周永昌, 姜曉東, 龍曉文, 蔣火金, 成永旭,4, 吳旭干,4

( 1.上海海洋大學(xué)，水產(chǎn)科學(xué)國(guó)家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心，上海 201306； 2.上海海洋大學(xué)，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部淡水水產(chǎn)種質(zhì)資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 201306； 3.北京漁經(jīng)生物技術(shù)有限責(zé)任公司，北京 101149； 4.上海海洋大學(xué)，水產(chǎn)動(dòng)物遺傳育種中心，上海市協(xié)同創(chuàng)新中心，上海 201306 )

中華絨螯蟹(Eriocheirsinensis)是我國(guó)重要的淡水名特優(yōu)養(yǎng)殖對(duì)象，中華絨螯蟹養(yǎng)殖業(yè)已迅速發(fā)展成規(guī)?；娜斯ゐB(yǎng)殖體系[1]。池塘養(yǎng)殖是我國(guó)目前中華絨螯蟹養(yǎng)殖的主要方式，養(yǎng)殖周期通常為兩年，第一年為扣蟹養(yǎng)殖，亦稱1齡蟹種培育，指從大眼幼體養(yǎng)殖至體質(zhì)量為5～10 g的蟹種(扣蟹)[2]。隨著扣蟹養(yǎng)殖規(guī)模不斷擴(kuò)大、集約化程度的提高以及生存環(huán)境的惡化，疾病的危害程度越來(lái)越大，特別是“水鱉子”病、顫抖病、爛鰓病等疾病頻繁發(fā)生，已成為中華絨螯蟹養(yǎng)殖業(yè)穩(wěn)步發(fā)展的主要障礙[3-4]。此外，為防治這些疾病，養(yǎng)殖生產(chǎn)中常濫用抗生素和其他化學(xué)類(lèi)藥物，導(dǎo)致病原菌的抗藥性增強(qiáng), 蟹體免疫力下降[5]。此外，由于在人工育苗過(guò)程中采用小規(guī)格親本近親繁殖以及不同水系間的盲目引種，長(zhǎng)江水系主要池塘養(yǎng)殖群體種質(zhì)退化嚴(yán)重，使幼蟹的免疫和生長(zhǎng)均受到影響[6-8]。因此，研究用于扣蟹疾病防治和免疫增強(qiáng)的無(wú)公害藥物變得迫切和亟需。

已有研究表明，中草藥富含多糖、甙類(lèi)、生物堿、苦味素、生物類(lèi)黃酮等多種有效成分，不僅可以提高營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的利用效率以及增強(qiáng)機(jī)體新陳代謝，促進(jìn)機(jī)體生長(zhǎng)，還能調(diào)節(jié)機(jī)體內(nèi)的抗疾病生理機(jī)制，改善和提高免疫功能，并且擁有價(jià)格低廉、來(lái)源豐富、不易污染環(huán)境等優(yōu)點(diǎn)，因而已成為水產(chǎn)養(yǎng)殖中非常適宜的免疫增強(qiáng)劑[9-12]。目前國(guó)內(nèi)將中草藥作為甲殼動(dòng)物免疫增強(qiáng)劑的研究有較多報(bào)道，但主要集中在中國(guó)明對(duì)蝦(Fenneropenaeuschinensis)、凡納濱對(duì)蝦(Litopenaeausvannarnei)等幾種蝦類(lèi)養(yǎng)殖上，有關(guān)飼料中添加中草藥對(duì)中華絨螯蟹在豆蟹階段的生長(zhǎng)和免疫抗氧化能力影響方面的報(bào)道較少。為開(kāi)發(fā)適合幼蟹養(yǎng)殖的天然藥物，筆者嘗試在幼蟹飼料中添加含有甘草、人參、絞股藍(lán)、銀杏葉的復(fù)方中草藥添加劑，探究其對(duì)中華絨螯蟹幼蟹成活率、生長(zhǎng)性能、抗氧化能力及免疫力的影響，并探討促進(jìn)中華絨螯蟹幼蟹生長(zhǎng)及免疫抗氧化能力的適宜劑量，以期為科學(xué)配制河蟹飼料、開(kāi)發(fā)飼料添加劑以及提高扣蟹養(yǎng)殖的經(jīng)濟(jì)和生態(tài)效益提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)飼料

