范道春, 張紅兵 ， 劉 壘

(河北經(jīng)貿(mào)大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院 食品安全管理研究所,河北 石家莊 050061)

生物柴油作為一種潛在的清潔能源，越來越受到關(guān)注，目前主要用蔬菜油[1]、菜籽油[2]、麻瘋樹油[3]和餐飲廢油[4]等進行生產(chǎn)，但是產(chǎn)量低，在實際應(yīng)用中難以滿足人們對燃料的需求[5]。而光合微生物的脂肪酸組成與植物油相似，同時在脂質(zhì)產(chǎn)量方面也要高于植物[6]，因此利用光合微生物生產(chǎn)生物柴油具有廣闊前景。近年來，在生產(chǎn)生物能源方面，微藻具有的潛在價值越來越受到重視[7]。微藻被稱為“微型陽光驅(qū)動的生物化工廠”，能夠在有機物和二氧化碳存在的情況下生產(chǎn)大量的脂質(zhì)和碳?xì)浠衔颷8]，同時具有優(yōu)于陸地能源作物的優(yōu)勢，如光合效率較高、表面生產(chǎn)力強、不需耕地和低營養(yǎng)需求等[9]。目前，已有部分可再生生物燃料來源于藻類[10]，如來自中性脂質(zhì)的生物柴油[11]、生物氫[12]、烴[13-14]、乙醇[15]和甲烷[16]等。對于微藻的研究，主要以野生型藻種為主，但因其生長緩慢、油脂積累能力低和環(huán)境適應(yīng)能力弱[17]等缺陷，導(dǎo)致微藻在生產(chǎn)生物能源方面的應(yīng)用受到限制。因此有必要對微藻進行育種和篩選，以獲得最佳的優(yōu)勢藻種。

1 微藻的育種方法

1.1 物理方法

物理誘變主要是利用一些導(dǎo)致微生物發(fā)生基因突變的物理方法來進行育種，主要有紫外線、γ射線、離子誘變、中子誘變以及常壓室溫等離子體(ARTP)等。

1.1.1 紫外誘變 嘌呤和嘧啶吸收紫外光后，形成嘧啶二聚體，阻礙堿基正常配對，從而引起突變。葉麗等[18]采用紫外照射對微綠球藻(Nannochloropsisoculata)進行誘變育種，篩選出2株突變藻株MN-1和MN-2，前者的總脂含量增加9.81%，二十碳五烯酸(EPA)增加1.81%，飽和脂肪酸(SFA)增加2.70%，而后者的多糖增加 13.26%，總脂增加7.93%，SFA 增加28.9%。Sivaramakrishnan等[19]利用紫外照射柵藻(Scenedesmussp.)，篩選出1株突變株M22，經(jīng)2 mmol/L H2O2脅迫處理后，在相同條件下培養(yǎng)，突變藻株的總脂產(chǎn)量提高到1.625 g/L，較野生型增加了3倍。Liu等[20]對小球藻(Chlorellasp.)施加紫外線誘變，篩選出的突變藻株生物量較野生型提高了7.6%，脂質(zhì)含量也不同程度增加，并且呈現(xiàn)更高的生長速率，結(jié)果表明，紫外誘變對小球藻非常有效。

1.1.2 射線誘變 通過射線將能量傳遞到微藻體內(nèi)，引起染色體斷裂和重排，如果無法修復(fù)或修復(fù)過程中出現(xiàn)堿基錯配就會導(dǎo)致突變。Jongil等[21]對二形柵藻(Scenedesmusdimorphus)進行γ射線照射，篩選出的突變藻株Sd-Pm210的生長速率比野生型更高，其脂質(zhì)含量增加了25%，用薄層色譜法分析脂質(zhì)成分發(fā)現(xiàn)三?；视偷暮匡@著提高，脂肪酸甲酯的含量增加1.4倍左右，其中的脂肪酸主要是棕櫚酸、油酸、亞油酸和亞麻酸。呂小義等[22]利用60Co-γ射線輻照誘變裂壺藻(Schizochytriumlimacinum)，得到1株高產(chǎn)突變株1.6-7-1，其搖瓶發(fā)酵生物量為47.37 g/L，油脂含量為31.41%，二十二碳六烯酸(DHA)產(chǎn)量為5.65 g/L，較出發(fā)株提高了約40%，經(jīng)連續(xù)5代發(fā)酵培養(yǎng)，其遺傳性能穩(wěn)定。Cheng等[23]采用137Se-γ射線對小球藻(Chlorellasp.)進行照射誘變，篩選出的突變藻株經(jīng)馴化后，生物量和脂質(zhì)含量分別提高25% 和54.9%。上述結(jié)果表明，射線育種可用于篩選生物燃料高產(chǎn)的藻株。

