離到細(xì)菌4株，分別命名為JK-1、JK-2、JK-3、Jb-1。其中菌株JK-1、JK-2為大菌落，菌株JK-3、Jb-1為小菌落；JK-3菌株菌落黏性較大，接種環(huán)易拉成絲，呈灰白色。預(yù)試驗(yàn)得知菌株JK-3對(duì)蝌蚪有致死能力。對(duì)菌株JK-3進(jìn)行毒性研究，其24、48、96 h半數(shù)致死密度分別為1.2×108、1.2×107、0.8×106cfu/mL(表1)。用菌株JK-3的48 h半數(shù)致死密度進(jìn)行回感試驗(yàn)，結(jié)果見表2。蝌蚪在菌株JK-3密度1.2×107cfu/mL菌液中浸泡20 min后，蝌蚪48 h后出現(xiàn)腹部脹大、心跳加速、體表出血以及腹水等癥狀，并開始死亡，120 h時(shí)已經(jīng)死亡6尾(圖1)。對(duì)患病蝌蚪分離細(xì)菌得到與菌株JK-3菌落形態(tài)一致的菌株。

2.2 生化鑒定結(jié)果

對(duì)菌株JK-3進(jìn)行革蘭氏染色，染色結(jié)果顯示，該菌株為革蘭氏陰性菌，具莢膜，桿狀。同時(shí)選取21種生化指標(biāo)進(jìn)行生化測定，各項(xiàng)指標(biāo)測定結(jié)果(表3)表明，所有生化指標(biāo)與《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》中肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae)指標(biāo)基本一致，初步判斷所分離的病原菌JK-3為肺炎克雷伯菌。

2.3 16S rDNA基因同源性分析

病原菌JK-3所擴(kuò)增的16S rDNA基因序列長度約為1482 bp，對(duì)其測序并提交至GenBank核酸序列數(shù)據(jù)庫，登錄號(hào)為KJ150720.1。將其通過美國國立生物技術(shù)信息中心的Blastn檢索系統(tǒng)進(jìn)行序列同源性分析，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖3)，結(jié)果表明，該菌株與克雷伯菌屬細(xì)菌的16S rDNA基因序列自然聚類，JK-3菌株與檢索出的肺炎克雷伯菌聚為一支，相似性最高為99.5%。結(jié)合生化鑒定結(jié)果，確定菌株JK-3為肺炎克雷伯菌。

表1 JK-3毒性試驗(yàn)結(jié)果

表2 細(xì)菌回感試驗(yàn)結(jié)果

圖2 菌株JK-3 提取DNA電泳圖

項(xiàng)目結(jié)果項(xiàng)目結(jié)果接觸酶+明膠液化+氧化酶-葡萄糖發(fā)酵+H2S-蔗糖+吲哚-甘露醇+甲基紅-麥芽糖+靛基質(zhì)-鳥氨酸脫羧酶-Vp+精氨酸-反硝化+賴氨酸脫羧酶+脲素+奶糖發(fā)酵+丙二酸鹽+鳥氨酸-硝酸鹽還原+

注：“+”為陽性；“-”為陰性.

2.4 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

參照文獻(xiàn)[10]對(duì)肺炎克雷伯菌JK-3進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，結(jié)果見表4。肺炎克雷伯菌JK-3對(duì)美滿霉素、丁胺卡那、復(fù)達(dá)欣、哌拉西林、慶大霉素、先鋒必素、先鋒Ⅳ敏感，對(duì)其他藥物耐藥或中度耐藥。

表4 菌株藥敏試驗(yàn)結(jié)果

注：S表示抑菌圈≥21 mm，為敏感，R表示抑菌圈為≤15 mm，為耐藥，I 表示抑菌圈為16～20 mm，為中度耐藥.

