楊 虹，苗鵬飛，譚淑雯，楊 映，吳勇亮，陳言峰，于 輝

( 佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院 生命科學(xué)與工程學(xué)院，廣東 佛山 528231 )

隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展，抗生素廣泛使用及不正當(dāng)使用，導(dǎo)致藥物殘留、細(xì)菌多重耐藥和環(huán)境污染等問題日益突出[11]。類志賀鄰單胞菌作為水產(chǎn)動物消化道炎癥的新病原之一，給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。通過加強類志賀鄰單胞菌的耐藥基因檢測，進(jìn)一步研究其耐藥機(jī)制成為目前防治類志賀鄰單胞菌的重要手段。筆者對從臨床分離到的55株類志賀鄰單胞菌進(jìn)行耐藥基因檢測，并對抗生素藥物的耐藥性與相應(yīng)耐藥基因關(guān)系進(jìn)行分析，從而對類志賀鄰單胞菌的耐藥水平做出更精準(zhǔn)客觀的評價，以期為類志賀鄰單胞菌的預(yù)防和治療及其多重耐藥機(jī)制的進(jìn)一步研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌株

試驗用55株類志賀鄰單胞菌分離株，分離自廣東省佛山市順德區(qū)和南海區(qū)，中山市等地區(qū)患病的鱖魚(Sinipercachuatsi)、加州鱸(Micropterussalmoides)和烏鱧(Ophiocephalusargus)，由本實驗室鑒定并保存。

1.2 主要試驗試劑

營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(廣東環(huán)凱微生物科技有限公司)；腦心浸液肉湯培養(yǎng)基(中國青島高科園海博生物技術(shù)有限公司)；抗生素藥敏紙片(杭州微生物試劑有限公司)；細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒[生工生物工程(上海)股份有限公司]；2×EasyTaq PCR SuperMix(北京全式金生物技術(shù)有限公司)；DNA Marker[寶生物工程(大連)有限公司]；瓊脂糖(深圳市普博科技有限公司)。

1.3 菌株培養(yǎng)與藥敏試驗

無菌條件下，挑取類志賀鄰單胞菌菌株于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，28 ℃恒溫?fù)u床120 r/min振蕩培養(yǎng)24 h后，采用麥?zhǔn)媳葷岱ㄕ{(diào)整類志賀鄰單胞菌菌液濁度為0.5麥?zhǔn)媳葷峁軡岫?。采用K-B紙片擴(kuò)散法進(jìn)行藥敏試驗，測定抑菌圈大小，藥敏結(jié)果以美國臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)委員會標(biāo)準(zhǔn)為判斷標(biāo)準(zhǔn)。在無菌條件下用棉拭子蘸取已純化的含有類志賀鄰單胞菌的菌液，均勻地涂布于普通瓊脂平板上，將藥敏紙片緊貼于已接種類志賀鄰單胞菌的培養(yǎng)基上，28 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，隨后測量抑菌圈直徑的大小，根據(jù)判讀標(biāo)準(zhǔn)判別結(jié)果。

1.4 細(xì)菌DNA提取和耐藥基因檢測

按照細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒的操作說明提取細(xì)菌DNA，作為PCR模板，于-20 ℃保存。參照文獻(xiàn)[12-14]設(shè)計β-內(nèi)酰胺類、喹諾酮類和四環(huán)素類耐藥基因(TEM、gyrB和tetR)引物，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。PCR引物序列和產(chǎn)物長度見表1。PCR反應(yīng)體系為20 μL：無菌超純水10 μL，2×EasyTaq PCR SuperMix 7 μL，上、下游引物各1 μL，細(xì)菌DNA模板1 μL。PCR反應(yīng)條件為：94 ℃，3 min；94 ℃，30 s； 53 ℃，30 s；72，1 min； 72 ℃，5 min。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測。

表1 耐藥基因引物序列

2 結(jié) 果

2.1 類志賀鄰單胞菌的耐藥性

所分離到的類志賀鄰單胞菌對30種抗生素藥物均產(chǎn)生不同程度的耐藥性(表2～表3)，其中對克林霉素、萬古霉素、氨芐西林、麥迪霉素、羧芐西林、苯唑西林等6種抗生素藥物的耐藥性較高，耐藥率分別為98.2%、98.2%、90.9%、89.1%、89.1%和87.3%；對卡那霉素、丁胺卡那、哌拉西林、諾氟沙星、四環(huán)素、頭孢拉定、頭孢氨芐等多種抗生素藥物的敏感和耐藥性具有明顯的菌株差異；而對頭孢唑啉、頭孢曲松、頭孢他啶、多黏菌素B、氧氟沙星、米諾環(huán)素和頭孢呋辛等則高度敏感。值得注意的是，全部的類志賀鄰單胞菌均表現(xiàn)為嚴(yán)重的多重耐藥，其中有1株高達(dá)18重耐藥，最少的也對5種抗生素耐藥，多重耐藥率為100%。

