寇艷波，劉慶亞，張 波，湯仁仙，王玉剛

肥胖已成為全球流行性疾病，其伴隨的各種并發(fā)癥嚴重威脅著人類的身心健康[1-2]。肥胖發(fā)生的最直接原因就是能量物質(zhì)的攝入大于機體的消耗。能量物質(zhì)儲存于脂肪細胞內(nèi)，造成脂肪細胞肥大和增生，引發(fā)肥胖[3]。哺乳動物脂肪細胞主要分為3類：白色脂肪細胞、棕色脂肪細胞和米黃色脂肪細胞[4]。白色脂肪細胞通過胞內(nèi)單一的大脂滴儲存甘油三酯。棕色脂肪細胞通過解耦聯(lián)蛋白-1(uncoupling protein 1,Ucp1)將化學能轉(zhuǎn)變?yōu)闊崮躘5]。米黃色脂肪細胞可以多個小脂滴的形式儲存能源物質(zhì)，又能夠高水平表達UCP1[6-7]。

米黃色脂肪和棕色脂肪能有效抵抗高脂飲食引起的肥胖[8-9]。由于棕色脂肪只存在于嬰兒期，而米黃色脂肪伴隨整個生命過程，因此，越來越多的研究者們提出促進米黃色脂肪的形成將是防治肥胖的有效手段[10]。本研究旨在建立穩(wěn)定的脂肪前體細胞向米黃色脂肪細胞分化的方法，并從整體水平檢測脂肪前體細胞和米黃色脂肪細胞基因表達的差異，為進一步揭示米黃色脂肪細胞形成的調(diào)控機制打下基礎。現(xiàn)報道如下。

1 材料和方法

1.1材料小鼠脂肪前體細胞系3T3-L1購自武漢大學細胞保藏中心，細胞誘導分化試劑包括IBMX(3-異丁基-1-甲基黃嘌呤)、地塞米松、吲哚美辛、羅格列酮、三碘代-L-甲狀腺原氨酸購自Sigma，小鼠胰島素購自Peprotech。油紅染料購自Sigma，Ucp1、過氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferator-activated receptor gamma, Pparγ)、PR結(jié)構(gòu)域蛋白16 (PR domain containing 16, Prdm16)抗體購自Abcam，內(nèi)參β-Actin抗體購自Abclonal。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng)小鼠脂肪前體細胞系3T3-L1培養(yǎng)選用DMEM(Dulbecco’s Modified Eagle Medium)高糖培養(yǎng)基，培養(yǎng)過程中添加10%胎牛血清以及100 U·mL-1的青霉素和0.1 mg·mL-1的鏈霉素。

1.2.2脂肪前體細胞系誘導分化培養(yǎng)小鼠脂肪前體細胞3T3-L1至細胞匯合，更換新鮮培養(yǎng)基后繼續(xù)培養(yǎng)48 h使細胞接觸抑制。48 h后用無菌的PBS將細胞充分洗滌，換用新的含有米黃色脂肪細胞分化混合液(2 mg·L-1地塞米松、0.5 mM IBMX、1 μM羅格列酮、1 nM三碘代-L-甲狀腺原氨酸、125 μM吲哚美辛、5 mg·L-1胰島素)的培養(yǎng)基再次培養(yǎng)48 h，誘導分化。最后換用含有5 mg·L-1胰島素，1 μM羅格列酮，1 nM三碘代-L-甲狀腺原氨酸的新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)細胞并隔日換液，于第8天左右完成脂肪前體細胞向米黃色脂肪細胞的分化。

1.2.3油紅染色用異丙醇配制質(zhì)量分數(shù)為0.5%的油紅母液(現(xiàn)用現(xiàn)配)，溶液經(jīng)濾紙過濾后，按照6(油紅母液)∶4(水)的比例進行稀釋，獲得油紅染色工作液。分化成熟的脂肪細胞經(jīng)PBS洗滌2遍后，加入質(zhì)量分數(shù)為4%的多聚甲醛固定10 min。固定后的細胞經(jīng)PBS漂洗后加入體積分數(shù)為60%的異丙醇浸洗2 min。棄掉異丙醇后，加入油紅工作液染色15 min。棄掉油紅染液后，細胞用體積分數(shù)為60%的異丙醇再次洗滌至背景基本無色。顯微鏡觀察脂滴形成情況。

1.2.4熒光定量PCR收集分化前和分化后的3T3-L1細胞，提取RNA，取總RNA 1 μg進行逆轉(zhuǎn)錄獲得總cDNA，以不同組的cDNA為模板利用Roche Light Cycler 480熒光定量PCR儀檢測米黃色脂肪細胞標志性基因的轉(zhuǎn)錄情況，內(nèi)參為β-actin。引物序列如下：β-actin：5′ CGTTGACATCCGTAAAGACC 3′ 和5′ AACAGTCCGCCTAGAAGCA 3′；Ucp1：5′ AGA-GGTCGTGAAGGTCAGAATG 3′和5′ TGACATTTC-TCATTAGATTAGGGGT 3′；Pparγ：5′ TTCAAGGG-TGCCAGTTTCG 3′和5′ CCATCTTTATTCATCAG-GGAGG 3′；Prdm16：5′ GAGATGCTGACGGATACA-GAGGT 3′和5′ GGCGAGGTTTTGGTCATCAC 3′。