圖3 菌株JK-3 16S rDNA基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹

3 討 論

細(xì)菌感染是引起蛙類病害的主要原因之一，如壺菌(Batrachochytriumdendrobatidis)感染可引起東北林蛙(R.dybowskii)患?jí)鼐11]，腦膜炎敗血癥黃桿菌(Flavobacteriummeningitidis)可引起虎紋蛙(R.tigrinarugulosa)患白內(nèi)障[12]，嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)可引起牛蛙(R.catesbeiana)患紅腿病[13]，棘胸蛙爛皮病由奇異變形桿菌(Proteusmirabilis)引起[5]。棘胸蛙蝌蚪“腹水病”發(fā)病初期腹部脹大，繼而心跳加快，隨后體表出血，腹部有腹水，傳染速度很快，短時(shí)間即能引起棘胸蛙蝌蚪大量死亡，主要流行于夏季。自患病蝌蚪內(nèi)臟中分離到4株細(xì)菌，同時(shí)回感健康蝌蚪，菌株JK-3感染的蝌蚪出現(xiàn)腹部脹大、心跳加快、體表出血和腹水等癥狀，分離菌株形態(tài)與菌株JK-3一致。經(jīng)生化鑒定，菌株JK-3與肺炎克雷伯氏菌[14-15]基本一致；16S rDNA鑒定結(jié)果表明，菌株JK-3與肺炎克雷伯菌相似性達(dá)99.5%。因此確定肺炎克雷伯菌JK-3是棘胸蛙蝌蚪“腹水病”病原菌之一。鄭善堅(jiān)[16]利用梅里埃細(xì)菌生化鑒定儀快速鑒定了另一例棘胸蛙蝌蚪腹水病(腹腔鼓脹呈圓球形，類似氣泡病，肝臟發(fā)紅或發(fā)黃，腸道透明無食)病原為溫和氣單胞菌(A.sobria)。肺炎克雷伯菌[17]與溫和氣單胞菌[16]均為條件致病菌，因此在條件合適的情況下并不排除兩種細(xì)菌均能導(dǎo)致棘胸蛙蝌蚪患病的可能。

克雷伯菌是革蘭氏陰性桿菌，主要有肺炎克雷伯菌、臭鼻克雷伯菌(K.ozaenae)和鼻硬結(jié)克雷伯菌(K.rhinoscleromatis)，其中廣泛存在于水、土壤和谷物中，是陸生動(dòng)物呼吸道和腸道內(nèi)寄生性致病菌，常引起肺炎、泌尿系統(tǒng)疾病，創(chuàng)傷感染敗血癥等[17]，在雞、鼠等動(dòng)物身上均有分離到[18-19]。在水生動(dòng)物中也漸有報(bào)道，如Singh等[20]在魚、蝦、蟹等食品中檢測到肺炎克雷伯菌，研究發(fā)現(xiàn)，肺炎克雷伯菌能引起中華鱉(Trionyxsinensis)[14]、鰻鱺(Anguillajaponica)[21]、鰱魚(Hypophthalmichthysmolitrix)[22]和黃喉擬水龜(Mauremysmutica)[23]患細(xì)菌性疾病，表明肺炎克雷伯菌同樣是水生動(dòng)物致病菌之一。筆者首次在兩棲蛙類(棘胸蛙)蝌蚪體內(nèi)分離到肺炎克雷伯菌，并能引起蝌蚪出現(xiàn)“腹水和出血”等癥狀，死亡率高，具有較高的致病力。由藥敏結(jié)果可知，分離到的肺炎克雷伯菌JK-3對(duì)美滿霉素、丁胺卡那、復(fù)達(dá)欣、哌拉西林、慶大霉素、先鋒必素、先鋒Ⅳ具有一定的敏感性。除慶大霉素外，其余藥物均禁止用于水產(chǎn)動(dòng)物，所以在臨床用藥中只有慶大霉素能夠使用?？捎门R床藥物種類少可能也是這種疾病大面積暴發(fā)的原因之一，所以“腹水病”應(yīng)防大于治，在平日養(yǎng)殖過程中應(yīng)注意消毒，切斷傳染源是預(yù)防該細(xì)菌性疾病的關(guān)鍵所在。