吳成柱,趙玉茹,李紅梅

(1蚌埠醫(yī)學(xué)院藥物化學(xué)教研室,蚌埠 233030;2安徽省生化藥物工程技術(shù)研究中心;3蚌埠醫(yī)學(xué)院中醫(yī)藥基礎(chǔ)教研室;*通訊作者,E-mail:athongmei@foxmail.com)

乳腺癌的發(fā)病率位居女性惡性腫瘤的首位,并呈現(xiàn)逐年增高的趨勢,嚴重危害著女性健康和生命[1-3]。研究表明,侵襲與轉(zhuǎn)移是乳腺癌患者治療失敗和死亡的主要原因之一[4]。因此,尋找有效、安全的抑制乳腺癌細胞侵襲和轉(zhuǎn)移的藥物是治療乳腺癌的重要策略。

熱休克蛋白90(heat shock protein 90,Hsp90)作為分子伴侶蛋白,參與細胞內(nèi)眾多顧客蛋白的構(gòu)象成熟和穩(wěn)定,其顧客蛋白包括Akt、Raf、Her-2、HIF-1α及突變信號蛋白p53等[5,6]。Hsp90與腫瘤細胞的增殖、凋亡、侵襲與轉(zhuǎn)移密切相關(guān),已成為了抗腫瘤藥物研發(fā)的重要靶點之一[7]。天然產(chǎn)物WK-88-1是一種從放線菌株(Streptomyces hygroscopicus AC2)培養(yǎng)液中分離得到的安莎霉素類化合物[8]。作為典型的Hsp90抑制劑,WK-88-1具有低肝毒性的同時,還具有較強的抗腫瘤活性,如抑制非小細胞肺癌細胞增殖、遷移與侵襲,誘導(dǎo)乳腺癌細胞凋亡和細胞周期阻滯等作用[9-11]。然而,WK-88-1對乳腺癌細胞的遷移與侵襲的相關(guān)研究未見報道。因此,本研究以人乳腺癌MDA-MB-231和MCF-7為細胞模型,首次探討WK-88-1對乳腺癌細胞的遷移與侵襲的影響,并對其可能機制進行初步研究,為治療乳腺癌侵襲與轉(zhuǎn)移提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細胞株及主要試劑

人乳腺癌MDA-MB-231和MCF-7細胞購于中科院上海細胞庫。胎牛血清(四季青公司,中國),DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶(Gibco公司,美國),MTT試劑、氯化鈷(CoCl2)、二甲基亞砜(DMSO)(Sigma公司,美國),Transwell小室(Corning公司,美國),Matrigel基質(zhì)膠(BD公司,美國),兔抗人HIF-1α(Abcom公司,英國),兔抗人MMP-9、鼠抗人β-actin(Santa Cruz公司,美國)。WK-88-1是本課題組從放線菌株S.hygroscopicus AC2中分離純化得到,經(jīng)HPLC分析檢測其純度>95%[11]。

1.2 細胞培養(yǎng)及MTT法檢測細胞存活率

人乳腺癌MDA-MB-231和MCF-7細胞使用DMEM培養(yǎng)基(含有10%胎牛血清,100 U/ml青霉素,100 mg/L鏈霉素,3.7 g/L碳酸氫鈉),放置于37 ℃、飽和濕度、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對數(shù)生長期的細胞,經(jīng)0.25%胰蛋白酶消化,按5 000個細胞/孔的密度接種于96孔板中,繼續(xù)培養(yǎng)。待細胞貼壁后,分別加入不同濃度的WK-88-1(1.562 5,3.125,6.25,12.5,25,50 μmol/L),繼續(xù)培養(yǎng)12,24,36 h。培養(yǎng)結(jié)束后,每孔加入5 g/L的MTT溶液各10 μl孵育4 h,除去培養(yǎng)液,每孔加入150 μl的DMSO,用酶標(biāo)儀在490 nm波長下檢測各孔的吸光度值。計算細胞存活率,繪制劑量效應(yīng)曲線,并計算IC50值。上述實驗重復(fù)3次。

