馬 蘭, 曾海娟, 謝曼曼, 胡 謙, 丁承超, 王淑娟, 翟緒昭, 孫靜娟, 李 杰, 王 艷, 董慶利, 劉 箐
(上海理工大學(xué) 醫(yī)療器械與食品學(xué)院, 上海 200093)
茄科勞爾氏菌(Ralstoniasolanacearum,RS) 菌體呈短桿狀,革蘭陰性菌,屬于假單胞菌科,勞爾氏菌屬[1]。青枯病菌種內(nèi)變異豐富,按不同的宿主范圍分為5個(gè)不同的生理小種[2],分別侵染馬鈴薯、煙草,海里康、香蕉,馬鈴薯、番茄,姜和桑樹(shù)。RS因廣泛分布于各種地區(qū),可引起番茄、茄子、辣椒、馬鈴薯等茄科蔬菜的青枯病害,成為多種農(nóng)作物減產(chǎn)的主要原因。作為土傳性細(xì)菌,RS能隨土壤、灌溉水及宿主植株繁殖材料傳播擴(kuò)散,植株病害癥狀往往是發(fā)病晚期才顯現(xiàn),如若在侵染初期加強(qiáng)對(duì) RS的檢測(cè),及時(shí)限制或清除病原菌,對(duì)青枯病的預(yù)防蔓延有重要意義。 目前,青枯病已被許多國(guó)家列為檢疫對(duì)象,RS的檢測(cè)也從傳統(tǒng)的癥狀判斷、微生物分離鑒定發(fā)展到免疫學(xué)如ELISA[3]、分子生物學(xué)診斷如PCR[4-6]。由于設(shè)備限制及技術(shù)要求等因素,當(dāng)前的青枯病實(shí)際檢測(cè)多以傳統(tǒng)檢測(cè)方法為主,其中微生物分離檢測(cè)周期長(zhǎng)且效率較低。相比較,免疫分析技術(shù)操作簡(jiǎn)便且分析時(shí)間短[7-8]。高特異性、高靈敏度的選擇性單克隆抗體是免疫分析技術(shù)成功建立的關(guān)鍵因素之一。本研究選取青枯病菌GIM1.76作為免疫抗原制備抗青枯病菌的單克隆抗體,為后續(xù)建立RS免疫快速檢測(cè)技術(shù)提供參考,以期降低番茄、茄子、辣椒、馬鈴薯等茄科農(nóng)產(chǎn)品產(chǎn)量損失。
1.1.1 菌株與培養(yǎng)基 ①RS宿主植物為生姜的4號(hào)生理小種菌株GIM1.71;RS宿主植物為馬鈴薯的3號(hào)生理小種菌株GIM1.74;RS宿主植物為木麻黃的2號(hào)生理小種菌株GIM1.76;RS宿主植物為桑樹(shù)的5號(hào)生理小種菌株RS-5;RS宿主植物為番茄的1號(hào)生理小種菌株GMI1000,即RS標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC-BAA1114; 桑腸桿菌JX-6、蘇云金芽胞桿菌SYJ。以上菌株均由江蘇科技大學(xué)贈(zèng)送,選用CPG(Casamino acid- Peptone-Glucose)培養(yǎng)基(葡萄糖5 g,水解酪蛋白1 g,蛋白胨10 g,雙蒸水1 L)培養(yǎng)[9]。②瓜類細(xì)菌性果斑病菌燕麥?zhǔn)人峋鞴蟻喎N標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC29625,野生菌株tw31、SD01、 PLSB1、00-1、99-5、xj112、plsb91,嗜酸菌魔芋亞種 ATCC33996、燕麥?zhǔn)人峋ㄌ厝R蘭亞種NCPPB961、玉米細(xì)菌性條斑菌 ATCC19307,選用腦心浸液培養(yǎng)基培養(yǎng)。③梨火疫病菌QB0809、XL-4,選用LB培養(yǎng)基加蔗糖后培養(yǎng)。④玉米細(xì)菌性枯萎病菌QB0241、QB0242,選用魏氏培養(yǎng)基(酵母膏3 g,蛋白胨5 g,蔗糖10 g,磷酸二氫鉀0.5 g,硫酸鎂0.25 g,抗壞血酸1 g,雙蒸水1 L)培養(yǎng)。⑤水稻細(xì)菌性谷枯病菌QB0017、QB0753、QB0755,選用LB培養(yǎng)基培養(yǎng)。