1.1.3 重離子誘變 重離子通常指原子序數(shù)大于4、失去全部或部分電子的所有帶電粒子，它會導(dǎo)致生物體電離損傷，改變?nèi)旧w序列或結(jié)構(gòu)引起變異。Hu等[24]采用碳重離子對微藻(Desmodesmussp.)進行誘變，在24孔微量培養(yǎng)板上篩選出突變藻株D90G-19，其脂質(zhì)生產(chǎn)力為0.298 g/(L·d)，比野生型藻株高出20.6%，結(jié)果表明，重離子輻射結(jié)合高通量篩選是提高微藻產(chǎn)脂能力的有效手段。王芝瑤等[25]利用碳重離子對微擬球藻(Nannochloropsisoceanica)進行誘變，得到2株突變藻珠HP-1和HP-2，其生物量分別提高了18%和26%，油脂產(chǎn)率分別為295 mg/(L·d)和275 mg/(L·d)，突變藻株的生長速度和油脂產(chǎn)率較野生型藻株具有明顯的優(yōu)勢。Ma等[26]通過碳重離子誘變微擬球藻(Nannochloropsisoceanica)，獲得1株較高生長速率的突變體HP-1，其生物量和最大生長速率分別增加19%和6%，脂質(zhì)生產(chǎn)率從211 mg/(L·d)增加到271 mg/(L·d)，提高了28%。脂質(zhì)組成經(jīng)分析后發(fā)現(xiàn)，三酰甘油(TAG)含量增加了14%，極性脂質(zhì)含量降低了15%，由于HP-1具有較高的脂質(zhì)生產(chǎn)力，TAG含量高，可成為微藻生產(chǎn)生物柴油方面有價值的候選藻株。

1.1.4 低能離子束 低能粒子束注入藻細(xì)胞后因碰撞產(chǎn)生大量的自由基，損傷細(xì)胞的DNA引起突變，常用的低能離子束有N+、Ar+、Zn+、Fe+、C2+、C5+等。Fu等[27]將低能碳離子植入到裂壺藻(Schizochytriumlimacinum)中，獲得的突變藻株S1的DHA生產(chǎn)能力比親本藻株提高了61%，在最佳發(fā)酵條件下，S1的DHA產(chǎn)量可達到6.52 g/L，占總脂質(zhì)的46.2%。Yang等[28]采用3 MeV C2+對菱形藻(Nitzschiasp.)進行誘變，篩選出了20株幸存藻株，平均脂質(zhì)含量比野生型增加了9.8%。付杰等[29]對裂壺藻(Schizochytriumlimacinum)進行低能氮離子束誘變，選育出1株高產(chǎn)突變株15k-160s-2-3，其DHA產(chǎn)量為5.48 g/L，提高了約35%，生物量為47.66 g/L，油脂產(chǎn)量為14.42 g/L，經(jīng)連續(xù)10代發(fā)酵培養(yǎng)，其遺傳性能穩(wěn)定，藻油脂肪酸組成簡單，具有良好的商業(yè)前景。鑒于低能離子束誘變具有突變率高、突變譜廣、操作靈活的特點，成為微生物和植物育種中新型強大的物理誘變工具。

1.1.5 中子輻射 通過產(chǎn)生高濃度活性氧，造成遺傳物質(zhì)的損傷和改變。Liu等[30]利用中子輻射誘變小球藻，以藻類細(xì)胞生長、總脂質(zhì)生成能力為考察指標(biāo)。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)中子輻射劑量為5.6×108n/cm2時，突變藻株的總脂質(zhì)含量增加了20%，同時中子輻射縮短了生物量積累的周期，對生長沒有負(fù)面影響。中子輻射誘變技術(shù)對于生物燃料的生產(chǎn)至關(guān)重要。