1.3 集落克隆實驗

將MDA-MB-231和MCF-7細胞按1×105個/孔的密度接種于6孔板中培養(yǎng),待細胞貼壁后,加入不同濃度的WK-88-1(0.1,0.3,0.5 μmol/L),繼續(xù)培養(yǎng)7 d,每隔3 d更換培養(yǎng)液。培養(yǎng)結(jié)束后,用預(yù)冷的PBS洗滌2次,再經(jīng)4%多聚甲醛固定15 min。除去固定液,加入結(jié)晶紫染色液染色15 min后,用雙蒸水洗去染色液,并在室溫下晾干,拍照。上述實驗重復(fù)3次。

1.4 劃痕實驗檢測細胞運動能力

將6×105個MDA-MB-231細胞接種于60 mm培養(yǎng)皿中培養(yǎng),待細胞鋪滿并成單層貼壁后,用200 μl的槍頭劃痕,并用PBS洗去被劃掉的細胞。加入不同濃度的WK-88-1(1.562 5,3.125,6.25,12.5,25,50 μmol/L),繼續(xù)培養(yǎng)24 h拍照記錄,并用Image J軟件計算劃痕處細胞間距。

1.5 Transwell遷移實驗

將Transwell小室置于24孔板內(nèi),取對數(shù)生長期的MDA-MB-231和MCF-7(其中MCF-7細胞預(yù)先用150 μmol/L氯化鈷處理12 h,誘導(dǎo)細胞缺氧狀態(tài),使MCF-7細胞運動能力加強),用無血清的DMEM培養(yǎng)液稀釋細胞至8×104/ml,每個Transwell小室上室為200 μl細胞懸液,并加入不同濃度的WK-88-1,使WK-88-1的最終濃度為3.125,6.25,12.5,25,50 μmol/L。而Transwell下室各加入含10%胎牛血清的培養(yǎng)液800 μl,培養(yǎng)24 h取出小室,用棉簽擦掉未遷移的細胞,再經(jīng)4%多聚甲醛固定、結(jié)晶紫染色,并隨機選取5個200倍視野顯微鏡下觀察拍照。并計算細胞遷移抑制率[12],細胞遷移抑制率(%)=(1-藥物處理組遷移細胞數(shù)/對照組遷移細胞數(shù))×100%。

1.6 Transwell侵襲實驗

每個Transwell小室上室均勻鋪50 μl的Matrigel基質(zhì)膠,放入細胞培養(yǎng)箱中1-2 h,待其凝固。用無血清的DMEM培養(yǎng)液稀釋細胞至8×104/ml,每個Transwell小室上室為200 μl細胞懸液,并加入不同濃度的WK-88-1,使最終濃度為3.125,6.25,12.5,25,50 μmol/L,作用時間為36 h,其余步驟同“1.5 Transwell遷移實驗”。并計算細胞侵襲抑制率[12],細胞侵襲抑制率(%)=(1-藥物處理組侵襲細胞數(shù)/對照組侵襲細胞數(shù))×100%。

1.7 免疫印跡法

將MDA-MB-231和MCF-7(150 μmol/L的氯化鈷預(yù)處理12 h)細胞按1.5×106個密度接種于60 mm培養(yǎng)皿中,繼續(xù)培養(yǎng)。待細胞貼壁后,分別加入不同濃度的WK-88-1(12.5,25,50 μmol/L),在37 ℃、飽和濕度、5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h。培養(yǎng)結(jié)束后,經(jīng)蛋白提取、BCA法蛋白定量,SDS-PAGE后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上,并用5%脫脂牛奶室溫封閉2 h。用1×TBST緩沖液清洗3次,每次5 min,加入一抗(HIF-1α、MMP-9、β-actin)放置于4 ℃冰箱過夜孵育后,1×TBST緩沖液清洗3次,每次5 min,再室溫孵育二抗2 h,并顯色分析。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法

實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準差表示,采用SPSS17.0軟件對數(shù)據(jù)進行分析,組間比較使用t檢驗,以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 WK-88-1對人乳腺癌MDA-MB-231和MCF-7細胞增殖的抑制作用

