肖 璇， 楊偉超， 杜蓓蓓， 徐 慧*， 趙臨襄

(1.沈陽藥科大學(xué) 制藥工程學(xué)院，遼寧 本溪 117004；2.中國(guó)科學(xué)院 沈陽應(yīng)用生態(tài)研究所 污染生態(tài)與環(huán)境工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 沈陽 110016)

蟲草素(Cordycepin)，又名3′-脫氧腺苷(3′-Deoxyadenosine)，分子式為C10H13N5O3。蟲草素是蛹蟲草中的主要活性成分，也是從真菌中提取分離出來的第一個(gè)核苷類抗菌素[1]。蟲草素具有抗菌、抗病毒、干擾人體RNA和DNA合成及顯著抑制多種腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的作用[2-4]。此外，蟲草素還有免疫調(diào)節(jié)、抗炎、抗衰老、擴(kuò)張支氣管等藥理作用[5-6]。人們通常通過食用冬蟲夏草(或蛹蟲草)來達(dá)到保健及治療的目的，而作為蟲草核心功能成分的蟲草素在人體腸道中的代謝機(jī)理尚不清楚。大量研究表明，中藥中的某些化學(xué)成分可經(jīng)腸道菌群代謝或轉(zhuǎn)化，進(jìn)而形成新的活性成分被人體吸收利用。楊秀偉等[7]發(fā)現(xiàn)，羅漢果皂苷Ⅲ經(jīng)人體腸道內(nèi)細(xì)菌轉(zhuǎn)化后生成羅漢果皂苷ⅡA1和羅漢果醇，進(jìn)而在體內(nèi)體現(xiàn)出生物學(xué)活性。劉鐵漢等[8]發(fā)現(xiàn)淫羊藿苷易被腸道內(nèi)菌叢代謝。因此，推測(cè)蟲草素極有可能被腸道菌群代謝或轉(zhuǎn)化，產(chǎn)生新的化學(xué)成分進(jìn)入人體從而發(fā)揮作用。干酪乳桿菌(Lactobacilluscasei)屬于乳桿菌屬(Lactobacillus)，是一種重要的腸道益生菌。L.casei廣泛存在于食物與腸道中，因其能夠耐受有機(jī)體的防御機(jī)制，包括口腔中的酶、胃液中低pH值和小腸的膽汁酸等，所以L.casei可以在人體腸道內(nèi)大量定殖。越來越多的研究證實(shí)，乳桿菌不僅能夠調(diào)節(jié)機(jī)體胃腸道正常菌群，保持腸道微生態(tài)平衡，提高食物消化率和生物效價(jià)，還能夠抑制腸道內(nèi)腐敗菌的生長(zhǎng)繁殖和有害代謝物的產(chǎn)生[9-10]。L.casei的上述功效使得以其為主要成分制成的系列產(chǎn)品(如食品、飲料、保健品等)深受廣大消費(fèi)者青睞，市場(chǎng)需求量巨大。近年來，以蟲草與L.casei復(fù)合發(fā)酵形成的新食品與保健品相繼出現(xiàn)[11-12]，開辟了蟲草功能食品的新領(lǐng)域。然而，L.casei對(duì)蟲草素是否有代謝，代謝后的產(chǎn)物對(duì)人體健康是否有影響，是目前蟲草的生物活性機(jī)理研究和新產(chǎn)品開發(fā)過程中亟待解決的關(guān)鍵問題。為了闡明L.casei對(duì)蟲草素的生物轉(zhuǎn)化過程，本研究采用厭氧培養(yǎng)的方法對(duì)L.casei生物轉(zhuǎn)化蟲草素的過程進(jìn)行了研究，為進(jìn)一步研究腸道菌對(duì)蟲草素的生物轉(zhuǎn)化機(jī)制以及蟲草素的藥理作用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 干酪乳桿菌(Lactobacilluscasei)，保存于中國(guó)科學(xué)院沈陽應(yīng)用生態(tài)研究所環(huán)境微生物組。

1.1.2 藥品與試劑 MRS培養(yǎng)基，蟲草素(上海源葉生物，純度≥98%)。

1.1.3 儀器 隔水式恒溫培養(yǎng)箱(GNP-9080型)；厭氧袋，厭氧產(chǎn)氣包(2.5 L，海博生物)；高效液相色譜(Younglin YL9100型)；戴安半制備液相色譜儀(DIONEX UltiMate3000型)；液質(zhì)聯(lián)用儀(色譜系統(tǒng)：Thermo Accela高效液相色譜系統(tǒng)；質(zhì)譜系統(tǒng)：Thermo TSQ Quantum Access Max 三重四極桿質(zhì)譜系統(tǒng))；核磁共振波譜儀(Bruker-AV-600型)。