1.1.6 常壓室溫等離子體(ARTP) ARTP誘變育種儀能在大氣壓下產(chǎn)生具有高活性粒子濃度的等離子體射流，對遺傳物質(zhì)具有損害和改變作用。Liu等[31]采用ARTP對寇氏隱甲藻(Crypthecodiniumcohnii)進行誘變，篩選出高產(chǎn)突變藻株M7，其細(xì)胞外多糖(EPS)體積產(chǎn)量為1.02 g/L，生物量產(chǎn)量為0.39 g/g，分別提高了33.85% 和85.35%，經(jīng)9代培養(yǎng)后其遺傳性能穩(wěn)定。研究表明，通過ARTP對海洋微藻C.cohnii的誘變是行之有效的。Fang等[32]通過采用純氦氣驅(qū)動的ARTP誘變鈍頂螺旋藻(Spirulinaplatensis)，以碳水化合物含量和生長速率為指標(biāo)，使用96孔微孔板和酶標(biāo)儀的高通量篩選，獲得3株代表性突變藻株，其中3-A10和3-B2的碳水化合物含量分別提高了40.3% 和78.0%，而4-B3的比生長速率增長了10.5%。目前，ARTP作為有效的非轉(zhuǎn)基因誘變工具，已成功應(yīng)用于細(xì)菌、放線菌、真菌、酵母、微藻等在內(nèi)的40余種微生物，應(yīng)用前景廣闊[33]。

1.2 化學(xué)誘變

化學(xué)誘變主要使用一些導(dǎo)致基因發(fā)生突變的化學(xué)誘變劑誘變處理，使遺傳物質(zhì)發(fā)生突變。常用的化學(xué)誘變劑主要有甲基磺酸乙酯(EMS)和N-甲基-N′-硝基-N-亞硝基胍(MNNG)等。

1.2.1 EMS EMS作為一種烷化劑，可以直接作用于DNA的堿基和磷酸，使之發(fā)生烷化作用，經(jīng)過脫嘌呤作用后導(dǎo)致DNA鏈上堿基缺失引起突變。Patel等[34]使用EMS對集胞藻6803(SynechocystisPCC 6803)進行隨機誘變，篩選出的突變體D1的碳水化合物和脂質(zhì)產(chǎn)量分別提高了46%和64%，D8的脂質(zhì)產(chǎn)量提高了82%。Sachdeva等[35]使用EMS誘變得到用2株耐47 ℃高溫的蛋白核小球藻(Chlorellapyrenoidosa)突變藻株M18和M24，30 ℃培養(yǎng)后M18和M24的脂質(zhì)含量分別增加了59.62% 和50.75%。Zhang等[36]通過EMS對2種沙漠微藻(Desmodesmussp.)S81和G41進行誘變，獲得的突變體S5和G3的脂質(zhì)含量分別為48.41% 和 46.01%，脂質(zhì)生產(chǎn)率為19.83 mg/(L·d)和17.92 mg/(L·d)，脂質(zhì)成分分析顯示多不飽和脂肪酸(PUFA)和乙二醇含量減少，單不飽和脂肪酸(MUFA)和中性脂質(zhì)含量增加，適用于生物柴油生產(chǎn)。雖然EMS具有突變頻率高、誘變損傷輕等優(yōu)勢，但其本身具有致癌性和揮發(fā)性，操作者需要注意安全。

1.2.2 MNNG MNNG可直接與DNA作用并使其損傷，導(dǎo)致染色體異常。Iskandarov等[37]采用MNNG對綠藻(Paristochlorisincisa)進行誘變，篩選出富含dihomo-γ-亞麻酸(DGLA)且花生四烯酸(ARA)缺陷的突變體，在氮饑餓條件下培養(yǎng)14 d后生物量達到3.6 g/L，總脂肪酸含量達到39%，其中DGLA比例增加到32%，幾乎不產(chǎn)生ARA。沈國明等[38]探討了不同濃度的MNNG對雨生紅球藻(Haematococcuspluvial)誘變后的影響，發(fā)現(xiàn)高濃度的MNNG對微藻的細(xì)胞膜、線粒體及葉綠體等傷害巨大，2.5 g/L的MNNG是雨生紅球藻的最佳誘變濃度。由于化學(xué)誘變劑MNNG本身具有易燃、有毒、致癌等危害，操作人員使用時應(yīng)謹(jǐn)慎。

