王松林,李從進(jìn),2,金 濤,李東波,楊 濤,宋錦寧

(1陜西省安康市中心醫(yī)院神經(jīng)外科,安康 725000;2西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)外科;*通訊作者,E-mail:jinningsong@126.com)

彌漫性軸索損傷(diffuse axonal injury,DAI)是顱腦外傷進(jìn)程中一個(gè)重要的病理改變,DAI是導(dǎo)致腦外傷患者高死亡率的主要原因,也是導(dǎo)致腦外傷患者傷后植物生存或嚴(yán)重神經(jīng)功能障礙的重要原因之一,目前尚無有效的治療手段。腦組織在受傷的瞬間所遭受的剪切應(yīng)力可拉伸顱內(nèi)長束狀的結(jié)構(gòu),這種類型損傷稱為原發(fā)性損傷。目前的研究證明,原發(fā)性損傷只能導(dǎo)致極少數(shù)量的軸索結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,更多的軸索損傷是在氧化應(yīng)激、興奮毒性、炎癥等多種因素的作用下出現(xiàn)的,稱為繼發(fā)性軸索損傷。炎癥反應(yīng)是導(dǎo)致軸索繼發(fā)性損傷的重要機(jī)制之一,在軸索損傷灶的周圍有炎性因子聚集,并且在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物腦損傷后給予抗炎或免疫抑制治療,能有效緩解軸索損傷[1]。因此,以炎癥反應(yīng)為靶點(diǎn)治療DAI后的繼發(fā)性軸索損傷受到廣泛關(guān)注。

雷公藤甲素(triptolide,TP)是雷公藤的根、葉、花及果實(shí)中提取的一種環(huán)氧二萜內(nèi)酯化合物,經(jīng)臨床和藥理實(shí)驗(yàn)證明,其具有免疫抑制、抗炎、抗生育及抗腫瘤等生物活性。既往研究表明,雷公藤甲素可以通過免疫抑制、抗炎等機(jī)制對(duì)多種中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病有保護(hù)作用,例如:腦缺血損傷[2,3]、腦外傷(皮層撞擊模型)[4]、慢性疼痛[5]、神經(jīng)退行性病變[6,7]、膠質(zhì)瘤[8]等。而雷公藤甲素能否對(duì)DAI發(fā)揮抗炎作用,進(jìn)而減輕繼發(fā)性軸索損傷仍需進(jìn)一步研究。

因此,本研究通過建立大鼠DAI模型,并給予雷公藤甲素,觀察大鼠皮層軸索損傷標(biāo)志物神經(jīng)微絲蛋白(neurofilament triplet L,NF-L)及微管相關(guān)蛋白tau、膠質(zhì)細(xì)胞活化標(biāo)志物(GFAP、Iba-1)、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、細(xì)胞凋亡、MAPK磷酸化水平及NF-κB的表達(dá)變化,探討雷公藤甲素對(duì)軸索損傷的保護(hù)作用及其潛在機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

小鼠SP免疫組化試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)公司)、兔SP免疫組化試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)公司),TUNEL檢測試劑盒(美國Promega公司),雷公藤甲素(美國sigma公司),p38 MAPK抗體(美國Cell Signaling Technology公司),Phospho-p38 MAPK抗體(P-p38 MAPK,Thr180/Tyr182,美國Cell Signaling Technology公司),NF-κB抗體(美國Cell Signaling Technology公司),TNF-α抗體(美國GeneTex公司),Iba-1抗體(日本Sako公司),GFAP抗體(美國Cell Signaling Technology公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

36只遺傳背景相同的SPF級(jí)雄性10周齡SD大鼠,體質(zhì)量250-280 g,購自西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部動(dòng)物中心,許可證號(hào)SCXK(陜)08-018。造模前后均飼養(yǎng)于22 ℃的環(huán)境,自由采食與飲水。所有大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組,DAI 3 d組,DAI 3 d+TP組,每組12只。本實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理經(jīng)西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部生物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(2017-0122)。