1.2 方法

1.2.1 乳酸菌對(duì)蟲草素的生物轉(zhuǎn)化 ①L.casei菌體制備：取干酪乳桿菌種液，按5%(體積分?jǐn)?shù)) 接種量接種至MRS液體培養(yǎng)基，37 ℃厭氧培養(yǎng)24 h。菌液于6 000 r/min離心10 min，去掉上清，菌體沉淀用無菌生理鹽水洗3次(6 000 r/min×10 min)后于4 ℃保存?zhèn)溆谩＂贚.casei對(duì)蟲草素的生物轉(zhuǎn)化：50 mg蟲草素溶解于200 mL純凈水中，終濃度為0.996 mmol/L。將2 gL.casei(活菌數(shù)為3.6×109cfu/g)菌體轉(zhuǎn)移至上述蟲草素溶液中，混勻。對(duì)照組不接入L.casei，于37 ℃厭氧培養(yǎng)72 h。定時(shí)取樣以HPLC法測(cè)定不同培養(yǎng)時(shí)間蟲草素和代謝物，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算對(duì)應(yīng)的蟲草素濃度。

1.2.2 轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的HPLC檢測(cè) 將不同培養(yǎng)時(shí)間的培養(yǎng)液分別經(jīng)0.22 μm的無菌濾膜過濾，收集濾液，用YL9100型高效液相色譜儀對(duì)代謝物進(jìn)行檢測(cè)。HPLC色譜條件：Welch Ultimate?AQ-C18, 5 μm, 4.6 mm×250 mm色譜柱，柱溫35 ℃，流動(dòng)相為8%乙腈，UV 260 nm，流速1 mL/min，進(jìn)樣量5 μL。

1.2.3 轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的LC-MS分析 利用LC-MS設(shè)備對(duì)濾液進(jìn)行檢測(cè)。①液相色譜條件：Welch Ultimate? AQ-C18，5 μm，4.6 mm×250 mm色譜柱，流動(dòng)相為8%乙腈，UV 260 nm，流速為0.8 mL/min。②質(zhì)譜條件：離子源為ESI源，噴霧電壓3 500 V，離子源溫度270 ℃，霧化氣壓30 psi，輔助氣壓10 psi，毛細(xì)管溫度320 ℃，質(zhì)量掃描范圍50.00 ～ 500.0 m/z。

1.2.4 轉(zhuǎn)化產(chǎn)物純品制備與數(shù)據(jù)分析 轉(zhuǎn)化后溶液中的新產(chǎn)物經(jīng)戴安半制備液相分離純化，凍干，-20 ℃保存。半制備液相色譜條件：YMC-Pack ODS-A，5 μm，10 mm×250 mm色譜柱，流動(dòng)相為8%乙腈，UV 260 nm，流速為2 mL/min。

1.2.5 蟲草素與轉(zhuǎn)化后產(chǎn)物的定量分析 取蟲草素標(biāo)準(zhǔn)品與轉(zhuǎn)化后新產(chǎn)物純品，分別配成0.05、0.1、0.15、0.2、0.25 mg/mL溶液，經(jīng)HPLC(色譜條件同1.2.3)進(jìn)行檢測(cè)，以峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算對(duì)應(yīng)濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 HPLC檢測(cè)與產(chǎn)物含量分析

HPLC檢測(cè)結(jié)果顯示，蟲草素標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間為8.45 min(圖1)。蟲草素經(jīng)由L.casei轉(zhuǎn)化后，在保留4.95 min時(shí)得到一個(gè)新產(chǎn)物(圖2)，標(biāo)記為CA。轉(zhuǎn)化產(chǎn)物CA經(jīng)半制備液相分離純化，得到26 mg白色粉末狀純品。通過峰面積與濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖(圖3)，擬合方程：蟲草素，Y=21 520X+34.328，R2=0.997 3；CA，Y=21 980X+24.974，R2=0.996 4。

圖1 蟲草素標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC圖譜Fig.1 HPLC chromatogram of the cordycepin

圖2 蟲草素被L. casei轉(zhuǎn)化后產(chǎn)物CA的HPLC圖譜Fig.2 HPLC chromatograms of the bio-transformed product CA

圖3 蟲草素與產(chǎn)物CA標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3 Standard curves of the cordycepin and the CAA

L.casei對(duì)蟲草素進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化的時(shí)間動(dòng)態(tài)測(cè)定，每12 h取樣一次，由HPLC法測(cè)定蟲草素和CA，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算轉(zhuǎn)化后的溶液中蟲草素和CA濃度與未添加L.casei的對(duì)照組蟲草素濃度，結(jié)果如圖4所示。隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，蟲草素含量逐漸降低，CA含量不斷上升，24～ 48 h的轉(zhuǎn)化效率最高，72 h時(shí)CA含量最高，為0.229 mg/mL(摩爾濃度為0.908 mmol/L)，此時(shí)蟲草素到CA的摩爾轉(zhuǎn)化率達(dá)91.2%，轉(zhuǎn)化過程基本完成。