試驗(yàn)飼料以魚(yú)粉、豆粕和菜籽粕等為蛋白源，以魚(yú)油、菜籽油和大豆油等為脂肪源配制基礎(chǔ)飼料。復(fù)方中草藥原料由北京某生物技術(shù)有限公司提供，由甘草、絞股藍(lán)、銀杏葉和人參(須)以1∶1∶2∶6的質(zhì)量比配伍而成。4種中草藥干燥超微粉碎后分別以0(對(duì)照組)、1.0 g/kg和2 g/kg添加至基礎(chǔ)飼料中，制成3種等氮等脂飼料。飼料配制前，所有原料粉碎后過(guò)80目篩，按照飼料配方中各原料的比例手工混勻后，將脂肪源和復(fù)方中草藥混合后加入粉料中均勻混合，再加入30%的蒸餾水手工混勻，最后用膨化機(jī)制成粒徑約2 mm、長(zhǎng)4～5 mm的沉性膨化飼料，在室溫下風(fēng)干后，裝入自封袋中于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?。試?yàn)飼料常規(guī)營(yíng)養(yǎng)成分見(jiàn)表1。

表1 試驗(yàn)飼料的常規(guī)營(yíng)養(yǎng)成分含量(干質(zhì)量) %

注：飼料常規(guī)營(yíng)養(yǎng)組成參考文獻(xiàn)[13]的標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)定.

1.2 試驗(yàn)蟹及養(yǎng)殖管理

試驗(yàn)用幼蟹取上海海洋大學(xué)崇明基地，挑選四肢健全、活力較好，體質(zhì)量0.3～0.5 g，處于蛻殼間期的幼蟹。養(yǎng)殖試驗(yàn)在室內(nèi)循環(huán)水系統(tǒng)28 cm×21 cm×17.5 cm單個(gè)塑料盒中進(jìn)行。盒子四周和底部有小孔，便于水體流通和排污。每個(gè)盒子中放入1只幼蟹，每個(gè)飼料組重復(fù)24只幼蟹(雌雄各12只)，盒子底部放置瓦片作隱蔽物。試驗(yàn)期間水深約12 cm，連續(xù)24 h充氧，采用40 W日光燈為光源, 光暗比12 h∶12 h。試驗(yàn)蟹用基礎(chǔ)飼料暫養(yǎng)3～5 d后，開(kāi)始投喂試驗(yàn)飼料。

養(yǎng)殖期間，每日16:00給幼蟹投喂試驗(yàn)飼料，投喂量根據(jù)水溫和殘餌情況調(diào)整。當(dāng)水溫高于20 ℃時(shí)，投喂量為幼蟹體質(zhì)量的2%～3%；當(dāng)水溫為15～20 ℃時(shí)，投喂量為體質(zhì)量的1%～2.5%，喂后3 h觀察殘餌。每日8:00觀察并記錄每個(gè)盒子中殘餌、試驗(yàn)蟹的蛻殼和死亡情況，虹吸法吸出糞便和殘餌。每3 d測(cè)定水質(zhì)指標(biāo)1次，根據(jù)水質(zhì)換水或補(bǔ)充新水。養(yǎng)殖期間，pH 7.0～9.0，溶解氧>4 mg/L，氨氮<0.5 mg/L，亞硝酸鹽<0.15 mg/L。幼蟹蛻殼一次后即開(kāi)始正式試驗(yàn)，試驗(yàn)中測(cè)量并記錄每只蟹蛻殼后3～5 d的體質(zhì)量、殼長(zhǎng)和殼寬，待80%以上個(gè)體完成兩次完整的蛻殼即停止試驗(yàn)，統(tǒng)計(jì)各組幼蟹成活率、質(zhì)量增加率、特定生長(zhǎng)率及蛻皮間隔。

