王戰(zhàn)會(huì)，李亞偉，劉少朋，張兵兵，鄭秋霞，谷留平

骨質(zhì)疏松性骨折是一種常見(jiàn)的疾病，其內(nèi)固定治療的材料主要有生物醫(yī)用高分子材料、生物醫(yī)用無(wú)機(jī)非金屬材料及生物醫(yī)用金屬材料。在金屬材料中，目前以鎂合金應(yīng)用較多，但其自身的彈性模量遠(yuǎn)高于骨組織的彈性模量，在應(yīng)力屏蔽的基礎(chǔ)上易引發(fā)再骨折[1]。再者，鎂合金在體內(nèi)腐蝕速率快，易引發(fā)應(yīng)力腐蝕斷裂(stress corrosion cracking, SCC)[2]，嚴(yán)重影響其應(yīng)用范圍。而添加其他金屬可有效改善其特性，Zn、Ca便是其中常用元素[3-4]。此外，在鎂合金表面添加涂層也可延緩其降解速率，殼聚糖即是其中之一，它不僅可增加鎂合金可塑性，還具有抗菌性[10]?；诖?，在總結(jié)已有研究成果的基礎(chǔ)上，本研究通過(guò)制備含有殼聚糖涂層的Mg-1Zn-0.3Zr-2Gd-1Ca合金，并研究其在大鼠體內(nèi)的生物相容性等特點(diǎn)，以期尋找一種更加符合骨折臨床應(yīng)用的可降解材料?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1材料試樣制備及研究：Mg、Zn、Zr、Gd、Ca元素(河南科技大學(xué)材料學(xué)院)；真空熔煉電阻爐(ZG-10，株洲鼎鑫電熱設(shè)備有限公司)；Quanta 200型掃描電鏡(西門子)；X線C臂機(jī)(飛利浦)；鎂離子檢測(cè)試劑盒(WAK-Mg，南京建成生物工程研究所)；鈣離子檢測(cè)試劑盒(K380-250-1，南京建成生物工程)；肝功能生化檢測(cè)試劑盒(上海透景生命科技股份有限公司)；腎功能生化檢測(cè)試劑盒(7170瓶型，上海透景生命科技股份有限公司)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)材料：成年雌性大白鼠(西安迪樂(lè)普公司)。

1.2方法

1.2.1殼聚糖鎂鈣合金的制備采用真空熔煉電阻爐制備Mg-1Zn-0.3Zr-2Gd-1Ca合金。①針對(duì)不同比例設(shè)定不同燒損量，配置成實(shí)驗(yàn)所需Mg-1Zn-0.3Zr-2Gd-1Ca合金，在氬氣保護(hù)下置入鎢坩堝中充分溶解，480 ℃保溫20 min，用石墨棒攪拌使金屬元素充分混合；此后精煉、扒渣并靜置處理，在真空熔煉電阻爐中將420 ℃的鎂合金溶液澆筑到預(yù)熱200 ℃的鐵坩堝中，靜置30 min后脫模，獲得鑄造態(tài)試樣。②將試室溫2 h內(nèi)升至300 ℃，恒溫保持3 h；再緩慢升溫2 h至510 ℃保溫20 h，隨后60 ℃熱水淬火。③人工時(shí)效處理：將所得固溶體從室溫加熱至150 ℃，保溫26 h，隨爐冷卻。④殼聚糖涂層制備：80%磷酸預(yù)處理合金表面2 min，自然晾干；將脫乙酰度90%，分子量為3×105的殼聚糖溶解于1%醋酸溶液中，制備成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的殼聚糖醋酸溶液，將100 μL殼聚糖醋酸溶液均勻涂抹于處理過(guò)的鎂合金正反兩面；將其放入60 ℃烘箱中干燥30 min。⑤切割、拋光：祛除試樣表面氧化層，將其切割成1.0 cm×0.5 cm×3.0 cm大??；先水磨砂紙粗磨，再采用金剛石拋光膏行機(jī)械拋光，直至試樣表面無(wú)粗磨痕跡，再在鹿皮上進(jìn)行精拋，制成所需成品。

1.2.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組取27只健康成年雌性大白鼠，體質(zhì)量(0.3±0.1) kg，同等條件下[恒溫(23±0.5) ℃，恒濕45%～50%]飼養(yǎng)4周后分別切除卵巢，建立骨質(zhì)疏松模型。待恢復(fù)良好后隨機(jī)等分為普通鎂鈣合金組(A組)、殼聚糖涂層鎂鈣合金組(B組)、假手術(shù)組(C組)，每組各9只。

1.2.3手術(shù)方法使用戊巴比妥鈉(30 mg·kg-1)經(jīng)耳緣靜脈實(shí)施麻醉，取右股骨中段手術(shù)區(qū)常規(guī)備皮、消毒、鋪無(wú)菌單，依次切開(kāi)皮膚、皮下組織、筋膜，分離肌肉組織，暴露股骨，醫(yī)用電鉆于股骨表面鉆孔后于兩孔間制作10 mm×2 mm骨缺損，模擬骨折斷面，將合金試樣置于骨缺損間，并固定良好，見(jiàn)圖1。其中假手術(shù)組僅制造骨折斷面，未放置合金材料，空白對(duì)照組未做特殊處理。術(shù)畢，過(guò)氧化氫及無(wú)菌生理鹽水沖洗術(shù)野并逐層縫合。

