余少鴻，趙永恒,朱 磊，羅 然，楊 杰，舒 杰，李建昌，宋登輝,高俊勇

(1.云南省昆明市第一人民醫(yī)院甘美國際醫(yī)院普外科 650000；2.重慶市涪陵中心醫(yī)院腫瘤內(nèi)科 400800)

結(jié)腸癌是消化系統(tǒng)常見腫瘤之一[1]，雖然有手術(shù)、化療、分子靶向治療等綜合治療手段，但療效不佳。腫瘤干細(xì)胞理論是近年來提出的新理論[2]，可能更好解釋腫瘤發(fā)生、發(fā)展、復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移、耐藥等過程。研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤干細(xì)胞存在于白血病、乳腺癌、結(jié)直腸癌、肝癌、胃癌、胰腺癌等多種腫瘤。2007年首次報道結(jié)直腸癌干細(xì)胞的存在[3-5]，其具有自我更新、多向分化、能連續(xù)傳代等特征。其鑒定的方法主要是流式細(xì)胞儀檢測表面標(biāo)志物CD133、CD44、乙醛脫氫酶1(ALDH1)、上皮細(xì)胞黏附分子(epithelial cell adhension molecule,EpCAM)、CD166等。CD44是一種與細(xì)胞增殖、腫瘤侵入、血管增生相關(guān)的膜受體，動物實驗表明，拮抗CD44可抑制腫瘤細(xì)胞生長。

分離培養(yǎng)腫瘤干細(xì)胞是研究結(jié)腸癌干細(xì)胞的前提，國內(nèi)有文獻(xiàn)報道，從結(jié)腸癌Lovo細(xì)胞提取CD44/EpCAM陽性細(xì)胞可以達(dá)到17.4%[6]。因此，筆者擬采用新鮮結(jié)腸癌及結(jié)腸癌細(xì)胞分離培養(yǎng)結(jié)腸癌干細(xì)胞，并建立穩(wěn)定傳代的結(jié)腸癌干細(xì)胞珠。線粒體是細(xì)胞能量生成、儲存和供給的場所，電子在線粒體內(nèi)沿電子傳遞鏈經(jīng)氧化磷酸化的方式被轉(zhuǎn)化成含有高能磷酸鍵的腺苷三磷酸(ATP)，線粒體呼吸鏈酶復(fù)合物Ⅰ～Ⅳ是電子傳遞鏈的組成成分，其活性變化能直接或間接地反映線粒體呼吸功能的變化。復(fù)合物Ⅰ是呼吸酶復(fù)合物中最大的一個，高能電子首先經(jīng)過復(fù)合物Ⅰ，釋放能量后依次下傳。復(fù)合物Ⅲ細(xì)胞色素C氧化酶(COX)是位于線粒體內(nèi)膜上呼吸鏈末端的限速酶，是唯一能將電子傳遞給氧分子的細(xì)胞色素復(fù)合物，因此復(fù)合物Ⅰ和Ⅲ在整個電子傳遞及氧化磷酸化過程中起關(guān)鍵作用。本研究探索人結(jié)腸癌干細(xì)胞COXⅠ、ND1基因mRNA的表達(dá)變化。

1 材料與方法

1.1材料 新鮮結(jié)腸癌組織選自本院37例結(jié)腸癌手術(shù)患者標(biāo)本；人結(jié)腸癌HCT-116、HT-29細(xì)胞均由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院昆明生物研究所惠贈；CD44抗體及CD133抗體均購自德國Miltenyi Biotec公司，Actin抗體、細(xì)胞裂解液(RIPA)均購自碧云天公司(中國)，10%胎牛血清購自美國Biological Industries公司，Dulbecco改良細(xì)胞培養(yǎng)基(DMEM培養(yǎng)基)購自美國Thermo Scientific公司，實時熒光定量PCR儀購自美國ABI公司，流式細(xì)胞儀Accuri C6購自美國BD公司。

1.2方法

1.2.1新鮮結(jié)腸癌細(xì)胞的分離 選取結(jié)腸癌患者新鮮病理標(biāo)本，剪碎標(biāo)本，離心，DTT液去除黏膜,PBS液沖洗4次，DNA裂解酶分離裂解標(biāo)本，PBS液洗滌，DNA酶拮抗劑中和，磨碎標(biāo)本，離心，提取結(jié)腸癌細(xì)胞。