量-效曲線結(jié)果顯示,隨著WK-88-1給藥濃度的增加和作用時間的延長,MDA-MB-231和MCF-7細胞存活率逐漸降低,其作用36 h的IC50值分別為48.6 μmol/L和12.8 μmol/L(見圖1),與文獻[11]報道吻合。根據(jù)MTT實驗結(jié)果,我們選取了低濃度的WK-88-1(0.1,0.3,0.5 μmol/L)處理MDA-MB-231和MCF-7細胞7 d后,觀察到WK-88-1能顯著抑制細胞集落的形成,對MDA-MB-231細胞集落形成抑制率分別為(6.82± 8.27)%,(66.53± 6.42)%,(75.84± 1.41)%,對MCF-7細胞集落形成抑制率分別為(4.02± 3.01)%,(44.27± 12.51)%,(77.92±6.05)%,與對照組相比,差異具有顯著性(P<0.05,見圖2)。以上結(jié)果表明,WK-88-1對人乳腺癌細胞具有較強的抑制增殖作用,且呈現(xiàn)濃度和時間依賴性。

A.WK-88-1對MDA-MB-231細胞存活率的影響B(tài).WK-88-1對MCF-7細胞存活率的影響與對照組(0 μmol/L)相比,*P<0.05,**P<0.01圖1 WK-88-1對人乳腺癌細胞存活率的影響Figure 1 The survival rate of human breast cancer cells after treated with WK-88-1

與對照組(0 μmol/L)相比,*P<0.05,**P<0.01圖2 WK-88-1對人乳腺癌細胞集落形成能力的影響Figure 2 The colony forming ability of human breast cancer cells after treated with WK-88-1

2.2 WK-88-1對人乳腺癌細胞運動能力的影響

劃痕實驗結(jié)果顯示,WK-88-1顯著抑制MDA-MB-231細胞運動能力(見圖3)。與對照組比較,給藥組(6.25,12.5,25,50 μmol/L)的細胞運動抑制率分別為(69.00± 0.47)%,(83.89± 0.62)%,(83.69± 0.32)%,(89.78± 0.68)%(P<0.01)。

圖3 不同濃度WK-88-1對人乳腺癌MDA-MB-231細胞運動能力的影響Figure 3 The migration ability of human breast cancer MDA-MB-231 cells after treated with WK-88-1

2.3 WK-88-1對人乳腺癌細胞的遷移能力的影響

本研究采用Transwell小室法檢測了WK-88-1對乳腺癌細胞遷移能力的影響(見圖4)。隨著WK-88-1給藥濃度(3.125,6.25,12.5,25,50 μmol/L)的增加,乳腺癌細胞遷移能力顯著減弱,呈現(xiàn)濃度依賴性(見圖5)。與對照組相比較,50 μmol/L的WK-88-1處理MDA-MB-231和MCF-7細胞時遷移抑制率分別為(67.25± 3.12)%和(78.15± 2.57)%。

2.4 WK-88-1抑制乳腺癌細胞的侵襲能力

Transwell小室法結(jié)果顯示,不同濃度的WK-88-1處理MDA-MB-231和MCF-7細胞36 h后,乳腺癌細胞的侵襲能力顯著減弱,并呈現(xiàn)濃度依賴關(guān)系(見圖6)。與對照組相比較,50 μmol/L的WK-88-1處理MDA-MB-231和MCF-7細胞時侵襲抑制率分別為(64.22± 2.84)%和(70.56± 2.80)%(見圖7)。

圖6 WK-88-1對人乳腺癌MDA-MB-231和MCF-7細胞侵襲的影響 (×200)Figure 6 Effect of WK-88-1 on invasion of human breast cancer MDA-MB-231 and MCF-7 cells by Transwell assay (×200)

A.WK-88-1抑制MDA-MB-231細胞侵襲B.WK-88-1抑制MCF-7細胞侵襲與對照組(0 μmol/L)相比,*P<0.05圖7 WK-88-1抑制人乳腺癌MDA-MB-231和MCF-7細胞侵襲Figure 7 WK-88-1 inhibits MDA-MB-23 and MCF-7 cells invasion

2.5 WK-88-1對乳腺癌細胞HIF-1α和MMP-9蛋白表達的影響

本研究用不同濃度的WK-88-1分別處理MDA-MB-231和MCF-7細胞48 h,通過免疫印跡法觀察了Hsp90顧客蛋白HIF-1α和MMP-9的表達情況。隨著WK-88-1給藥濃度的增加,與侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白HIF-1α和MMP-9的表達依次下調(diào),且呈現(xiàn)一定的濃度依賴關(guān)系(見圖8)。