表2 55株類志賀鄰單胞菌的藥敏性

續(xù)表2

抗生素種類敏感率/%中介率/%耐藥率/%陽性菌株數(shù)百分比/%喹諾酮類諾氟沙星65.510.923.6氧氟沙星81.814.63.6環(huán)丙沙星56.42023.6哌拉西林30.912049.11323.64氨基糖苷類卡那霉素41.836.421.8丁胺卡那74.67.318.2慶大霉素70.912.716.4新霉素69.12010.91730.91大環(huán)內(nèi)酯類麥迪霉素010.989.1紅霉素5.527.367.34887.28多肽類萬古霉素01.898.25396.36黏菌素類多黏菌素B90.95.53.623.64硝基呋喃類呋喃唑酮96.41.81.811.82磺胺類復(fù)方新諾明16.49.174.54174.54林可霉素類克林霉素1.82098.25498.18

注：至少對1種抗生素產(chǎn)生耐藥的菌株即為陽性菌株.

表3 類志賀鄰單胞菌多重耐藥檢出率

2.2 類志賀鄰單胞菌耐藥基因的檢測

TEM、gyrB和tetR基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果見圖1，檢測目的片段大小與預(yù)期結(jié)果一致。檢測結(jié)果顯示(表4)，55株菌株中10株攜帶TEM基因，37株攜帶gyrB基因以及20株攜帶tetR基因，攜帶率分別為18.2%、67.3%和36.6%；還有16株未檢測到上述3種耐藥基因。另外，攜帶1種耐藥基因的有18株，占耐藥菌株的46.2%；攜帶2種和3種耐藥基因的分別占到耐藥菌株的38.5%和15.4%。

圖1 TEM、gyrB、tetR基因PCR電泳圖M：DL2000 DNA Marker；1～3：TEM基因；4～6：gyrB基因；7～9：tetR基因；10：陰性對照.

耐藥基因菌株數(shù)檢出率/%TEM1018.2gyrB3767.3tetR2036.6TEM+gyrB916.4TEM+tetR610.9gyrB+tetR1832.7TEM+tetR+gyrB610.9無1629.1

通過對55株類志賀鄰單胞菌的耐藥基因與耐藥表型檢測結(jié)果比較發(fā)現(xiàn)，所檢測的菌株對β-內(nèi)酰胺類和四環(huán)素類的耐藥基因與耐藥表型的符合率分別18.18%和100%。然而，藥敏結(jié)果顯示，類志賀鄰單胞菌對喹諾酮類抗生素十分敏感，但gyrB基因的檢出率卻很高，耐藥菌株的耐藥基因和耐藥表型之間存在較大的差異。

3 討 論

本研究所檢測的55株類志賀鄰單胞菌對30種抗生素藥物均有一定程度的耐藥，其中對克林霉素、萬古霉素、氨芐西林、麥迪霉素、羧芐西林、苯唑西林等抗生素具有很強的耐受力，臨床治療類志賀鄰單胞菌感染要盡量減少使用這些抗生素。對頭孢唑啉、頭孢曲松、頭孢他啶、多黏菌素B、氧氟沙星、米諾環(huán)素、頭孢呋辛等抗生素則高度敏感，對卡那霉素、丁胺卡那、哌拉西林、諾氟沙星、四環(huán)素、頭孢拉定、頭孢氨芐等敏感性次之，表明類志賀鄰單胞菌對這幾種抗生素并未產(chǎn)生嚴(yán)重的耐藥性，在臨床防治類志賀鄰單胞菌感染中可以使用，但是要避免單一使用導(dǎo)致類志賀鄰單胞菌耐藥性變異。此外，藥敏試驗結(jié)果顯示，類志賀鄰單胞菌最低的也達(dá)到了5重耐藥，最多的達(dá)18重耐藥，提示類志賀鄰單胞菌存在嚴(yán)重的多重耐藥，應(yīng)該引起重視。同時，藥敏試驗結(jié)果與已報道分離的類志賀鄰單胞菌不盡一致[14-17]，應(yīng)該是與地域分布、環(huán)境因素差異、不同宿主以及養(yǎng)殖者使用抗生素的習(xí)慣不同等有關(guān)。因此在該病害的防治過程中，更應(yīng)參照分離株的藥敏試驗結(jié)果，科學(xué)合理地使用抗生素，才能達(dá)到有效治療的目的。

