胡程舟，張卓，陳文龍，周胤澤，段偉豪，李開朗，郭志祥

風(fēng)濕性心臟病是甲組乙型溶血性鏈球菌感染人體后引起的變態(tài)反應(yīng)性疾病，屬于自身免疫性疾病，病人血常規(guī)檢查白細胞介素(IL)-4的水平會有一定程度上升。 IL-4細胞因子主要由Th2細胞分泌，Th2輔助細胞的主要轉(zhuǎn)錄因子有GATA3、干擾素調(diào)節(jié)因子4(IRF4)等。有研究表明IRF4能促進IL-4的表達。

細胞內(nèi)的各種轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控不同的基因的表達，這些轉(zhuǎn)錄因子同時也受到機體各種調(diào)節(jié)機制的調(diào)節(jié)，其中翻譯后修飾是一類十分重要的機制，泛素化與去泛素化修飾是翻譯后修飾里比較重要的一種。Chen等[1]發(fā)現(xiàn)泛素化酶Stub通過促進泛素蛋白賴氨酸殘基K48的多泛素化誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子FoxP3的陣解,從而負性調(diào)控調(diào)節(jié)性T細胞的抑制活性。USP4，是一種去泛素化酶，在腫瘤細胞的分裂增殖的過程起著重要的作用。Zhao等[2]研究表明USP4所參與的調(diào)節(jié)機制是一種經(jīng)典的Wnt信號傳導(dǎo)通路，USP4是一種新的負性調(diào)節(jié)因子。其抑癌機制為阻止Wnt信號通路的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)從而起到抑癌的效果。Xiao等[3]發(fā)現(xiàn)USP4可以使腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子TRAF2和TRAF6去泛素化，進而阻礙腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和IL-1β誘導(dǎo)核因子-κB(NF-κB)的表達。Wang等[4]研究發(fā)現(xiàn)USP4能夠通過對天然免疫相關(guān)蛋白RIG-1的去泛素化調(diào)節(jié)病毒誘導(dǎo)的I型干擾素信號。 綜上，USP4對細胞的凋亡、增殖、周期進程和維持細胞的穩(wěn)態(tài)發(fā)揮重要作用，因而我們認為免疫細胞中轉(zhuǎn)錄因子IRF4泛素化和去泛素化調(diào)節(jié)同樣重要，本研究通過探究IRF4的去泛素化修飾在Th2細胞功能表達中的作用來進一步闡釋風(fēng)濕性心臟病的發(fā)生機制，從而為風(fēng)濕性心臟病的治療方案選擇提供新的思路。

1 資料與方法

1.1標本選取20例風(fēng)濕性心臟病病人來源于2015年7月至2016年1月的安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院住院病人，均行體外循環(huán)下瓣膜置換手術(shù)，均順利出院。10例健康對照來自于健康志愿者。分別抽取以上參與實驗人員5 mL的外周血，用EDTA(乙二胺四乙酸二鉀)抗凝管進行抗凝。病人平均年齡為50歲，病人或其近親屬知情同意。本研究符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會赫爾辛基宣言》相關(guān)要求。

1.2質(zhì)粒、抗體本課題所用質(zhì)粒均由中國科學(xué)院上海巴斯的研究所惠贈?？笷lag抗體，抗USP4抗體(Sigma，美國)；抗Ha抗體，抗Ubiquitin抗體(Santa Cruz，美國)；抗β-actin抗體(三箭生物，天津)；PerCP/Cy5.5anti-humanCD45RA，F(xiàn)ITC anti-humanCD4，PEanti-human CD25，PerCP/Cy5.5 anti-human IL-4購自美國BioleGend公司。Pb anti-human/mouse IRF4購自美國eBioscience公司。

1.3細胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染人胚腎細胞系(HEK-293T)(含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基)；人源性原代幼稚CD4+T細胞和Th2細胞從健康人外周血獲得，培養(yǎng)環(huán)境為含10%人AB血清，1%非必需氨基酸，1%谷氨酰胺和1%丙酮酸鈉，1%青霉素和鏈霉素的X-VIVO15免疫細胞培養(yǎng)基中，以上細胞均在37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。課題所需聚乙烯亞胺(PEI)用在HEK-293T細胞系中轉(zhuǎn)染。