1.3 樣品采集

試驗(yàn)期間，用毛巾將完成兩次蛻殼后3～5 d幼蟹體表水分擦干，用電子天平(精確度=0.01 g)稱量體質(zhì)量，用游標(biāo)卡尺(精確度=0.02 mm)測(cè)量殼長(zhǎng)和殼寬；然后用0.5 mL微量注射器自幼蟹第三步足基部抽取約0.1 mL血淋巴，注入0.5 mL離心管中，于-80 ℃保存用于分析生化指標(biāo)；將頭胸甲與軀體分離，取出全部肝胰腺，準(zhǔn)確稱量質(zhì)量后計(jì)算肝胰腺指數(shù)。將肝胰腺、殼和軀體(剔除附肢)裝入自封袋中于-40 ℃保存，用于后續(xù)分析。

1.4 樣品制備、抗氧化及免疫指標(biāo)測(cè)定

將血淋巴解凍，用微型勻漿器勻漿30 s后，在4 ℃，12 000 r/min下離心20 min，取出上清液(血清)待測(cè)。稱取約0.2 g的肝胰腺，加入1 mL(m/V= 1∶5)預(yù)冷的生理鹽水，用微型勻漿器(T10B，德國(guó)IKA公司生產(chǎn))勻漿30 s后，于4 ℃，12 000 r/min下離心20 min，取中間清液再次離心后，再次取中間清液用于后續(xù)分析。采用分光光度計(jì)(T6新世紀(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)和南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的試劑盒測(cè)定樣品中的總抗氧化能力、超氧化物歧化酶、堿性磷酸酶、酸性磷酸酶活力及總蛋白和丙二醛含量。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析及指標(biāo)計(jì)算

所有數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用Levene法進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，當(dāng)不滿足齊性方差時(shí)對(duì)百分比數(shù)據(jù)進(jìn)行反正弦或平方根處理。采用單因素方差分析，用Duncan法進(jìn)行多重比較，取P<0.05為差異顯著。按下式計(jì)算成活率、質(zhì)量增加率、特定生長(zhǎng)率、蛻殼間隔及肝胰腺指數(shù)：

成活率/%=n2/n1×100%

質(zhì)量增加率/%=(m2-m1)/m1×100%

特定生長(zhǎng)率/%·d-1=(lnm2-lnm1)/t×100%

肝胰腺指數(shù)/%=m3/m×100%

式中，n1為完成一次蛻殼后幼蟹的總數(shù)量，n2為幼蟹存活數(shù)量，m1為第一次蛻殼后體質(zhì)量(g)，m2為幼蟹試驗(yàn)后末質(zhì)量(g)，t為蛻殼間隔(d)，m3為幼蟹肝胰腺質(zhì)量(g)，m為幼蟹體質(zhì)量(g)。

2 結(jié)果與分析

2.1 幼蟹攝食復(fù)方中草藥飼料的成活率、生長(zhǎng)性能和肝胰腺指數(shù)

飼料中添加復(fù)方中草藥對(duì)雄蟹的成活率、二次蛻殼后體質(zhì)量生長(zhǎng)和肝胰腺指數(shù)均無(wú)顯著影響(P>0.05)(表2)。但雄體質(zhì)量增加率和特定生長(zhǎng)率均隨復(fù)方中草藥添加水平的升高而顯著升高，蛻皮間隔呈顯著縮短(P<0.05)。各組雌幼蟹的成活率、二次蛻殼后體質(zhì)量均無(wú)顯著差異(P>0.05)，且1.0、2.0 g/kg添加組雌幼蟹的體質(zhì)量增加率和特定生長(zhǎng)率顯著高于對(duì)照組(P<0.05)；蛻皮間隔和肝胰腺指數(shù)隨復(fù)方中草藥添加水平的升高而顯著降低(P<0.05)。

2.2 幼蟹攝食復(fù)方中草藥飼料的抗氧化能力及免疫力

各飼料組雄蟹血清中超氧化物歧化酶和堿性磷酸酶的活力均無(wú)顯著差異(P>0.05)，而丙二醛含量、總抗氧化能力和酸性磷酸酶活力均隨中草藥添加水平的升高而顯著上升(P<0.05)(表3)。各組雄蟹的總抗氧化能力活力無(wú)顯著差異，而1.0 g/kg添加組的超氧化物歧化酶、酸性磷酸酶和堿性磷酸酶活力均顯著高于其他組(P<0.05)；而肝胰腺中的丙二醛的含量隨復(fù)方中草藥添加水平的升高而顯著降低(P<0.05)。