β-內(nèi)酰胺類抗生素是最早、最廣泛使用的一類抗生素。由質(zhì)粒介導(dǎo)的超廣譜β-內(nèi)酰胺酶對菌體內(nèi)的窄譜和廣譜頭孢菌素、單環(huán)類抗生素及G-桿菌青霉素等抗生素有較好的破壞作用。有研究證實，質(zhì)粒介導(dǎo)的β-內(nèi)酰胺酶產(chǎn)生的耐藥菌，其耐藥性大多是在接觸抗生素后獲得的，并通過耐藥基因在同種或異種菌株間轉(zhuǎn)移或傳播，使得更多的細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性[18]。本試驗分離到的菌株對氨芐西林、羧芐西林、苯唑西林等抗生素耐藥，但TEM基因的檢出率較低，耐藥菌株可能存在其他未檢測耐藥基因以及不同的耐藥機(jī)制。因此，臨床治療應(yīng)該謹(jǐn)慎使用各類抗生素，防止細(xì)菌攜帶的耐藥基因被大量誘導(dǎo)表達(dá)，導(dǎo)致多重耐藥。

喹諾酮類抗生素的使用量僅次于β-內(nèi)酰胺類。喹諾酮類抗生素對革蘭氏陰性菌的主要作用靶位點是DNA旋轉(zhuǎn)酶，而gyrB正是編碼DNA旋轉(zhuǎn)酶B亞單位蛋白的基因[19]。gyrB基因的突變會引起靶位酶的改變，使得喹諾酮類抗生素不能正常與DNA旋轉(zhuǎn)酶正常結(jié)合，因而不能阻止細(xì)菌DNA復(fù)制，從而產(chǎn)生耐藥。本研究的55株菌株中，gyrB基因的攜帶率為67.3%，而且特異性條帶明亮，但大部分菌株對諾氟沙星、環(huán)丙沙星等耐藥性很低，耐藥表型與耐藥基因之間存在較大的差異，說明類志賀鄰單胞菌菌株存在潛在的耐藥性，可能與耐藥基因的誘導(dǎo)性表達(dá)，或者耐藥基因不表達(dá)或表達(dá)不完全相關(guān)。

四環(huán)素類抗生素的耐藥機(jī)制主要為核糖體保護(hù)機(jī)制和藥物外運機(jī)制，而tetR基因調(diào)控核糖體蛋白及參與藥物外運的外運蛋白基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，且具有高度特異性和保守性[20]。當(dāng)細(xì)菌的生存環(huán)境中沒有四環(huán)素類藥物或者其衍生物的存在時，tetR基因會與結(jié)構(gòu)基因的啟動子tetO結(jié)合，從而抑制四環(huán)素類耐藥基因的表達(dá)；一旦四環(huán)素類藥物進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞后，便會與tetR結(jié)合致其構(gòu)型發(fā)生改變，使其從tetO序列上解離下來，隨之激活了四環(huán)素類耐藥基因的表達(dá)[21]。本試驗所檢測的55株類志賀鄰單胞菌中tetR基因的攜帶率較低，藥敏試驗結(jié)果顯示，類志賀鄰單胞菌對四環(huán)素、多西環(huán)素、米諾環(huán)素等耐藥性也偏低，說明tetR基因的攜帶情況與耐藥菌株的四環(huán)素耐藥表型存在一定的相關(guān)性。

細(xì)菌耐藥性與其本身特性、耐藥性基因的傳播以及地域、藥物使用情況等因素有很大的關(guān)系。養(yǎng)殖水環(huán)境中和動物體內(nèi)殘留的抗生素對水產(chǎn)動物養(yǎng)殖帶來了嚴(yán)重的不良影響。絕大多數(shù)細(xì)菌的耐藥性是通過耐藥基因產(chǎn)生、獲得和表達(dá)來實現(xiàn)[22]。當(dāng)抗生素殘留，可以誘導(dǎo)細(xì)菌耐藥性產(chǎn)生、耐藥基因水平擴(kuò)散或垂直傳播，導(dǎo)致該菌對抗生素的耐藥性增強，加大了該菌治療的難度。近年來，減少進(jìn)而阻止細(xì)菌耐藥的傳遞成為廣受養(yǎng)殖戶關(guān)注的問題。本試驗結(jié)果表明，類志賀鄰單胞菌耐藥基因和耐藥表型尚未完全對應(yīng)，有些菌株已檢測到耐藥基因，但未表現(xiàn)出相關(guān)耐藥性；有些菌株則未檢測到相應(yīng)的耐藥基因，卻表現(xiàn)出較強的耐藥性。因此，亟需進(jìn)一步深入研究類志賀鄰單胞菌的耐藥機(jī)制，為防止類志賀鄰單胞菌耐藥性的產(chǎn)生和傳播以及魚病的治療提供理論依據(jù)。