圖1 術(shù)中固定合金試樣

1.2.4術(shù)后處理措施及觀察指標(biāo)標(biāo)簽分別注明手術(shù)時(shí)間、合金類型。術(shù)后動(dòng)物自由活動(dòng)，分籠常規(guī)飼養(yǎng)。術(shù)后1周連續(xù)肌注慶大霉素每日40萬(wàn)U，預(yù)防感染。分別于術(shù)后7、14、21 d分批(每次3只)隨機(jī)處死各組大鼠并取出合金組織，以備后續(xù)研究。觀察各組大鼠術(shù)后精神狀態(tài)，活動(dòng)、飲食狀況、傷口愈合情況。對(duì)所取材料行掃描電子顯微鏡(scanning electron microscope, SEM)觀察了解合金降解情況。術(shù)后不同時(shí)間化驗(yàn)各組鼠肝功能(谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、堿性磷酸酶)；腎功能血清尿素氮(serum urea nitrogen,BUN)；肌酐(creatinine,Cre)；尿酸了解合金的生物學(xué)毒性，并檢測(cè)血清中鎂離子、鈣離子濃度。

2 結(jié)果

2.1術(shù)后一般情況各組大鼠術(shù)后生命體征平穩(wěn)，精神狀態(tài)、進(jìn)食狀況未受明顯影響。A、B組大鼠術(shù)后肢體活動(dòng)正常，C組大鼠術(shù)后右下肢功能短期內(nèi)受明顯影響。觀察期內(nèi)均未發(fā)生切口感染、皮下氣腫，亦無(wú)死亡事件發(fā)生。

2.2術(shù)后掃描電鏡觀察SEM檢測(cè)示，術(shù)后7 d時(shí)，A組試樣表面片狀腐蝕明顯，局部腐蝕產(chǎn)物脫落，B組植入物表面可見(jiàn)腐蝕產(chǎn)物聚集，但整體完整。術(shù)后14 d時(shí)，A組試樣腐蝕進(jìn)一步加重，且不均勻，表面凸凹不平，結(jié)構(gòu)缺損明顯，可見(jiàn)大量裂紋產(chǎn)生，但B組試樣表面僅見(jiàn)少量淺裂紋，且結(jié)構(gòu)完整。術(shù)后21 d時(shí)，A組試樣結(jié)構(gòu)破壞明顯，裂紋加深且寬大，而B(niǎo)組試樣表面裂紋雖有增多，但仍較A組明顯偏少，且整體結(jié)構(gòu)完好，見(jiàn)圖2。

2.3生物學(xué)毒性檢測(cè)

2.3.1手術(shù)前后各組大鼠血清鎂離子、鈣離子濃度變化情況術(shù)前1 d A、B、C組大鼠血清鎂離子濃度

分別為(1.23±0.23) mol·L-1、(1.19±0.51) mol·L-1、(1.22±0.10) mol·L-1、(1.18±0.47) mol·L-1。術(shù)后A、B組2周內(nèi)鎂離子濃度增高，且以A組變化更明顯，兩組均在3周時(shí)降至正常，但術(shù)前、術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)鎂離子變化無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，各組間差異亦無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。鈣離子濃度變化與此類似，見(jiàn)圖3。

A組：普通鎂鈣合金組；B組：殼聚糖涂層鎂鈣合金組。圖2 術(shù)后不同時(shí)間兩組合金試樣表面腐蝕情況(SEM，×200)

圖3 手術(shù)前后不同時(shí)間各組大鼠血清鎂離子、鈣離子濃度變化(n=27)

2.3.2手術(shù)前后各組鼠外周血肝、腎功能變化情況術(shù)后A、B、C組轉(zhuǎn)氨酶較前稍升高，此后逐漸降至正常，但術(shù)前、術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)肝功能各指標(biāo)變化組內(nèi)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，各組間差異亦無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。腎功能各指標(biāo)變化亦如此，見(jiàn)圖4。

3 討論

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis, OP)是一種由多因素作用的疾病，其病機(jī)尚未完全明確，但由其引發(fā)的骨折卻極大地危害著人體健康。近年來(lái)，不斷完善的骨折內(nèi)固定材料廣泛應(yīng)用于骨折治療，但部分骨折內(nèi)固定材料因生物相容性差、力學(xué)性能欠佳、排斥反應(yīng)大等缺陷，而使其適用性受限[5-6]。此后，更多學(xué)者嘗試不斷完善鎂合金的相關(guān)研究，將Al、Mn等多種元素加入其中，并取得一定效果，但仍不能完全避免其降解速率快、體內(nèi)產(chǎn)氣多的缺陷[7-8]。目前有報(bào)道試圖通過(guò)在鎂合金表面添加涂層的方法延緩其降解速率，而殼聚糖便是其中之一[9]。殼聚糖是目前發(fā)現(xiàn)的唯一堿性氨基多糖，其結(jié)構(gòu)經(jīng)過(guò)一定修飾后可得到具有良好抗菌性、生物相容性、可塑性及無(wú)毒性特點(diǎn)的材料，進(jìn)而被應(yīng)用于骨折內(nèi)固定[10]?；谝陨弦蛩兀⒔Y(jié)合國(guó)內(nèi)外相關(guān)研究，作者制作出含有殼聚糖涂層的Mg-1Zn-0.3Zr-2Gd-1Ca合金，并探究其在動(dòng)物體內(nèi)的生物相容性，以期為后續(xù)研究提供一定參考。