3 討論

天然產(chǎn)物具有結(jié)構(gòu)多樣性和生物多樣性,一直是發(fā)現(xiàn)先導(dǎo)化合物和新藥的重要來源之一。WK-88-1是從放線菌株(Streptomyces hygroscopicus AC2)培養(yǎng)液中分離得到的安莎霉素類化合物,是典型的Hsp90抑制劑[8]。Hsp90在腫瘤細胞中高表達,其抑制劑對腫瘤細胞具有選擇性殺死作用,同時多個Hsp90抑制劑作為治療乳腺癌新藥處于臨床試驗階段[13]。以往研究表明,WK-88-1具有較強的體內(nèi)外抗肺癌作用及低肝毒性[9,10]。Zhao等[11]報道,WK-88-1可誘導(dǎo)乳腺癌細胞發(fā)生caspase依賴和線粒體依賴的凋亡及G2/M細胞周期阻滯。然而,WK-88-1是否具有抑制乳腺癌細胞遷移與侵襲的研究尚無報道。本研究首次證實了WK-88-1明顯抑制乳腺癌細胞的遷移與侵襲的作用,為尋找抗乳腺癌侵襲與轉(zhuǎn)移的藥物具有重要意義。

乳腺癌細胞作為女性常見的全身性惡性腫瘤,侵襲與轉(zhuǎn)移是多數(shù)乳腺癌患者死亡的重要原因[4]。特別是三陰性乳腺癌患者(triple-negative breast cancer,TNBC)占乳腺癌患者的15%左右,具有易轉(zhuǎn)移、易復(fù)發(fā)等特征,并對靶向藥物赫賽汀及內(nèi)分泌治療均不敏感[14]。腫瘤細胞在缺氧條件下,通過HIF-1α介導(dǎo)的信號通路和下游基因的激活,調(diào)控腫瘤細胞的侵襲轉(zhuǎn)移、血管生成、多藥耐藥及能量代謝[15]。HIF-1α是腫瘤細胞在缺氧環(huán)境下的關(guān)鍵調(diào)控蛋白,可作為克服腫瘤細胞侵襲與轉(zhuǎn)移的潛在靶點[16]。研究表明,CoCl2作為鐵螯合酶的底物,代替Fe2+離子與血紅蛋白結(jié)合,使細胞處于缺氧狀態(tài)[17]。本研究以高侵襲與轉(zhuǎn)移的TNBC系MDA-MB-231細胞和CoCl2誘導(dǎo)的MCF-7細胞為細胞模型(均高表達HIF-1α),模擬乳腺癌細胞的侵襲、遷移過程,具有一定的可靠性。劃痕實驗和Transwell結(jié)果表明,WK-88-1能有效、濃度依賴性地抑制人乳腺癌細胞的遷移、侵襲能力。

腫瘤細胞的侵襲與轉(zhuǎn)移是多種因素調(diào)控的、多步驟的復(fù)雜過程,其中細胞外基質(zhì)(ECM)和基底膜的破壞是關(guān)鍵的步驟。基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)與腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移關(guān)系密切,如MMP-2、MMP-9等能降解和破壞ECM和基底膜,使腫瘤細胞進入循環(huán)系統(tǒng),導(dǎo)致腫瘤細胞的侵襲與轉(zhuǎn)移[18,19]。同時,有趣的是HIF-1α和MMP-9均是Hsp90的顧客蛋白。本研究通過免疫印跡法觀察到了WK-88-1處理乳腺癌細胞,能夠濃度依賴性地下調(diào)HIF-1α和MMP-9蛋白,其可能機制是WK-88-1抑制了Hsp90分子伴侶功能,下調(diào)細胞內(nèi)的HIF-1α和MMP-9蛋白表達,從而抑制乳腺癌細胞的遷移與侵襲。

綜上所述,本研究首次證實WK-88-1是抑制人乳腺癌MDA-MB-231和MCF-7細胞遷移與侵襲的有效化合物,具有一定的應(yīng)用潛力。遺憾的是本研究僅在體外細胞模型中探討了WK-88-1抑制遷移與侵襲的作用,需進行進一步的體內(nèi)藥效學(xué)的研究,為持續(xù)研究提供科學(xué)依據(jù)。