1.2.2細(xì)胞培養(yǎng)與分離 將結(jié)腸癌細(xì)胞株接種于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，在37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，常規(guī)傳代。CD44磁珠與人新鮮結(jié)腸癌細(xì)胞、HT29細(xì)胞和 HCT116細(xì)胞孵育，然后用LS柱(Miltenyi Biotec,130042401)與磁珠分選起始套裝(Miltenyi Biotec,130091051)混合分離CD44+細(xì)胞；CD44+/-細(xì)胞培養(yǎng)于DMEM/F12 培養(yǎng)液(Gibico,1237830)，包括cEGF、bEGF和B27等因子。而沒有分離的細(xì)胞培養(yǎng)于DMEM 培養(yǎng)液(HyClone,SH30243.01B)。每隔3 d顯微鏡下觀察細(xì)胞生長情況。

1.2.3流式細(xì)胞儀檢測其表面標(biāo)記物 收集結(jié)腸癌細(xì)胞后，把每管0.5 mol/L細(xì)胞，離心，取沉淀，混勻，添加抗體IgG1-PE、IgG1-FITC、CD133-PE和CD44-FITC(各2 μL/0.5 mol/L)在2～8 ℃孵育。CD133或CD44陽性細(xì)胞由流式細(xì)胞儀Accuri C6篩選。重懸細(xì)胞于培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.4細(xì)胞總RNA的提取和鑒定 結(jié)腸癌干細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)8 h，以同期培養(yǎng)的結(jié)腸癌細(xì)胞株為對照，提取細(xì)胞總RNA。首先用PBS緩沖液將細(xì)胞清洗3遍，而后按照TRIzol試劑說明書的步驟進(jìn)行操作，最終提取的RNA以DEPC水溶解后加入DNase酶消化去除DNA，并利用紫外分光光度計測定RNA的濃度與純度，瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性。

1.2.5引物合成 ND1、COXⅠ、t3-actin引物由上海生工生物工程有限公司合成。根據(jù)人線粒體基因組序列(www．mitomap．org)，應(yīng)用Primer Premier 5．0設(shè)計mtDNA上的3對引物，且以看家基因t3-aetin作為內(nèi)參照，并在BLAST上進(jìn)行同源性分析，引物核苷酸序列如下：ND1上游引物5′-AATCGCAATGGCATTCCTAA-3′，下游引物5′-GTAGAGGGTGATGGTAGATGTG-3′，長度229 bp；COXⅠ上游引物5′-TACCCATCATAATC GG A G GC-3′，下游引物5′-ATAGCAGATGCGAGCAGGAG-3′，長度223 bp；t3-actin上游引物5′-ACTTAGTT GCGAC ACC CrnC-3′，下游引物5′-GACTGCTGTCACCTTCACCG-3′，長度162 bp。

1.2.6實時熒光定量PCR(Real-time PCR)法檢測ND1及COXⅠ mRNA的表達(dá) 定量檢測線粒體基因表達(dá)。反應(yīng)體系25 mol/L：2×SYBR green 12．5 μL，cDNA模板2 μL，上下游引物各0.2 μL，補雙蒸水至25 μL，每個樣品設(shè)置3個平行樣。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性10 min后進(jìn)行下述40個循環(huán)，95 ℃變性15 s，60 ℃退火和延伸1 min。由于本研究使用的是相對定量方法，所以必須觀察融解曲線來優(yōu)化引物含量。

2 結(jié) 果

2.1細(xì)胞形態(tài) 分選新鮮結(jié)腸癌細(xì)胞、HT-29細(xì)胞、HCT-116細(xì)胞中CD44+分別為2.1%、4.0%及4.6%，后繼實驗證明細(xì)胞生長良好，見圖1。

2.2流式細(xì)胞儀檢測其生物學(xué)特征 結(jié)腸癌細(xì)胞、HCT-116細(xì)胞、HT-29細(xì)胞中CD44及CD133表達(dá)同時陽性細(xì)胞百分率僅為0%、1.8%及2.1%，見圖2。

