高 娟,董兵衛(wèi),張渭波,李 卓*

(1西安醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院檢驗科,西安 710077;2咸陽市中心醫(yī)院病理科;*通訊作者,E-mail:lizhuo721@163.com)

膀胱癌(urothelial cell carcinoma,UCC)占膀胱腫瘤系統(tǒng)的80%-90%左右,60%左右的患者手術(shù)后會有復(fù)發(fā)的可能。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化[1](epithelial mesenchymal transition,EMT)是多細(xì)胞胚胎發(fā)育與器官形成中的基礎(chǔ)過程,近年來研究發(fā)現(xiàn)[2],EMT在腫瘤發(fā)生、發(fā)展與轉(zhuǎn)移過程中起著重要的作用,EMT使沒有侵襲、遷移能力的細(xì)胞獲得浸潤能力并最終轉(zhuǎn)移到其他組織和器官,并再次通過間質(zhì)上皮轉(zhuǎn)化定植形成轉(zhuǎn)移灶。

整合素連接激酶(intergrin-linked kinase,ILK)是一個59 kDa的細(xì)胞內(nèi)信號蛋白,它在胞內(nèi)的兩個靶向催化位點是蛋白激酶B和糖原合成酶激酶-3。研究顯示,ILK與神經(jīng)膠質(zhì)瘤等的發(fā)生、分化及侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[3],實驗證實,運用siRNA ILK抑制ILK的活性,在膀胱癌細(xì)胞中,可以抑制細(xì)胞的生長、遷移、侵襲和血管生成[4]。ILK是哺乳動物細(xì)胞中主要的信號傳導(dǎo)分子,在人類腫瘤發(fā)生EMT的過程中起著重要作用,但是其機制目前并不清楚[5]。上皮性鈣黏附蛋白(E-cadherin)的下調(diào)與神經(jīng)性鈣粘附蛋白(N-cadherin)的上調(diào)是EMT的主要特征之一。研究表明下調(diào)ILK能使E-cadherin在體內(nèi)外的表達(dá)均升高,而E-cadherin的低表達(dá)是EMT的重要標(biāo)志[6-7],通過與靶基因啟動子結(jié)合,誘導(dǎo)EMT的發(fā)生,促使腫瘤細(xì)胞發(fā)生侵襲與轉(zhuǎn)移[8];而堿性螺旋環(huán)轉(zhuǎn)錄因子(Twist)通過抑制細(xì)胞凋亡與分化,誘導(dǎo)細(xì)胞上皮間質(zhì)化轉(zhuǎn)變,其高表達(dá)與腫瘤的轉(zhuǎn)移與預(yù)后相關(guān)[9]。至今為止,ILK、E-cadherin及Twist在膀胱癌EMT中的作用未見報道,本文應(yīng)用免疫組化SP法檢測ILK、E-cadherin及Twist在膀胱癌組織中的表達(dá),分析三者對膀胱癌EMT的影響。

1 材料與方法

1.1 一般資料

收集2015-06～2017-12咸陽市中心醫(yī)院病理科膀胱腫瘤手術(shù)切除新鮮標(biāo)本,離體5 min內(nèi)進(jìn)行取材,病理證實均為原發(fā)性膀胱癌,并無化療、放療。取62例(其中男50例,女12例)膀胱癌標(biāo)本,患者年齡為49-81歲,平均年齡65歲,依據(jù)WHO(2004)泌尿系統(tǒng)腫瘤的病理分級標(biāo)準(zhǔn)分類:高分化28例,低分化34例;另取25例(其中男20例,女5例)癌旁正常組織作為陰性對照,年齡53-85歲,平均年齡69歲。所有標(biāo)本用10%中性福爾馬林固定,常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋,4 μm厚連續(xù)切片。

1.2 方法

1.2.1 主要試劑 免疫組織化學(xué)、DAB染色試劑盒均由博奧森公司提供,兔抗人ILK多克隆抗體由Santa Cruz公司提供;兔抗人E-cadherin及Twist多克隆抗體均由邁新生物技術(shù)有限公司提供。

1.2.2 方法 免疫組織化學(xué)采用SP法進(jìn)行染色,一抗兔抗人ILK、E-cadherin及Twist多克隆抗體稀釋濃度均為1 ∶100。嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作,用已知陽性切片作為陽性對照,以0.01 mol/L PBS(pH 7.4)替代一抗作為陰性對照。