本研究中，各組鼠術(shù)后恢復(fù)順利，未出現(xiàn)切口感染、皮下氣腫等相關(guān)并發(fā)癥，植入物與鼠體內(nèi)組織保持良好相容性，這與Kim的報(bào)道類似[11]。Seitz等[12]研究發(fā)現(xiàn)，未添加涂層的普通鎂鈣合金在體內(nèi)降解速率快而難以在骨折內(nèi)固定中達(dá)到良好效果。本研究中術(shù)后7 d時(shí)，A組合金表面出現(xiàn)明顯的片狀腐蝕區(qū)，局部腐蝕產(chǎn)物脫落，而B(niǎo)組整體結(jié)構(gòu)完整。術(shù)后14 d時(shí)，A組試樣腐蝕進(jìn)一步加重，且不均勻，表面凸凹不平，結(jié)構(gòu)缺損明顯，可見(jiàn)大量裂紋產(chǎn)生，但B組合金因含有殼聚糖涂層，降解速率較慢，僅見(jiàn)少量裂紋，且深度較淺。至術(shù)后21 d時(shí)，A組試樣結(jié)構(gòu)破壞明顯，裂紋寬大且深，但B組仍保持較為完整的結(jié)構(gòu)。這提示殼聚糖鎂鈣合金較普通鎂鈣合金降解速率慢，更接近骨折愈合過(guò)程，顯示出良好的生物相容性。兩組相比較，術(shù)后相同時(shí)間內(nèi)，普通鎂鈣合金表面由點(diǎn)腐蝕較快變?yōu)槊娓g，腐蝕速率顯著高于殼聚糖涂層組，作者預(yù)測(cè)殼聚糖涂層在降解過(guò)程中可能起到了保護(hù)膜作用，進(jìn)而延緩了鎂鈣合金的降解[13]。

在關(guān)于生物學(xué)毒性的檢測(cè)中，術(shù)后各組鼠不同時(shí)間雖然轉(zhuǎn)氨酶都有不同程度的增高，但均在可控范圍，且隨著術(shù)后時(shí)間的延長(zhǎng)，各組鼠轉(zhuǎn)氨酶均逐漸降至正常范圍，未對(duì)術(shù)后鼠的恢復(fù)造成明顯影響。手術(shù)前后各組鼠肝功能各項(xiàng)指標(biāo)變化均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，腎功能指標(biāo)變化情況與肝功能相類似，這與姜冬梅的研究結(jié)果一致[14]。在離子濃度檢測(cè)中，術(shù)后雖然A、B組血清鎂、鈣離子在2周內(nèi)有所升高，且以A組變化明顯，但各組鼠均為輕微升高，此后均逐漸降至正常，并未出現(xiàn)高血鎂或高血鈣等并發(fā)癥，說(shuō)明鎂、鈣離子濃度的變化均在實(shí)驗(yàn)鼠可承受范圍內(nèi)，并未對(duì)鼠的術(shù)后恢復(fù)造成明顯影響。這提示鎂鈣合金的降解是安全的，降解后產(chǎn)生的鎂、鈣離子可及時(shí)被機(jī)體代謝，初步展現(xiàn)出良好的生物相容性，這與目前已有研究結(jié)果相一致[15-18]。此外，手術(shù)前后各組鼠血清鎂離子變化無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，結(jié)合本研究中術(shù)后掃描電鏡的研究結(jié)果，雖然普通鎂鈣合金相較于殼聚糖涂層的鎂鈣合金降解速率快，但兩者的降解產(chǎn)物均未對(duì)大鼠正常的機(jī)體內(nèi)環(huán)境及電解質(zhì)水平造成明顯影響，生物毒性小，安全性較高。

綜上所述，作者設(shè)計(jì)的Mg-1Zn-0.3Zr-2Gd-1Ca合金具有良好的生物相容性，安全性高，添加殼聚糖涂層后延緩了其降解速率，初步展現(xiàn)出一定的臨床應(yīng)用價(jià)值。但本研究觀察周期短、實(shí)驗(yàn)樣本少，尤其是在此合金降解后產(chǎn)物成分及量的分析，術(shù)后不同時(shí)間合金對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物心臟、肝臟、腎臟等臟器的影響等方面，仍需更加微觀細(xì)致的長(zhǎng)期研究。