各組雌性幼蟹血清中的總抗氧化能力和超氧化物歧化酶活力無(wú)顯著差異，而1.0、2.0 g/kg添加組血清中的丙二醛含量、酸性磷酸酶和堿性磷酸酶的活力均隨復(fù)方中草藥添加水平的升高而顯著升高(P<0.05)(表4)。各飼料組雌體肝胰腺中的總抗氧化能力、酸性磷酸酶和堿性磷酸酶活力均差異不顯著；1.0 g/kg添加組超氧化物歧化酶活力顯著高于其他組，其余兩組間差異不顯著(P<0.05)，而肝胰腺中的丙二醛含量以對(duì)照組最高、2.0 g/kg添加組次之、1.0 g/kg添加組最低(P<0.05)。

表2 復(fù)方中草藥飼料對(duì)幼蟹雄體成活、生長(zhǎng)性能和肝胰腺指數(shù)的影響

注：同行數(shù)據(jù)不含相同字母表示差異顯著(P<0.05)，下同.

表3 復(fù)方中草藥飼料對(duì)幼蟹雄體抗氧化及免疫指標(biāo)的影響

表4 復(fù)方中草藥飼料對(duì)幼蟹雌體抗氧化及免疫指標(biāo)的影響

3 討 論

3.1 復(fù)方中草藥添加量對(duì)幼蟹生長(zhǎng)性能和肝胰腺指數(shù)的影響

中草藥含有多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和生物活性成分，兼有藥用、營(yíng)養(yǎng)、誘食及抗菌等多種功效，適量添加能改善機(jī)體對(duì)飼料中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化和利用率，提高生長(zhǎng)速度[15]。孫學(xué)亮等[16]將3種復(fù)方中草藥分別添加到中華絨螯蟹基礎(chǔ)飼料中并飼喂8周后，中華絨螯蟹個(gè)體的體質(zhì)量和豐滿度均顯著高于對(duì)照組；李思明等[17]將薄荷、山楂等按比例添加到基礎(chǔ)飼料中并飼喂中華絨螯蟹60 d后，除0.1 g/kg添加組外，其余各組中華絨螯蟹個(gè)體的質(zhì)量增加率和特定生長(zhǎng)率均顯著高于對(duì)照組。經(jīng)過(guò)兩個(gè)蛻殼周期的單個(gè)體養(yǎng)殖，本試驗(yàn)中草藥添加組個(gè)體的質(zhì)量增加率和特定生長(zhǎng)率均顯著優(yōu)于對(duì)照組(P<0.05)，且生長(zhǎng)速度的改善效果隨中草藥添加量的增加而顯著提升，說(shuō)明本研究所用復(fù)方中草藥可促進(jìn)幼蟹的生長(zhǎng)性能，這可能與中草藥制劑中含有許多提高機(jī)體蛋白酶活性、促進(jìn)幼蟹消化吸收進(jìn)而提升幼蟹生長(zhǎng)速度的成分有關(guān)[18-19]。此外，中草藥本身雖不是激素，但可以達(dá)到與激素相似的作用，如人參等具有雌激素樣作用，可以調(diào)控中華絨螯蟹幼體的生長(zhǎng)，促使幼蟹及時(shí)蛻皮，排除蛻殼障礙[20-21]。