1.2.3 結(jié)果判斷 染色結(jié)果評定:ILK和Twist蛋白主要在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)表達(dá),以細(xì)胞漿中出現(xiàn)棕黃色染色為陽性染色,E-cadherin蛋白以細(xì)胞膜或細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色染色為陽性染色,評分標(biāo)準(zhǔn):①隨機選擇計數(shù)1 000個細(xì)胞,計算陽性細(xì)胞百分?jǐn)?shù):陽性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)<10%為1分,10%-50%為2分,>50%為3分。②染色強弱計分:陰性為0分,淺黃色為1分,黃色為2分,棕黃(褐)色為3分。按照“陽性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)×染色強弱”計總分:0-1分為陰性(-),2-4分為弱陽性(+),6-8分為陽性(++),9分為強陽性(+++)。陽性判定標(biāo)準(zhǔn)為+,++,+++。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析,兩組間比較選用χ2檢驗(包括Fisher精確概率法)。相關(guān)分析采用Spearman等級相關(guān)分析法處理統(tǒng)計結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 膀胱癌和癌旁正常組織中ILK、E-cadherin及Twist的表達(dá)

SP染色結(jié)果顯示,ILK及Twist在膀胱癌中的表達(dá)較癌旁正常組織高,E-cadherin在膀胱癌中的表達(dá)較癌旁正常組織低(見圖1)。ILK在膀胱癌和癌旁正常組織中的表達(dá)率分別為54.8%(34/62)和16.0%(4/25),兩組相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=10.9,P<0.05)。E-cadherin的陽性表達(dá)分別為32.3%(20/62)和72.0%(18/25),兩組相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=11.4,P<0.05)。Twist的陽性表達(dá)分別為64.5%(40/62)和4.0%(1/25),兩組相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=26.2,P<0.05,見表1)。

表1ILK、E-cadherin及Twist在膀胱癌和癌旁正常組織中的表達(dá)

Table1ExpressionofILK,E-cadherinandTwistinbladdercancerandadjacentnormaltissues

組別nILKE-cadherinTwist膀胱癌組織6234(54.8)20(32.3)40(64.5)癌旁正常組織25 4(16.0)18(72.0)1(4.0) χ210.9 11.4 26.2 P0.0010.0010.001

2.2 膀胱癌病理分級與ILK、E-cadherin及Twist表達(dá)的關(guān)系

膀胱癌不同病理分級ILK的表達(dá)分別為:高分化39.3%(11/28),低分化67.6%(23/34),兩組相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=4.9,P<0.05);E-cadherin在膀胱癌不同病理分級中的表達(dá)分別為:高分化53.6%(15/28),低分化14.3%(5/34),兩組相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=10.6,P<0.05);Twist在膀胱癌不同病理分級中的表達(dá)分別為:高分化53.6%(15/28),低分化73.5%(25/34),兩組相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=2.7,P<0.05,見表2)。

A1. ILK在膀胱癌組織中陽性表達(dá);A2. ILK在癌旁正常組織中弱陽性表達(dá)；B1. E-cadherin在膀胱癌組織中弱陽性表達(dá);B2. E-cadherin在癌旁正常組織中強陽性表達(dá)；C1. Twist在膀胱癌組織中陽性表達(dá);C2. Twist在癌旁正常組織中不表達(dá)圖1 ILK、E-cadherin及Twist在膀胱癌及癌旁正常組織中的表達(dá) (SP,×100)Figure 1 Expression of ILK, E-cadherin and Twist in bladder cancer and adjacent normal tissues (SP,×100)

表2ILK、E-cadherin及Twist的表達(dá)與膀胱癌病理分級的關(guān)系

Table2TherelationshipbetweentheexpressionofILK,E-cadherinandTwistandthepathologicalgradeofbladdercancer

病理分級nILKE-cadherinTwist高分化2811(39.3)15(53.6)15(53.6)低分化3423(67.6)5(14.3)25(73.5)χ24.98710.6142.672P0.0240.0010.002

2.3 ILK、E-cadherin及Twist在膀胱癌中表達(dá)的相互關(guān)系

膀胱癌中E-cadherin與ILK表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.3,P<0.05,見表3),Twist與ILK表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.4,P<0.05,見表3),E-cadherin與Twist表達(dá)亦呈負(fù)相關(guān)(r=-0.5,P<0.05,見表4)。