1.3 DAI模型制作

所有大鼠術(shù)前常規(guī)禁食水6 h,用100 g/L的水合氯醛(4 ml/kg)腹腔注射麻醉。將DAI 3 d組及DAI 3 d+TP組大鼠頭顱固定于瞬間旋轉(zhuǎn)損傷裝置上,待大鼠將要清醒時(shí),啟動(dòng)裝置,致大鼠頭顱瞬間旋轉(zhuǎn)90°并立即停止[9]。對(duì)照組只需麻醉、固定完畢后即從裝置上卸下。DAI 3 d組大鼠造模后不做處理,DAI 3 d+TP組大鼠在造模后5 min內(nèi)腹腔注射TP(0.2 mg/kg)[10],間隔24 h,連續(xù)3 d給藥。

1.4 腦組織病理學(xué)觀察

DAI后第3天,麻醉大鼠,用生理鹽水及40 g/L的多聚甲醛經(jīng)心臟灌注后開顱取腦,并繼續(xù)固定腦組織48 h。石蠟包埋組織,切片厚5 μm,常規(guī)二甲苯脫蠟,梯度乙醇水化,按標(biāo)準(zhǔn)步驟對(duì)切片行HE染色。

1.5 免疫組化檢測TNF-α、Iba-1及GFAP的表達(dá)

切片經(jīng)二甲苯脫蠟,梯度乙醇水化;采用高壓進(jìn)行抗原修復(fù),待高壓氣閥旋轉(zhuǎn)2 min后終止,修復(fù)液自然冷卻至室溫;3%過氧化氫室溫孵育15 min、山羊血清封閉室溫40 min;滴加一抗TNF-α(1 ∶500)、Iba-1(1 ∶400)及GFAP(1 ∶300);4 ℃過夜;PBS洗去一抗,滴加相應(yīng)二抗,室溫孵育30 min;PBS洗去多余二抗,滴加辣根過氧化物酶,室溫孵育30 min;DAB顯色,自來水沖洗干凈;蘇木素復(fù)染2 min;經(jīng)梯度乙醇脫水、二甲苯透明后,中性樹膠封片,顯微鏡檢。每張切片隨機(jī)選5個(gè)視野用Image-Pro Plus軟件分析測定免疫組化圖像的陽性細(xì)胞數(shù)。

1.6 TUNEL法檢測細(xì)胞凋亡

切片經(jīng)二甲苯脫蠟、梯度乙醇水化后,用0.2%的Triton X-100室溫孵育5 min、平衡緩沖液中孵育10 min,然后用TdT 37 ℃孵育60 min,PBS浸洗,終止反應(yīng),DAPI染核,采用熒光顯微鏡觀察凋亡細(xì)胞(綠色熒光),每張切片隨機(jī)選取5個(gè)視野統(tǒng)計(jì)凋亡細(xì)胞數(shù)。

1.7 Western blot檢測p38 MAPK、Phospho-p38 MAPK及NF-κB的表達(dá)

DAI后3 d,每組取6只大鼠水合氯醛麻醉,經(jīng)心尖灌注生理鹽水后取皮層組織,加入裂解液完全勻漿后離心取上清,加入loading buffer,加熱使蛋白變性。常規(guī)電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉1 h,加入p38 MAPK抗體、Phospho-p38 MAPK、NF-κB抗體、β-actin(均1 ∶1 000)一抗稀釋液,4 ℃過夜,加入二抗,TBST洗膜,滴加化學(xué)發(fā)光試劑(ECL)顯影液,Image J軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行灰度分析。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 TP對(duì)DAI后繼發(fā)性軸索損傷的保護(hù)作用

各組大鼠腦皮層病理學(xué)顯示:對(duì)照組皮層神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)正常,核圓,呈藍(lán)色,胞質(zhì)淡紅;DAI 3 d組大鼠腦皮層的部分細(xì)胞核發(fā)生變形、固縮,并且深染,部分神經(jīng)元腫脹,軸索扭曲,收縮變性;而DAI 3 d+TP組大鼠腦皮層內(nèi)腫脹、扭曲的神經(jīng)元數(shù)量明顯減少,病理損傷減輕(見圖1A)。與對(duì)照組相比,DAI 3 d組大鼠腦皮層內(nèi)軸索損傷標(biāo)志物tau的表達(dá)明顯減少,同時(shí)NF-L的表達(dá)升高,提示皮層內(nèi)存在明顯的軸索損傷;而DAI 3 d+TP組大鼠腦皮層內(nèi)tau的丟失明顯減少,NF-L的表達(dá)降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,見圖1B,C),提示TP可以減輕DAI后的繼發(fā)性軸索損傷。