1.1.2 試劑 PCR相關(guān)試劑(Taq酶、DNTP、Mg2+、引物) (生工生物工程); DMEM培養(yǎng)基 (GIBCO公司);胎牛血清 (上海博升生物);青鏈霉素混合液、牛血清白蛋白 (Hyclone公司);聚乙二醇2000、二甲基亞砜、HRP標(biāo)記的羊抗鼠二抗、8-AG、HAT培養(yǎng)基、HT培養(yǎng)基 (Sigma公司);液體石蠟、甘油、甲醛、考馬斯亮藍(lán) G250、四乙基乙二胺、過(guò)硫酸銨、巰基乙醇、過(guò)氧化脲等 (國(guó)藥集團(tuán))。
1.1.3 儀器與設(shè)備 PCR儀 (System 9700,美國(guó)Applied Biosystems公司); 凝膠成像儀 (G:BOX Chemi XR,英國(guó)Syngen公司); 純水儀 (Milli-Q Academic A10,美國(guó)Millipore公司); 酶標(biāo)儀 (SpectraMax/N2,美國(guó)Molecular Devices公司);蛋白純化儀 (Biologic LP,美國(guó)Bio-Rad公司);電泳儀 (JY1000C,美國(guó)Bio-Rad公司);微量紫外分光光度計(jì) (NanoDrop2000c,美國(guó)Thermo公司)。
1.2.1 抗原準(zhǔn)備 將5株RS分別接種于滅菌后的CPG液體培養(yǎng)基中,37 ℃搖床增菌,PCR擴(kuò)增后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳鑒定,以擴(kuò)增核糖體基因序列(16S rDNA)為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)引物序列:RS-16S-F:TGTCCGGA AAGAAATCGCAC,RS-16S-R:CAGCACCTGTGTCCACTTTC,理論擴(kuò)增片段大小為616 bp,由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。選取GIM1.76于CPG液體培養(yǎng)基中增菌培養(yǎng)至飽和,離心棄上清后用PBS重懸,選OD600值為0.6(約1×109cfu/mL)時(shí)吸入注射器作為小鼠免疫原。
1.2.2 單克隆抗體的制備 ①小鼠免疫:每只小鼠腹腔注射0.3 mL免疫原,2周免疫1次,且第3次免疫1周后,斷尾取血測(cè)效價(jià),免疫效果不佳則繼續(xù)免疫。選取效價(jià)最好的一只小鼠于沖擊免疫1周后,眼球取血后脊椎脫臼處死小鼠,于超凈工作臺(tái)中無(wú)菌操作摘取脾臟,研磨沖洗出脾細(xì)胞,計(jì)數(shù)待細(xì)胞融合。眼球血液先在4 ℃放置后離心取血清,-20 ℃保存,以備檢測(cè)抗體效價(jià)時(shí)作為陽(yáng)性對(duì)照使用。②SP2/0骨髓瘤細(xì)胞的培養(yǎng):融合前一個(gè)月用含8-AG的DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行SP2/0的復(fù)壯篩選,并培養(yǎng)3代以上。取狀態(tài)良好的SP2/0注射到1周前被液體石蠟刺激的小鼠腹腔內(nèi)(約105個(gè)/只)。待小鼠腹部膨大后,取腹水離心,在含8-AG的10% FBS完全培養(yǎng)基中篩選3代后擴(kuò)大培養(yǎng)用做細(xì)胞融合,同時(shí)細(xì)胞于液氮罐中保存?zhèn)溆?。③?xì)胞融合及篩選:細(xì)胞融合前一天取健康小鼠的巨噬細(xì)胞作飼養(yǎng)層細(xì)胞并鋪滿10塊96孔細(xì)胞培養(yǎng)板,為雜交瘤細(xì)胞提供基本的生長(zhǎng)條件。 將SP2/0和脾細(xì)胞按1∶ 5的數(shù)量比混合后,逐滴加入1 mL 50%的PEG進(jìn)行細(xì)胞融合,融合后以約105個(gè)/孔加入細(xì)胞培養(yǎng)板中,置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)觀察待處理。