1.3 基因工程育種

基因工程方法育種針對性強，減緩了隨機誘變的盲目性和不可控性，有益于提高微藻的性能及穩(wěn)定性。目前已經(jīng)通過?；?ACP硫酯酶(TE)的過表達，成功地增加了原核生物(如大腸埃希菌和藍細(xì)菌)的脂肪酸(FA)含量，提高了微藻(如萊茵衣藻)的中性脂質(zhì)產(chǎn)量[39]。劉飛飛等[40]將博來霉素抗性基因(ble)隨機導(dǎo)入三角褐指藻基因組中，篩選出了2株突變藻株，其多不飽和脂肪酸 EPA(C20:5) 含量分別提高了4.70% 和3.40%，不飽和脂肪酸(如C18:1、C18:2)雖然含量較少，但在突變藻株中的含量都有不同程度的提高。

在基因操作中，利用隨機導(dǎo)入基因的誘變方法，仍然具有目的性弱、不確定性高和工作量大的缺點，也會損傷微藻部分基因[41]。目前在微藻基因敲除方面的研究取得了新的進展，在最先進的CRISPR/Cas9系統(tǒng)中，由sgRNA指導(dǎo)的Cas9核酸酶可完成精準(zhǔn)的基因敲除，實現(xiàn)了微藻基因改造的可行性[42-43]。該方法在微擬球藻(Nannochlorops)的硝酸還原酶的基因敲除實驗中也得到證實[44]，在微藻基因改造育種領(lǐng)域中意義非凡。另外Kang等[45]通過轟擊法將轉(zhuǎn)錄因子Bhlh導(dǎo)入微擬球藻中，獲得能夠表達NsbHLH2的轉(zhuǎn)基因藻株3-6，在氮限制條件下，其脂肪酸甲酯(FAME)的生產(chǎn)力提高了33%。雖然基因工程育種能夠控制轉(zhuǎn)入的外源基因，但是對于轉(zhuǎn)基因微藻的安全性，目前缺乏明確的結(jié)論[46]，有待觀察。

表1 不同育種方法的原理和優(yōu)缺點比較

2 富油脂微藻篩選方法

由于突變具有不可控性，成功率低，需要花費大量的時間和精力篩選微藻目的突變株。在富油脂微藻篩選方面，尼羅紅染色法[35]和蘇丹黑B染色法[27]是比較常見的篩選方法，而低場核磁共振技術(shù)和熒光激活細(xì)胞分選技術(shù)則是近年發(fā)展起來的具有應(yīng)用前景的方法。

2.1 低場核磁共振技術(shù)(LF-NMR)