肝胰腺為十足目甲殼動(dòng)物消化系統(tǒng)的重要組成部分，主要功能是合成與分泌消化酶及吸收、貯存營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，其中脂類(lèi)營(yíng)養(yǎng)在幼體物質(zhì)代謝和能量代謝中占重要地位[22]。本試驗(yàn)中，雌、雄幼蟹的肝胰腺指數(shù)隨復(fù)方中草藥添加量的增加而下降，表明復(fù)方中草藥對(duì)幼蟹肝臟脂肪的積累有一定的抑制作用。這可能與中草藥中富含生物堿相關(guān)。有研究表明，植源性生物堿可促進(jìn)肝臟中脂肪的β氧化，降低幼蟹肝脂的含量[23-24]。中草藥還可以促進(jìn)機(jī)體肝臟的生理代謝機(jī)能，解脂肪累積或藥物慢性中毒造成的肝臟損傷及修復(fù)肝細(xì)胞的效果，從而達(dá)到“保肝”的作用[25]。

3.2 復(fù)方中草藥添加量對(duì)幼蟹抗氧化能力及免疫力的影響

蝦、蟹等甲殼動(dòng)物的免疫系統(tǒng)無(wú)特異性免疫，主要以體液免疫中的免疫相關(guān)酶和免疫因子來(lái)提高甲殼動(dòng)物的自身免疫力而抵御病害[26]。堿性磷酸酶和酸性磷酸酶是甲殼動(dòng)物體液免疫中兩種重要的非特異性磷酸水解酶，不僅參與免疫反應(yīng)過(guò)程中病原微生物的清除工作，而且參與機(jī)體內(nèi)各種基本調(diào)節(jié)功能，常作為評(píng)估甲殼動(dòng)物免疫狀態(tài)的可靠指標(biāo)[27-28]。研究發(fā)現(xiàn)，在蟹類(lèi)飼料中添加中草藥提取物可顯著增加體內(nèi)堿性磷酸酶活性。李思明等[17]發(fā)現(xiàn)，在飼料中添加0.5～1.5 g/kg蘆筍、薄荷葉和山楂等可顯著提高中華絨螯蟹血淋巴中堿性磷酸酶的活性；許振國(guó)等[5]也證實(shí)，板藍(lán)根、黃芩和黃芪等顯著提高了中華絨螯蟹血淋巴中堿性磷酸酶的活性；謝麗玲等[29]研究表明，飼料中添加黃芪等顯著提高了鋸緣青蟹(Scyllaserrata)血淋巴內(nèi)堿性磷酸酶的活性。本研究中酸性磷酸酶和堿性磷酸酶活力均隨復(fù)方中草藥添加水平的增加而顯著提升(P<0.05)，與已有的結(jié)果一致，這可能與中草藥中的免疫活性物質(zhì)相關(guān)，如甘草中的多糖可以提高機(jī)體免疫力[9]，人參中的人參皂苷具有增強(qiáng)網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的吞噬功能，促進(jìn)抗體的生成及抗原抗體反應(yīng)，提高機(jī)體免疫力和抗應(yīng)激能力[12]。

抗氧化能力和超氧化物歧化酶均為評(píng)價(jià)甲殼動(dòng)物抗氧化能力的重要指標(biāo)[30]。丙二醛是機(jī)體脂質(zhì)受自由基作用生成的過(guò)氧化代謝產(chǎn)物，其含量在一定程度上可以間接反映機(jī)體細(xì)胞損傷的程度[31]。本研究中，復(fù)方中草藥添加量為1.0 g/kg時(shí)抗氧化能力和超氧化物歧化酶等抗氧化指標(biāo)顯著提升，而當(dāng)添加量為2.0 g/kg時(shí)，抗氧化指標(biāo)又回落至對(duì)照組水平。由此可見(jiàn)，中草藥對(duì)機(jī)體具有雙向調(diào)節(jié)作用，抗氧化能力的改善效果并非隨添加量的增加而不斷增強(qiáng)，適量添加對(duì)機(jī)體抗氧化能力有促進(jìn)作用，而過(guò)量添加會(huì)產(chǎn)生一定的負(fù)作用。

本次試驗(yàn)結(jié)果表明，飼料中添加的復(fù)方中草藥劑量以1.0 g/kg為宜，可以更好地提高飼料的利用率，提高幼蟹的生長(zhǎng)性能和免疫性能。該添加量與已有的研究結(jié)果存在一定差異，這可能與中草藥的種類(lèi)、配比以及中華絨螯蟹的不同生長(zhǎng)階段有關(guān)[5,16-17,32-33]。