用1×HAT培養(yǎng)基進(jìn)行雜交瘤細(xì)胞的篩選,待細(xì)胞長(zhǎng)至70%~80%孔底后,用間接ELISA法對(duì)細(xì)胞上清液測(cè)定融合效果,選取顯色后OD450數(shù)值高的孔稀釋后進(jìn)行亞克隆。亞克隆過(guò)程中改用1×HT培養(yǎng)基進(jìn)一步篩選雜交瘤細(xì)胞,進(jìn)行兩次以上亞克隆,直至細(xì)胞能穩(wěn)定分泌特異性強(qiáng)的抗體。④腹水抗體的制備及純化:采用動(dòng)物體內(nèi)誘生腹水法[10],選用健康雌性小鼠腹腔注射液體石蠟。1周后,將擴(kuò)大培養(yǎng)的生長(zhǎng)狀態(tài)好的雜交瘤細(xì)胞用無(wú)菌PBS重懸后,對(duì)小鼠進(jìn)行腹腔注射。待腹部膨大后,抽取腹水離心取上清,-20 ℃保存待純化。腹水先用飽和硫酸銨粗提沉淀并透析3次以上,然后用Protien G柱親和層析純化,最后將純化后的抗體用SDS-PAGE進(jìn)行純度分析[11]。
1.2.3 單克隆抗體的特性分析 ①單抗的效價(jià)測(cè)定:分別對(duì)小鼠腹水、純化后的單克隆抗體倍比稀釋后采用間接ELISA法,每個(gè)梯度做2個(gè)平行,以陽(yáng)性對(duì)照的OD450/陰性對(duì)照的OD450大于或等于2.1的最大稀釋比例為該抗體的效價(jià)測(cè)定值。②單抗的亞型鑒定: 單抗的亞型鑒定按照抗體亞型測(cè)定試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行,方法同間接 ELISA法,其中的酶標(biāo)二抗換為所購(gòu)試劑盒中抗體,測(cè)定純化后抗體的亞型類型有IgA、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgM。③單抗的特異性鑒定: 采用間接ELISA法,測(cè)定抗體與其他4株RS及實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有其他玉米、水稻、水果等農(nóng)產(chǎn)品致病菌株的結(jié)合情況。
以引物(RS-16S-F:TGTCCGGAAAGAAATCGCAC,RS-16S-R:CAGCACCTGTGTCCACTTTC)對(duì)5株茄科勞爾氏菌進(jìn)行PCR擴(kuò)增后,瓊脂糖凝膠電泳實(shí)驗(yàn)理論擴(kuò)增片段大小應(yīng)為616 bp。鑒定結(jié)果如圖1所示,5種RS在616 bp處均出現(xiàn)明顯電泳條帶,與設(shè)計(jì)的理論擴(kuò)增片段大小保持一致,說(shuō)明實(shí)驗(yàn)選用的免疫菌株是RS。
圖1 5種茄科勞爾氏菌的PCR鑒定結(jié)果Fig.1 PCR identification of RS
2.2.1 小鼠血清效價(jià) 小鼠第4次免疫后斷尾取血分別倍比稀釋1 000、2 000、4 000、8 000、16 000、32 000、64 000、128 000、256 000、512 000、1 024 000、2 048 000倍,健康小鼠血清作為陰性對(duì)照,結(jié)果為0.084 09,陽(yáng)性結(jié)果如表1所示。對(duì)所測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析后知,1、3號(hào)小鼠血清效價(jià)均是1∶512 000,2、4號(hào)小鼠血清效價(jià)均為1∶1 024 000,選擇4號(hào)小鼠沖擊免疫后做細(xì)胞融合實(shí)驗(yàn)。
表1 小鼠血清效價(jià)