2.2 L. casei對(duì)蟲草素的生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)物鑒定

產(chǎn)物CA為白色粉末，LC-MS結(jié)果：ESI-MS m/z 253[M+H]+, 275[M+Na]+; 核磁數(shù)據(jù)：1H-NMR (600 MHz, DMSO-d6) δ: 8.42 (1H, s, H-2), 8.08 (1H, s, H-8), 5.87 (1H, d,J=

圖4 轉(zhuǎn)化過程中底物與產(chǎn)物含量分析Fig.4 Measurements of the product CA and the substrate cordycepin during the bio-transformation process

1.56 Hz, H-1′), 4.50 (1H, m, H-2′), 4.37 (1H, m, H-4′), 3.70 (1H, dd,J= 3.18 Hz,J= 12.06 Hz, H-5′a), 3.53 (1H, dd,J= 3.84 Hz,J= 12 Hz, H-5′b), 2.21 (1H, m, H-3′a), 1.89 (1H, m, H-3′b);13C-NMR (600 MHz, DMSO-d6) δ: 156.5 (C-6), 147.7 (C-4), 146.1 (C-8), 138.3 (C-2), 123.8 (C-5), 91.0(C-1′), 81.3 (C-4′), 75.3 (C-2′), 62.2 (C-5′), 33.8 (C-3′)。所得核磁數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)數(shù)據(jù)基本一致[13]，故鑒定化合物CA為3′-脫氧肌苷(3′-deoxyinosine)。

綜合上述測(cè)定結(jié)果和蟲草素化學(xué)特征，推測(cè)蟲草素本身攜帶的氨基被L.casei水解為羥基，從而形成3′-脫氧肌苷的結(jié)構(gòu)(圖5)。

圖5 蟲草素的生物轉(zhuǎn)化結(jié)果Fig.5 Result of biotransformation of Cordycepin

3 討 論

研究表明，人體腸道菌群的作用與藥物發(fā)揮療效之間有著密不可分的聯(lián)系。藥物進(jìn)入胃腸道系統(tǒng)后，其有效成分部分以原型物質(zhì)直接被吸收，還有一部分經(jīng)腸道菌群代謝后生成具有藥效功能的新成分，進(jìn)而達(dá)到治療的效果[14]。蟲草素作為一種具有多重功效的核苷類抗菌素，其在人體腸道中的代謝卻鮮有相關(guān)報(bào)道。采用體外厭氧培養(yǎng)的方法，研究了腸道中數(shù)量多、被公認(rèn)為最傳統(tǒng)且最安全的益生菌—乳桿菌對(duì)蟲草素的生物轉(zhuǎn)化。結(jié)果表明，L.casei能夠?qū)⑾x草素的氨基水解為羥基，生成新的化學(xué)成分3′-脫氧肌苷。

人體的腸道菌群對(duì)藥物的生物轉(zhuǎn)化包括脫甲基[15]、脫羥基[16]、水解反應(yīng)[17]、氧化還原反應(yīng)[18-19]等。蟲草素是一種嘌呤類的生物堿，其本身攜帶的氨基易被酸或酶水解，從而轉(zhuǎn)變成新的化學(xué)結(jié)構(gòu)。藥理學(xué)研究表明，3′-脫氧肌苷是一種抗原蟲藥物。原蟲一般寄生在人或動(dòng)物的體內(nèi)，有些種類的原蟲會(huì)對(duì)人造成嚴(yán)重危害，例如瘧原蟲、利什曼蟲、克錐氏蟲等[20]。Wataya等[21]在1984年就曾發(fā)現(xiàn)3′-脫氧肌苷能夠抑制利什曼原蟲的生長(zhǎng)和繁殖，從而保護(hù)宿主。Nakajimashimada等[22]發(fā)現(xiàn)3′-脫氧肌苷在抑制克錐氏原蟲在宿主細(xì)胞內(nèi)生長(zhǎng)上有著和蟲草素(3′-脫氧腺苷)同樣的作用。由于迄今為止3′-脫氧肌苷還未曾在天然產(chǎn)物中分離出來[13]，故對(duì)3′-脫氧肌苷其他方面的藥理活性研究較少，因此蟲草素的生物轉(zhuǎn)化與3′-脫氧肌苷生物活性之間的相關(guān)性，以及在腸道內(nèi)由蟲草素轉(zhuǎn)化所得3′-脫氧肌苷的健康或醫(yī)療功效還需要進(jìn)行更為深入的研究。

本實(shí)驗(yàn)室在益生菌對(duì)蟲草素的生物轉(zhuǎn)化作用的研究中還發(fā)現(xiàn)，并非所有的益生菌均能轉(zhuǎn)化蟲草素。雙歧桿菌與糞腸球菌作為重要的腸道益生菌，并未發(fā)現(xiàn)它們對(duì)蟲草素有代謝作用。至于腸道菌群中的其他菌群對(duì)蟲草素有無轉(zhuǎn)化作用，尚需進(jìn)一步探究。