2.3各組ND1 mRNA的表達(dá)情況 與CD44-比較， CD44+的結(jié)腸癌細(xì)胞ND1 mRNA的表達(dá)水平升高了300%，HCT-116細(xì)胞升高了400%，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；而HT-29細(xì)胞只升高了5%，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),見圖3、4。

圖1 各組CD44+細(xì)胞形態(tài)

圖2 流式細(xì)胞技術(shù)檢測各組CD133/CD44陽性表達(dá)情況

圖3 各組ND1 mRNA PCR電泳情況

*：P<0.05，與CD44-細(xì)胞比較

圖4各組ND1 mRNA的表達(dá)情況

圖5 各組COXⅠ mRNA PCR電泳情況

2.4各組COXⅠ mRNA的表達(dá)情況 與CD44-比較， CD44+的結(jié)腸癌細(xì)胞COXⅠ mRNA的表達(dá)水平升高了350%，HT-116細(xì)胞升高了300%，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；而HT-29細(xì)胞無明顯變化，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),見圖5、6。

*：P<0.05，與CD44-比較

圖6各組COXⅠ mRNA的表達(dá)情況

3 討 論

腫瘤干細(xì)胞學(xué)說認(rèn)為[7-9]：腫瘤細(xì)胞存在異質(zhì)性，其中一小群具有自我更新、無限增殖能力和不定分化潛能的腫瘤細(xì)胞即為腫瘤干細(xì)胞，是腫瘤形成的起始細(xì)胞，并維持腫瘤的生長；腫瘤干細(xì)胞對放療及化療藥物不敏感[10-11]，可能是腫瘤轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)的根源。目前絕大多數(shù)常見惡性腫瘤的腫瘤干細(xì)胞分離已取得成功，本實驗選取37例新鮮結(jié)腸癌患者病理標(biāo)本及兩種人結(jié)腸癌細(xì)胞系。HT-29是人高分化結(jié)腸癌細(xì)胞，易形成球形，用于觀察腫瘤細(xì)胞間細(xì)胞連接與免疫細(xì)胞作用；HCT-116是人來源結(jié)腸癌細(xì)胞，處于結(jié)腸癌分化早期階段，更接近于干細(xì)胞特性；以CD44表面抗原為基礎(chǔ)，聯(lián)合CD133表面抗原，以腫瘤干細(xì)胞特有和必需的生物學(xué)特性，證實腫瘤干細(xì)胞具有自我更新、增殖分化能力、強(qiáng)致瘤性及遺傳穩(wěn)定性，分離、鑒定了結(jié)腸癌干細(xì)胞，為下一步分子生物學(xué)研究提供基礎(chǔ)。

人們對線粒體的認(rèn)識已不再停留在“細(xì)胞能量工廠”的最初階段，目前的研究認(rèn)為線粒體還參與氧化損傷、細(xì)胞凋亡和人類進(jìn)化，甚至與一些慢性退行性疾病和多種腫瘤的發(fā)生相關(guān)。近年來，越來越多的關(guān)于線粒體的研究已深入到線粒體膜通透性轉(zhuǎn)變孔道、線粒體膜點位、Ca2+負(fù)荷、氧化損傷、凋亡前體分子、線粒體基因組穩(wěn)定性、線粒體DNA缺失及拷貝數(shù)變化等方面[12]，但有關(guān)線粒體基因表達(dá)方面的研究較少。研究表明，放射可誘導(dǎo)人線粒體COXⅠ、ND1和ND6表達(dá)升高[13]。結(jié)腸癌發(fā)生與線粒體細(xì)胞色素氧化酶COXⅠ缺乏與突變有關(guān)[14-15]。本研究結(jié)腸癌干細(xì)胞線粒體呼吸氧化系統(tǒng)酶指標(biāo)明顯升高，代謝更加活躍，干細(xì)胞需要能量及需氧量更加旺盛，阻斷ND1或COXⅠ的表達(dá)有可能會抑制腫瘤細(xì)胞的生長。因此，抑制線粒體呼吸系統(tǒng)酶活性有望成為治療腫瘤的又一潛在指標(biāo)。