2.2.2 細(xì)胞融合及雜交瘤細(xì)胞的篩選 對(duì)融合的細(xì)胞進(jìn)行篩選并進(jìn)一步亞克隆,最終得到3株可穩(wěn)定分泌抗GIM1.76菌株的單克隆抗體(1C1B1C2E4、1B3C2G7C12、9D7C5E10F11)的雜交瘤細(xì)胞株,縮記為1C1、1B3、9D7。
2.2.3 小鼠腹水效價(jià) 采用間接ELISA法測(cè)定1C1、1B3、9D7的腹水抗體效價(jià)[12],陰性對(duì)照OD450為0.0618,陽(yáng)性數(shù)據(jù)如圖2所示。分析處理數(shù)據(jù)可知,1C1、1B3、9D7的腹水效價(jià)分別是1∶1 024 000、1∶64 000、1∶256 000。
圖2 小鼠腹水的效價(jià)Fig.2 Titers of mice ascites
2.2.4 單克隆抗體的純化及純度分析 小鼠腹水純化后采用SDS-PAGE進(jìn)行純度鑒定,結(jié)果如圖3所示,所得3株單抗均無(wú)明顯雜蛋白,只有清晰的2條約50 kD的重鏈條帶和26 kD的輕鏈條帶,表明純化效果較顯著。
2.2.5 純化后單克隆抗體的效價(jià) 測(cè)定純化后抗體的效價(jià),陰性對(duì)照OD450為0.060 3,陽(yáng)性數(shù)值如圖4所示。分析可知,純化后1C1(3.651 mg/mL)、1B3(7.147 mg/mL)、9D7(2.560 mg/mL)的抗體效價(jià)分別為1∶32 000、1∶128 000、1∶64 000,抗體蛋白濃度折合成2 mg/mL后,1C1、1B3、9D7對(duì)應(yīng)抗體效價(jià)大約為1∶17 529、1∶35 819、1∶50 000。
圖3 單克隆抗體SDS-PAGE結(jié)果Fig.3 SDS-PAGE result of mice ascites and purified antibodiesM: 蛋白Marker;1:1C1純化前;2:1C1純化后;3:1B3純化前;4:1B3純化后;5:9D7純化前;6:9D7純化后M: Protein markers; 1: Pre-purified antibody-1C1;2: Post-purified antibody-1C1; 3: Pre-purified antibody-1B1;4: Post-purified antibody-1B1; 5: Pre-purified antibody-9D7; 6: Post-purified antibody-9D7
2.2.6 3株單克隆抗體的亞型鑒定 抗體亞型試劑盒測(cè)定結(jié)果如表2所示,數(shù)據(jù)表明3株抗體亞型均為IgG1。
表2 抗體亞型測(cè)定結(jié)果
2.2.7 單克隆抗體的特異性鑒定 利用間接 ELISA法檢測(cè)3株單克隆抗體對(duì)5種RS結(jié)合情況如表3所示,1C1和9D7均不能與RS-5結(jié)合,1B3不能結(jié)合1.74和 RS-5。此外,檢測(cè)結(jié)果還表明3株單克隆抗體與本實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有14株其他玉米、水稻、水果等農(nóng)產(chǎn)品致病菌株均無(wú)交叉情況。
表3 抗體的特異性分析
注:“+”表示能結(jié)合,“-”表示不能結(jié)合
由于免疫分析技術(shù)是以抗原抗體的特異性結(jié)合為基礎(chǔ)的,因而制備性能良好的單克隆抗體或者多克隆抗體是免疫分析技術(shù)應(yīng)用于RS檢測(cè)的關(guān)鍵。然而,已有研究表明,RS多克隆抗體缺乏足夠的特異性。1988年,Griep等[13]從不同區(qū)域收集了與RS分類上相關(guān)的細(xì)菌和多種腐生細(xì)菌,結(jié)果發(fā)現(xiàn)制備的多抗與其多種菌株都存在交叉反應(yīng)。2016年,白利葉等[14]利用對(duì)桑樹(shù)有致病性的 RS菌株G12-50在胞內(nèi)合成后 分泌并吸附在細(xì)胞壁周圍的重要毒力因子-內(nèi)切葡聚糖酶(EGL)制備多克隆抗體,使桑園對(duì)青枯菌的檢測(cè)更加方便快速、實(shí)用,但此抗體只針對(duì)桑青枯病菌。