1.4實時熒光定量PCR體外誘導(dǎo)分化Th2細胞，基因沉默后篩選1周，抽提出RNA并檢測濃度。用1 μg RNA反轉(zhuǎn)出cDNA用于實時熒光定量PCR。所用引物如下：USP4,上游引物：5′-TCAGCCGCTATGTGAAACAG-3′，下游引物：5′-GTGGTCTCACTGGGGTCATT -3′。肌動蛋白(ACTIN)，上游引物：5′-CTCTTCCAGCCTTCCTTCCT -3′，下游引物：5′-CAGGGCAGTGATCTCCTTCT -3′。IL-4：上游引物：5′-GCCACCATGAGAAGGACACT-3′，下游引物：5′-ACTCTGGTTGGCTTCCTTCA-3′。IL-5：上游引物：5′-GGCACTGCTTTCTACTCATCGA -3′，下游引物：5′-AGTTGGTGATTTTTATGTACAGGAACA-3′。IL-10：上游引物：5′-TGCAAAACCAAACCACAAGA-3′，下游引物：5′-TCTCGGAGATCTCGAAGCAT-3′。IL-13：上游引物：5′-CTATGCATCCGCTCCTCAAT-3′，下游引物：5′-GGTGATGTTGACCAGCTCCT-3′。IRF4：上游引物：5′-AGAACGAGGAGAAGAGCATC-3′，下游引物：5′-CCTTTAAACAGTGCCCAAG-3′。

1.5免疫印跡和免疫共沉淀實驗在轉(zhuǎn)染之后得到的細胞用含有20 mmol/L Tris-HCl(pH7.5)、150 mmol/L NaCl、1 mmol/L 乙二胺四乙酸二鉀,1% (v/v) NP-40、10% Glycerol、0.25% Na-deoxycholate的細胞裂解液進行處理，裂解液同時加入1 mmol/L PMSF(苯甲基磺酰氟),1 mmol/L NaF,1% protease inhibitor cocktail (西格瑪)。在4 ℃細胞裂解15 min后，離心(12 000 r/min，4 ℃)，取上清液。在獲得的上清液中加入相對應(yīng)的抗體在4 ℃孵育2 h，之后再加入Protein A或G beads孵育2 h。之后用之前的細胞裂解液清洗樣品，離心(1 000 r/min，4 ℃)，一共清洗4遍，后進行免疫印跡實驗。

1.6His蛋白質(zhì)體外結(jié)合實驗將Flag-IRF4、Ha-USP4、His-ubiquitin質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進HEK-293T細胞系中，在收細胞前3 h每個樣品加入終濃度為20 nmol/L的MG132。收樣時，首先用1×PBS洗一遍，再用buffer 1室溫下裂解30 min。之后樣品再與預(yù)洗滌NI-NTA(氨基三乙酸鎳)Beads室溫下孵育3 h。3 h后樣品用buffer 1洗2遍，buffer 2洗兩遍，Buffer3洗1遍。之后樣品加2×loading處理，煮沸10 min，進行免疫印跡檢測。

1.7shRNA慢病毒的包裝和轉(zhuǎn)導(dǎo)載體質(zhì)粒pLKO.1-shCK，shUSP4-1和del8.9，VSV-G質(zhì)粒共轉(zhuǎn)入HEK-293T細胞中，其中pLKO.1載體購自美國addgene公司。shRNA引物來自以前的研究[5]。

48 h后收集病毒。將正在激活狀態(tài)下的Th2細胞用病毒進行感染并在同一時間加入聚凝胺(8 μg/mL)，第2天換新鮮培液。并在第3～4天加入嘌呤霉素篩選細胞。在第7～9天收細胞進行相關(guān)實驗檢測。

1.8流式細胞分析人外周血經(jīng)過密度梯度離心法獲得外周血單核細胞，使用丙二醇甲醚醋酸酯(25 ng/mL)和離子霉素 (1 μg/mL)對外周血單核細胞進行4 h處理，之后染色，再使用流式細胞儀進行分析處理。用于分選的外周血單核細胞則經(jīng)染色后，分選初始T細胞，再分化成Th2細胞，再進行相關(guān)檢測。