2.2 TP抑制DAI后的細(xì)胞凋亡

為了闡明TP干預(yù)后對(duì)大鼠皮層細(xì)胞凋亡的影響,利用TUNEL法檢測凋亡細(xì)胞(綠色),并利用DAPI染核(藍(lán)色),TUNEL與DAPI同時(shí)陽性的細(xì)胞定義為凋亡細(xì)胞，結(jié)果見圖2。對(duì)照組、DAI 3 d組及DAI 3 d+TP組大鼠腦皮層內(nèi)凋亡細(xì)胞數(shù)分別為2.15± 1.87,34.75± 7.37,22.55± 6.04,組間兩兩比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

與對(duì)照組相比,*P<0.05;與DAI 3 d組相比,#P<0.05圖1 各組大鼠皮層的病理改變及Tau及NF-L的表達(dá)變化 (bar=50 μm)Figure 1 Pathological changes and expression of Tau and NF-L in cortex of each group (bar=50 μm)

圖2 各組大鼠皮層凋亡細(xì)胞數(shù)的變化 (scale bar=100 μm)Figure 2 The counts of TUNEL-positive cells in cortex of each group (scale bar=100 μm)

2.3 TP抑制DAI后的膠質(zhì)反應(yīng)及促炎因子TNF-α的釋放

與對(duì)照組相比,DAI 3 d組皮層內(nèi)星型膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物GFAP、小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物Iba-1及促炎因子TNF-α的表達(dá)均明顯升高,提示DAI后伴隨著膠質(zhì)反應(yīng)及促炎因子TNF-α的產(chǎn)生和釋放。與DAI 3 d組相比,DAI 3 d+TP組的皮層內(nèi)GFAP、Iba-1及TNF-α的表達(dá)均顯著減少,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,見圖3),提示TP可以減輕DAI后的星型膠質(zhì)細(xì)胞增生、小膠質(zhì)細(xì)胞活化,并抑制促炎因子的產(chǎn)生。

2.4 TP對(duì)NF-κB及MAPK信號(hào)通路的調(diào)控

為了闡明TP對(duì)DAI大鼠神經(jīng)保護(hù)作用的機(jī)制,利用Western blot檢測各組NF-κB的表達(dá)及p38 MAPK的磷酸化水平,結(jié)果提示,與對(duì)照組相比,DAI后3 d組NF-κB的表達(dá)及p38 MAPK的磷酸化水平明顯升高,而DAI 3 d+TP組NF-κB的表達(dá)及p38 MAPK的磷酸化水平均有明顯下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,見圖4)。提示TP對(duì)DAI的保護(hù)作用可能與抑制NF-κB及p38 MAPK信號(hào)通路有關(guān)。

3 討論

DAI是腦外傷后常見的病理改變,DAI后的繼發(fā)性軸索損傷與多種機(jī)制有關(guān),如氧化應(yīng)激、鈣超載等,其中炎癥反應(yīng)也參與繼發(fā)性軸索損傷的過程,因此抑制DAI后的炎癥反應(yīng)成為治療DAI的新策略。本研究采用瞬間旋轉(zhuǎn)損傷裝置制作大鼠DAI模型,大鼠DAI后,大腦皮層中有明顯細(xì)胞水腫、核固縮等病理改變,并且促炎因子及軸索損傷標(biāo)志物NF-L升高,tau的表達(dá)量減少,并伴隨有膠質(zhì)細(xì)胞的活化,與既往報(bào)道DAI病理生理改變一致,提示本裝置可有效地模擬臨床DAI。