由于RS具有遺傳多樣性,且具有多種生化型,現(xiàn)在的單克隆抗體不能有效的選擇區(qū)別這些RS菌株。早在1986年,蔡少華等[15]用從番茄、馬鈴薯、姜、油橄欖、甘薯、花生和桑樹(shù)上分離的代表3個(gè)生理小種的9個(gè)RS菌株為抗原,分別以其全菌和胞壁糖蛋白提取物免疫小鼠,獲得兩類雜交瘤細(xì)胞系,但其分泌抗體特異性并不明確。1991年,謝云陸等[16]利用使生姜染病的 RS制備單克隆抗體和多克隆抗體并建立免疫熒光技術(shù)(IF)和 ELISA檢測(cè)由RS引起的姜瘟病,該方法漏檢率較高。1992年,謝云陸等[17]又利用使馬鈴薯染病的RS制備單克隆抗體并應(yīng)用IF檢測(cè)了RS在馬鈴薯種薯上的潛伏,靈敏度高達(dá)2×103~2×104cfu/mL,然而此抗體只針對(duì)使馬鈴薯致病的RS菌株。以上這些研究制備的單克隆抗體由于年代久遠(yuǎn),RS的種內(nèi)變異豐富,或者對(duì)可檢RS覆蓋面不全,又或者可檢RS株不明,使得應(yīng)用性能差。因此本研究致力于制備針對(duì)多種RS生理小種菌株特異性強(qiáng)的單克隆抗體。
近年來(lái)多種單抗制備技術(shù)如免疫蛋白制備抗體[18-19]、蛋白嵌合抗體制備[20]、轉(zhuǎn)基因技術(shù)制備抗體[21]等已被開(kāi)發(fā)應(yīng)用,但由于這些技術(shù)尚未發(fā)展成熟,而且傳統(tǒng)的單克隆抗體制備技術(shù)較成熟、操作簡(jiǎn)單,采用全菌免疫可以得到穩(wěn)定性高的特異性抗體,因此,本研究仍然選用傳統(tǒng)的單克隆抗體制備技術(shù),先是用GIM1.76以0.3%甲醛滅活后免疫4只小鼠,4次免疫后小鼠血清測(cè)效價(jià)結(jié)果分別為1∶32 000、1∶8 000、1∶4 000和1∶4 000,可能是滅活的植物菌在小鼠體內(nèi)很快被清除,不能引起持續(xù)的免疫刺激,導(dǎo)致整體免疫效果較差。于是重新選擇4只生長(zhǎng)狀態(tài)良好的小鼠免疫GIM1.76活菌,4次免疫后小鼠血清效價(jià)分別為1∶512 000、1∶512 000、1∶1 024 000和1∶1 024 000,表明活菌可以引起小鼠較強(qiáng)的免疫反應(yīng)。細(xì)胞融合并經(jīng)多次篩選后,獲得3株單克隆抗體,其中1C1和9D7能夠和實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有的4株RS特異性結(jié)合,1B3能夠與其中3株RS結(jié)合。3株抗體均與本實(shí)驗(yàn)室桑腸桿菌 JX-6、蘇云金芽胞桿菌 SYJ及實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有11株燕麥?zhǔn)人峋ㄌ厝R蘭亞種、燕麥?zhǔn)人峋鞴蟻喎N、嗜酸菌魔芋亞種、玉米細(xì)菌性條斑菌,梨火疫病菌 QB0809、XL-4,玉米細(xì)菌性枯萎病菌 QB0241、 QB0242,水稻細(xì)菌性谷枯病菌 QB0017、QB0753、 QB0755均不產(chǎn)生交叉反應(yīng)。這項(xiàng)研究對(duì)建立青枯病菌的檢測(cè)方法意義重大,為后期開(kāi)發(fā)青枯病菌檢測(cè)試劑盒或試紙條提供了前提條件,也可應(yīng)用于開(kāi)發(fā)青枯病菌免疫學(xué)檢測(cè)的其他相關(guān)技術(shù),為番茄、茄子、生姜、馬鈴薯等眾多農(nóng)產(chǎn)品青枯病的有效防治提供參考。