LF-NMR技術(shù)自推出40年以來，在量化油脂方面已經(jīng)成功應(yīng)用到油料勘探[56]、食品工業(yè)[57]等領(lǐng)域。LF-NMR的脂質(zhì)定量基于樣品分析各階段中氫核松弛時間不同，如碳水化合物和蛋白質(zhì)表現(xiàn)出微秒級的最短松弛時間，而結(jié)合水、游離水和脂質(zhì)的釋放時間分別為幾微秒、幾秒和幾百毫秒[58]。Wang等[59]研究并評估了LF-NMR技術(shù)在檢測小球藻細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)含量的可行性，表明LF-NMR對藻類脂質(zhì)非常敏感，在干脂質(zhì)樣品和藻肉湯中的檢測限(LOD)分別為0.002 6 g/L和0.32 g/L，定量限(LOQ)為0.009 3 g/L和1.18 g/L，為了降低游離水對信號的干擾，實驗加入了5.0% 的MnCl2以確保游離水信號被完全去除，驗證實驗分別利用LF-NMR和GC-MS對3個干細(xì)胞樣品和3個藻類肉湯樣品進行脂質(zhì)含量測定，比較發(fā)現(xiàn)，兩者百分比差異小于2.0%，該方法還可應(yīng)用于實時監(jiān)測發(fā)酵過程中的脂質(zhì)含量，可以更好地了解脂質(zhì)積累機制和掌握動態(tài)生物過程控制，因此，LF-NMR在藻類脂質(zhì)含量定量分析方面即準(zhǔn)確又精確，考慮到該方法是直接測定培養(yǎng)液中微藻的脂質(zhì)含量，可以避免有機溶劑、超聲波等提取法對微藻細(xì)胞的破壞，由于活細(xì)胞中部分脂質(zhì)存在于膜結(jié)構(gòu)上或以蛋白質(zhì)覆蓋的脂滴形式存在于細(xì)胞質(zhì)中，導(dǎo)致活細(xì)胞中脂質(zhì)不能完全暴露于外部磁場，因此得到的LF-NMR響應(yīng)強度比相應(yīng)的干樣品更弱，脂質(zhì)含量測定值偏低。

2.2 熒光激活細(xì)胞分選技術(shù)(FACS)

FACS又稱流式細(xì)胞儀，每秒可以實時檢測幾千個細(xì)胞，并可主動將細(xì)胞分離，實現(xiàn)了對大量單細(xì)胞利用同一組參數(shù)進行自動量化，在分離酵母、絲狀真菌和所需的突變體細(xì)菌[60-61]等方面成功實施。Doan等[62]以EMS處理微擬球藻(Nannochloropsissp.)，并經(jīng)FACS分選高脂質(zhì)含量突變體，其總脂肪酸含量增加了4倍，其中棕櫚油酸增加30%，二十碳五烯酸減少45%，表明使用隨機誘變結(jié)合流式細(xì)胞分選技術(shù)，提高了高脂質(zhì)含量突變藻株的篩選能力，有益于獲取生物柴油原料脂肪酸構(gòu)型的微藻突變體。

3 誘變致死率測定方法

SYTOX Green是一種非通透性的花菁染料，能輕松地透過質(zhì)膜受損的細(xì)胞與核酸結(jié)合但不干擾細(xì)胞的生長，在488 nm激光光源激發(fā)下，熒光會增強500倍以上。Doan等[62]將SYTOX Green染料和EMS處理的微擬球藻(Nannochloropsissp.)混合至終濃度為0.5 μmol/L，室溫下溫育20 min，通過加入純甘油提高SYTOX Greens的最佳濃度和染色時間，采用Epics AltraTM流式細(xì)胞儀測量綠色熒光活性，結(jié)果顯示，以0.5、1.0和1.2 mol/L的EMS處理的藻細(xì)胞的致死率分別為57.3%、92%和100%，從0.5和1.0 mol/L的EMS處理的藻細(xì)胞中篩選出的突變株E2和E3，測定表明E2和E3的PUFA含量分別增加了50%和減少了20%，E3的總脂質(zhì)含量最高。

4 展 望

利用物理方法進行突變育種，雖然操作簡單、對人體的危害小，但所需設(shè)備價格昂貴，一次性投入高，難以推廣?；瘜W(xué)誘變法雖然克服了投入過高的弊端，但同樣存在突變位點的不確定性，鑒于實驗藥劑大都是強烈致癌物，對人體和環(huán)境的友好程度差，實驗操作者往往內(nèi)心存在抵觸和恐懼心理，再加上需要探討致死率和突變率的最佳結(jié)合條件，費時費力，應(yīng)用日趨減少。而利用基因工程手段進行定點突變，克服了上述兩種方法帶來的隨機突變結(jié)果不可控的缺陷，甚至可以把其他物種中存在的特定基因克隆到微藻體內(nèi)表達，構(gòu)建新的特殊應(yīng)用型微藻藻株，包括能源生產(chǎn)、污水處理等，但該方法需要對微藻遺傳背景如基因序列、表達調(diào)控機制等具有足夠了解。所以，富油脂微藻育種技術(shù)需要走的路依舊很長，仍需所有科研人員的共同努力。