1.9統(tǒng)計學(xué)方法用Graphpad Prism軟件行統(tǒng)計學(xué)分析，兩組計量資料比較采用兩獨立樣本t檢驗，檢驗水準為0.05。用Image J軟件進行免疫印跡實驗圖像分析條帶。

2 結(jié)果

2.1Th2細胞中的IRF4與USP4相互作用我們利用USP4篩選在T細胞中能與其相互作用的轉(zhuǎn)錄因子。我們在HEK-293T細胞中過表達帶Ha標簽的USP4和帶Myc標簽的轉(zhuǎn)錄因子，如GATA3，STAT6(信號傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子6)，IRF4，PU.1，用anti-Ha做免疫共沉淀實驗，再用免疫印跡實驗方法檢測。對比只轉(zhuǎn)染了空對照質(zhì)粒的細胞，在共轉(zhuǎn)染的轉(zhuǎn)錄因子和USP4的Th2細胞中檢測到被USP4拉下來的IRF4的強信號。提示USP4可能與IRF4相互作用。接著用帶有Ha標簽的USP4和帶有Flag標簽的IRF4及分別使用抗Ha和抗Flag進行免疫共沉淀實驗。最后，進行免疫印跡實驗。與用空對照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細胞比較可見用IRF4和USP4共轉(zhuǎn)染的細胞中檢測到USP4或IRF4下拉的強IRF4或USP4的強信號(見圖1A)。證明了IRF4和USP4之間的相互作用。體外誘導(dǎo)Th2細胞，利用Normal IgG和anti-USP4分別對Th2細胞的裂解液進行免疫共沉淀實驗，我們檢測到了anti-USP4沉淀下來了IRF4，證明了Th2細胞中USP4和IRF4相互作用(見圖1B)。

2.2USP4穩(wěn)定IRF4蛋白的穩(wěn)定性受到去泛素化酶影響。為驗證USP4對IRF4的作用，在HEK-293T細胞中表達Flag-IRF4和Ha-USP4，同時USP4逐步增加轉(zhuǎn)染劑量。實驗結(jié)果可見USP4對IRF4呈劑量依賴性(見圖2)。

圖1 Th2細胞中的IRF4與USP4相互作用：A為Flag-IRF4和Ha-USP4共轉(zhuǎn)入六孔板的HEK-293T細胞中，在48 h后收集細胞，細胞裂解后分別加入抗Ha或抗Flag單克隆抗體沉淀各1 μg，再經(jīng)抗Ha或Flag的單克隆抗體行免疫印跡分析；B為體外誘導(dǎo)Th2細胞，擴增至1千萬，分成兩份，裂解，加入1 μg標準IgG和anti-USP4沉淀，再經(jīng)免疫印跡分析anti-IRF4抗體

圖2 USP4穩(wěn)定IRF4：相同劑量的Flag-IRF4依次與增加劑量的Ha-USP4共轉(zhuǎn)入HEK-293T細胞；48 h后收集細胞，待細胞裂解測定USP4和IRF4表達水平

2.3USP4去泛素化IRF4為驗證USP4對IRF4的去泛素化功能，用HEK-293T細胞以cDNA為模板獲得泛素的編碼序列，并將其克隆到pIPHis載體上。在HEK-293T細胞中瞬時表達Flag-IRF4，Ha-USP4，Ha-USP4C311A以及His-Ubiquitin再用Ni-NTA(氨基三乙酸鎳)純化沉淀和免疫印跡的方法檢測(見圖3A)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)USP4可以去泛素化IRF4，而它的酶活突變體作用卻不明顯。為了探究RORγt主要受泛素上哪個位點的多泛素調(diào)節(jié)，我們構(gòu)建了泛素突變體pIPHis-K48only和K63only(只有48位點或63位點為賴氨酸殘基)，我們在HEK-293T細胞中瞬時表達Flag-IRF4，Ha-USP4和His-Ubiquitin或其突變體(K48，K63only)，通過Ni-NTA純化沉淀，結(jié)果顯示USP4同時介導(dǎo)IRF4 K48和K63位點的去泛素化。以上實驗結(jié)果表明去泛素化酶USP4可以介導(dǎo)IRF4蛋白泛素K48、K63位的去泛素化(見圖3B)。