表3E-cadherin、Twist與ILK在膀胱癌中表達(dá)的關(guān)系

Table3RelationshipbetweenE-cadherin,TwistandILKexpressioninbladdercancer

ILKE-cadherinTwist+-rP+-rP+727-0.30.0012860.4 0.001-13151216

表4E-cadherin與Twist在膀胱癌中表達(dá)的關(guān)系

Table4RelationshipbetweenE-cadherinandTwistexpressioninbladdercancer

E-cadherinTwist+-rP+614-0.50.001-348

3 討論

研究發(fā)現(xiàn),EMT與膀胱癌的侵襲、轉(zhuǎn)移密切相關(guān),同時還與膀胱腫瘤分期、分級相關(guān)[10]。作為一種重要的EMT調(diào)控蛋白,ILK引起了廣泛的關(guān)注,它通過使腫瘤細(xì)胞獲得間質(zhì)表型從而在多種腫瘤中介導(dǎo)了侵襲轉(zhuǎn)移[11]。過表達(dá)ILK蛋白引起它所介導(dǎo)的信號通路的改變,最終會導(dǎo)致細(xì)胞向惡性分化。E-cadherin是一種鈣依賴性跨膜蛋白,廣泛參與同型細(xì)胞間的黏附及細(xì)胞骨架的穩(wěn)定,它的異常表達(dá)被認(rèn)為與EMT的發(fā)生密切相關(guān)[12]。Le等[13]研究報道,在乳腺癌患者E-cadherin蛋白表達(dá)明顯降低。研究發(fā)現(xiàn),顯著降低ILK的表達(dá)后,EMT相關(guān)的蛋白分子E-cadherin表達(dá)增加,抑制腫瘤轉(zhuǎn)移,使腫瘤細(xì)胞惡性程度降低[14]。本研究顯示,ILK在膀胱癌中的表達(dá)明顯高于癌旁正常組織,而E-cadherin的表達(dá)明顯低于正常組織,且E-cadherin在高分化癌中表達(dá)明顯高于低分化癌,并與ILK的表達(dá)呈負(fù)相關(guān),提示E-cadherin表達(dá)下調(diào)誘發(fā)EMT,使細(xì)胞間的黏附作用削弱,從而使腫瘤細(xì)胞脫離原發(fā)灶,發(fā)生浸潤和轉(zhuǎn)移。

Twist是近年來倍受關(guān)注的癌基因之一,參與腫瘤細(xì)胞EMT過程,使腫瘤細(xì)胞通過適應(yīng)周圍基質(zhì)環(huán)境獲得新的上皮特性,形成轉(zhuǎn)移病灶,且這種轉(zhuǎn)移灶中的腫瘤細(xì)胞遷移、增殖的活性較原發(fā)腫瘤更強,并出現(xiàn)抗腫瘤藥物的活性[15]。在多種腫瘤的研究[16]中發(fā)現(xiàn),Twist是腫瘤細(xì)胞發(fā)生EMT,并獲得遷徙、侵襲和轉(zhuǎn)移能力的主要誘導(dǎo)因子之一。Twist具有獨立的抑制E鈣黏蛋白表達(dá),并上調(diào)纖連蛋白和N鈣黏蛋白的作用。Li等[17]研究乳腺癌MCF7細(xì)胞系和宮頸癌Hela細(xì)胞系中Twist的表達(dá)時發(fā)現(xiàn),Twist高表達(dá)可誘導(dǎo)與EMT相關(guān)的細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。本文研究提示Twist在膀胱癌中的表達(dá)隨著腫瘤惡性程度的增加而增高,并與ILK的表達(dá)呈正相關(guān),同時,隨著Twist的上調(diào),E-cadherin表達(dá)出現(xiàn)下降,E-cadherin作為EMT過程中的關(guān)鍵因子,表明Twist1在膀胱癌中是通過E-cadherin最后發(fā)揮作用。因此,從本實驗中我們推測,三者在作用機制上可能存在某種聯(lián)系,通過相互調(diào)節(jié),在膀胱癌EMT的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮協(xié)同效應(yīng),構(gòu)成膀胱癌惡性生物學(xué)行為的基礎(chǔ)。本課題組在后續(xù)實驗中將繼續(xù)探討三者的相互作用,為膀胱癌的診治提供更多的科學(xué)依據(jù)。