DAI有多種標(biāo)志物,NF-L、tau及膠質(zhì)細(xì)胞活化均可以反映DAI動(dòng)物模型軸索損傷的程度。本研究中,連續(xù)3 d給予DAI大鼠雷公藤甲素,可減少NF-L的表達(dá),減輕微管相關(guān)蛋白tau的丟失,并抑制小膠質(zhì)細(xì)胞及星型膠質(zhì)細(xì)胞的活化,提示雷公藤甲素能減輕大鼠DAI,而既往研究也證實(shí)雷公藤甲素對(duì)多種中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病有保護(hù)作用,如:雷公藤甲素可以減少大鼠腦梗死的體積和腦含水量,改善神經(jīng)功能缺損,抑制凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)[2]。體外模型中,雷公藤甲素可以減輕氧糖剝奪導(dǎo)致的細(xì)胞毒性和凋亡[3]。在皮層撞擊所致的腦外傷模型中,>雷公藤甲素可以減輕腦外傷導(dǎo)致的腦水腫、降低腦挫傷灶的體積、細(xì)胞凋亡和多種炎性因子的水平,并改善神經(jīng)行為學(xué)[4]。持續(xù)給予TP可以改善APP/PS1小鼠的認(rèn)知功能,降低Aβ的沉積,減輕樹突棘的退化、炎癥反應(yīng)和膠質(zhì)反應(yīng)[6,11,12]。TP還可以通過抑制星型膠質(zhì)細(xì)胞的激活,減輕炎癥反應(yīng)和神經(jīng)性病理痛,改善痛覺過敏及運(yùn)動(dòng)功能障礙[13,14]。

圖3 各組大鼠皮層GFAP、Iba-1和TNF-α的表達(dá)變化 (scale bar=100 μm)Figure 3 The expression of GFAP, Iba-1 and TNF-α in cortex of each group (scale bar=100 μm)

與對(duì)照組相比,*P<0.05;與DAI 3 d組相比,#P<0.05圖4 各組大鼠皮層NF-κB的表達(dá)及p38 MAPK磷酸化水平的變化Figure 4 The expression of NF-κB and phosphorylation-level of p38 MAPK in cortex of each group

本研究中,雷公藤甲素能減少TNF-α的產(chǎn)生及NF-κB的表達(dá),并抑制MAPK磷酸化的水平,而其對(duì)大鼠DAI的保護(hù)作用可能與其抑制炎性因子TNF-α的產(chǎn)生及釋放有關(guān)。TNF-α是重要的促炎因子,可刺激免疫細(xì)胞如NK細(xì)胞和巨噬細(xì)胞/單核細(xì)胞,促進(jìn)炎癥因子的分泌,并通過結(jié)合其受體調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡;TNF-α也能直接誘導(dǎo)原發(fā)性脫髓鞘反應(yīng)和少突膠質(zhì)細(xì)胞凋亡,提示TNF-α參與DAI后的病理過程,而抑制TNF-α的產(chǎn)生和釋放可對(duì)腦外傷起一定的保護(hù)作用[15,16]。TNF-α相關(guān)的信號(hào)傳導(dǎo)通路主要包括caspase家族介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡、轉(zhuǎn)錄因子NF-κB和MAPK蛋白激酶的活化。既往研究已經(jīng)證實(shí)雷公藤甲素可以抑制NF-κB活性及MAPK的磷酸化,減少TNF-α的產(chǎn)生,對(duì)腦卒中和神經(jīng)性病理痛起到保護(hù)和緩解作用[11,17]。而本研究中,雷公藤甲素也能減少NF-κB的表達(dá),并抑制MAPK磷酸化,提示雷公藤甲素對(duì)TNF-α的抑制作用可能與該信號(hào)通路有關(guān)。除了作用于NF-κB和MAPK途徑,雷公藤甲素還可以調(diào)控多種信號(hào)通路,例如雷公藤甲素可以抑制脊髓膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)JAK-STAT3通路,進(jìn)而抑制膠質(zhì)細(xì)胞的激活;其也可以抑制小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)的EP2-PKA通路,抑制小膠質(zhì)細(xì)胞釋放一氧化氮[14,18]。

綜上,雷公藤甲素可以通過抑制NF-κB和MAPK信號(hào)通路,減少TNF-α的產(chǎn)生及釋放,并抑制小膠質(zhì)細(xì)胞和星型膠質(zhì)細(xì)胞的活化,減輕大鼠DAI后的繼發(fā)性軸索損傷。然而雷公藤甲素具有多種藥理作用,其對(duì)DAI的保護(hù)作用仍有待進(jìn)一步研究。