2.4USP4，IRF4，NFATC2(活化T細胞核因子)共同作用IL-4的轉(zhuǎn)錄活性在Th2細胞中IRF4是一種關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子。IRF4的表達能被USP4穩(wěn)定，IRF4與USP4共同作用可促進IL-4的活化，但效用不顯著(見圖4A)。但在轉(zhuǎn)IRF4，NFATC2，USP4后，可發(fā)現(xiàn)IL-4的轉(zhuǎn)錄活性增加明顯(見圖4B,4C)。利用USP4的抑制劑vialinin A處理分化的Th2細胞，測得IL-4，IRF4的表達下降(見圖4D)。

2.5Th2細胞中，下調(diào)USP4影響Th2相關(guān)細胞因子的表達Th2細胞中IRF4作為主要的轉(zhuǎn)錄因子，由此可推斷出Th2細胞的功能可能受去泛素化酶USP4的影響。為了驗證我們的推論，我們首先把USP4特異性短發(fā)夾RNA(shUSP4-1,2)克隆到慢病毒載體pLKO.1上，隨后我們在HEK 293T細胞中包裝出包含該段序列的病毒顆粒，再用病毒顆粒感染體外誘導(dǎo)分化形成的Th2細胞。感染成功后的Th2細胞有嘌呤霉素抗性，再用嘌呤霉素對細胞進行選擇從而獲得較純的被病毒感染的Th2細胞。結(jié)果顯示在Th2細胞中下調(diào)USP4(見圖5A)后，Th2細胞內(nèi)IRF4蛋白水平降低，與Th2相關(guān)的細胞因子IL-4，IL-10，IL-13的轉(zhuǎn)錄水平也顯著降低(見圖5B)。

2.6IL-4、IRF4的表達水平在風(fēng)濕性心臟病病人中升高風(fēng)濕性心臟病是一種十分復(fù)雜的自身免疫性疾病。急性期是Th1細胞起主要作用。在后期，IL-2、IL-17的作用更強。為探討風(fēng)濕性心臟病進行的病理機制，在獲得健康人和符合風(fēng)濕性心臟病診斷要求的病人的外周血單核細胞后用密度梯度離心法離心分離外周血單核細胞和用流式細胞技術(shù)檢測可見IRF4，IL-4的水平均升高(見圖6A,6B)。

3 討論

風(fēng)濕性心臟病是一種自身免疫性炎癥反應(yīng)性疾病。急性風(fēng)濕熱期(ARF)Th1分泌的γ-干擾素(IFN-γ)升高明顯，而在風(fēng)濕性心臟病時，IL-4上升。IL-4是一種抗炎癥反應(yīng)細胞因子，在風(fēng)濕性心臟病轉(zhuǎn)入慢性期時起到一定作用。IL-4在免疫性炎癥反應(yīng)中的作用已有研究，如在多發(fā)性硬化病中[5]。張銳和葛建軍[6]研究表明IL-6水平高低與冠心病診斷有一定相關(guān)性。另外，Kikly K等也在病變的瓣膜及心肌組織中檢測到IL-17的表達[7]。沈奎亞等[8]指出IL-17與TNF-α共同作用可促進p38蛋白激酶(p38 MAPK)的磷酸化過程而具有明顯致炎作用。

圖3 USP4去泛素化IRF4：A為在HEK-293T細胞內(nèi)轉(zhuǎn)染Flag-IRF4，Ha-USP4，Ha-USP4C311A，His-Ubiquitin，48 h后收獲細胞,在此前MG132(20 μmol/L)處理3 h，Ni-NTA鎳螯合樹脂純化沉淀物，再免疫印跡分析經(jīng)處理抗Flag和抗Ha的單克隆抗體。細胞裂解液IRF4,USP4,ACTIN表達水平也經(jīng)免疫印跡分析。B為HEK-293T細胞內(nèi)共轉(zhuǎn)Flag-IRF4，Ha-USP4，His-Ubiquitin突變體K63only，K48only，48 h后收集細胞,收細胞前MG132(20 μmol/L)處理3h，用Ni-NTA 鎳螯合樹脂純化沉淀，再經(jīng)抗Ha，抗Flag的單克隆抗體進行免疫印跡分析

圖5 Th2細胞中，下調(diào)USP4影響Th2相關(guān)細胞因子的表達：A為DR8.9,shRNA,VSVG三質(zhì)粒系統(tǒng)包裝慢病毒，36～48 h后收集病毒，感染體外誘導(dǎo)分化好的Th2細胞，因構(gòu)建shRNA攜帶嘌呤霉素抗性，所以在應(yīng)用嘌呤霉素篩選一周后，直接裂解，用抗IRF4抗體進行免疫印跡，檢測相關(guān)指標；B為用嘌呤霉素篩選1周后的Th2細胞抽提RNA并反轉(zhuǎn)cDNA，使用實時定量PCR的方法檢測相關(guān)基因(USP4，IRF4，IL-4，IL-5，IL-10，IL-13)的表達水平。aP<0.05，bP<0.01

T細胞受到外來抗原物質(zhì)刺激后活化進而釋放IL-4、IL-5、IL-13等細胞因子，其中IL-4較為重要。而后GATA3在IL-4的啟動子附近聚集，進而促進IL-4表達[9]。通過利用USP4的小分子抑制劑Vialinin A處理體外誘導(dǎo)分化的Th2細胞時隨著抑制劑劑量增加，IRF4，IL-4都會降低。這說明USP4能影響IL-4表達。Rengarajan等[10]發(fā)現(xiàn)IRF4與DNA結(jié)合不牢固，NFATC2和IRF4在結(jié)合后使NFATC2介導(dǎo)的IL-4的表達增加?；罨筲}離子調(diào)控蛋白NFATC2可作為轉(zhuǎn)錄因子進入細胞核，參與調(diào)節(jié)細胞的多種功能[11]。我們研究發(fā)現(xiàn)USP4可以穩(wěn)定IRF4的同時促進IL-4的表達。USP4、NFATC2、IRF4共同作用可以顯著增加IL-4的表達。這可能是因為IRF4本身結(jié)合基因的能力較小，NFATC2和USP4共同作用于IRF4，使其形成一個穩(wěn)定的復(fù)合體，從而促進IL-4的轉(zhuǎn)錄。IRF4存在于多種免疫細胞中，如Th2、Treg、Th17細胞[12]。

泛素化分為單泛素化、多重單泛素和多泛素化。多泛素化是將多個泛素單體通過異肽鍵進行連接，在靶蛋白賴氨酸上形成多泛素鏈，經(jīng)研究證實不同位點的多泛素化發(fā)揮著不同的生理功能[13]。K48位點的多泛素化參與蛋白降解而K63位點的多泛素化參與DNA損傷修復(fù)、酶激活等。去泛素化在炎癥反應(yīng)中的研究目前越來越多。USP22去泛素化NFATC2，增加其穩(wěn)定性并促進IL-2的表達[10]而USP17去泛素化RORγt增強IL-17的表達[14]。去泛素化酶USP21也通過泛素化調(diào)控Th2細胞轉(zhuǎn)錄因子GATA3的穩(wěn)定性[15]。我們的研究發(fā)現(xiàn)去泛素化酶USP4可以介導(dǎo)IRF4蛋白泛素K48、K63位的去泛素化。這也是USP4影響IRF4穩(wěn)定性的重要因素。此外，我們發(fā)現(xiàn)利用基因沉默下調(diào)USP4的表達，IRF4蛋白水平會下調(diào)，但轉(zhuǎn)錄水平會有所上升。這可能與USP4表達后，其對IRF4存在的泛素化和去泛素化修飾有關(guān)。

另外，我們的研究發(fā)現(xiàn)去泛素化酶USP4在風(fēng)濕性心臟病病人外周血CD4+T細胞中表達升高，且風(fēng)濕性心臟病病人的外周血的CD4+T細胞中IRF4、IL-4的表達也增多，我們考慮篩選USP4的小分子抑制劑作進一步研究，從而為治療風(fēng)濕性心臟病提供了新的治療方向。

(本文圖4，6見插圖4-1)