1.2.5Westernblot細胞經(jīng)含有蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液裂解后，測定蛋白濃度。每孔上樣總蛋白30 μg進行SDS-PAGE，轉(zhuǎn)印至PVDF膜后用質(zhì)量分數(shù)為5%的脫脂奶粉室溫封閉2 h，用Ucp1、Pparγ、Prdm16一抗4 ℃孵育過夜，洗滌后二抗孵育1 h再次洗滌后分別檢測目的蛋白存在。

2 結(jié)果

2.1脂肪前體細胞向米黃色脂肪細胞分化方法的建立生長至匯合的3T3-L1細胞，經(jīng)48 h的接觸抑制后，更換含有米黃色脂肪細胞分化混合液的新鮮培養(yǎng)基誘導分化48 h。誘導分化完成后，經(jīng)胰島素、羅格列酮和三碘代-L-甲狀腺原氨酸維持分化4 d，顯微鏡觀察脂滴形成情況。3T3-L1分化前為典型的成纖維狀，細胞輪廓清楚，多為突起的紡錘形或星形的扁平狀結(jié)構(gòu)；分化后細胞體積明顯增大，呈圓形或橢圓形，且細胞內(nèi)有多個清亮的小脂滴存在，見圖1A。為進一步評價細胞的分化效率，進行了油紅染色，結(jié)果顯示分化后絕大多數(shù)細胞(>90%)均呈油紅染色陽性，表明絕大多數(shù)細胞已完成分化，見圖1B。

2.2米黃色脂肪細胞的確定由于白色脂肪細胞內(nèi)也含有大量脂滴，因此油紅染色并不能完全確定分化后的脂肪細胞即為米黃色脂肪細胞。白色脂肪細胞和米黃色脂肪細胞的形成均受轉(zhuǎn)錄因子Pparγ的調(diào)控[11]，但是白色脂肪細胞和米黃色脂肪細胞在基因表達上呈現(xiàn)出很大的差異，米黃色脂肪細胞以高表達Ucp1和Prdm16為標志。因此，接下來檢測分化后細胞中Ucp1、Pparγ和Prdm16的表達。如圖2A所示，分化過程中米黃色脂肪細胞標志性基因Ucp1、Pparγ和Prdm16轉(zhuǎn)錄均明顯上調(diào)；與之相對應的是，western blot結(jié)果顯示分化后的細胞與未分化細胞相比，Ucp1、Pparγ和Prdm16蛋白水平也呈現(xiàn)多倍的增加(圖2B)。通過本方法誘導分化的脂肪細胞高表達米黃色脂肪細胞標志蛋白，表明分化后的細胞為米黃色脂肪細胞。

A、B：未染色脂肪前體細胞和分化后脂肪細胞；C、D：油紅染色后脂肪前體細胞和分化后脂肪細胞。圖1 分化后脂肪細胞形態(tài)觀察及脂滴形成驗證

A：熒光定量PCR檢測分化前后的脂肪細胞中Ucp1、Pparγ、Prdm16的轉(zhuǎn)錄； B：Western blot檢測分化前后Ucp1、Pparγ、Prdm16蛋白表達。圖2 米黃色脂肪細胞標志蛋白表達的檢測

2.3米黃色脂肪細胞與脂肪前體細胞基因表達差異分析為進一步研究米黃色脂肪細胞形成的調(diào)控機制，對脂肪前體細胞3T3-L1和分化后的米黃色脂肪細胞進行了轉(zhuǎn)錄測序分析。數(shù)據(jù)分析時分為兩組，分別是未分化的3T3-L1和分化成熟的米黃色脂肪細胞，每組3個平行。DEG(different expression genes)統(tǒng)計結(jié)果如圖3A所示，分化前和分化后的3T3-L1基因表達情況出現(xiàn)明顯的差異；其中分化前與分化后相比，1 993個基因發(fā)生了明顯的上調(diào)，1 538個基因明顯下調(diào)表達，13 771個基因沒有明顯的上下調(diào)變化。進一步分析表明，這些差異表達基因與細胞代謝密切相關(guān)；生物信息學分析表明，這些基因編碼的蛋白參與了脂類代謝、氨基酸代謝、碳源代謝以及TCA循環(huán)等(圖3B)。這說明米黃色脂肪細胞與脂肪前體細胞代謝上存在明顯差異，也再次表明本實驗中采用的誘導方法，可以使脂肪前體細胞分化為米黃色脂肪細胞。

A：差異表達基因的Volcano-plot分布圖；B：差異表達基因KEGG pathway分析。圖3 分化前后3T3-L1差異基因分析

3 討論

肥胖伴隨的各種并發(fā)癥，如Ⅱ型糖尿病、心血管疾病，甚至腫瘤，嚴重影響著人類健康[12-14]。研究肥胖發(fā)生發(fā)展的分子機制對預防和治療肥胖及其并發(fā)癥的發(fā)生將具有重要意義。

機體中棕色脂肪細胞和米黃色脂肪細胞均可高表達解耦連蛋白Ucp1，能夠?qū)⒒瘜W能轉(zhuǎn)變成熱能耗散掉，增加機體棕色脂肪和米黃色脂肪比例理論上能夠增加能量消耗，減少能源物質(zhì)堆積，防止肥胖發(fā)生。由于人體中棕色脂肪只存在于嬰幼兒時期，而米黃色脂肪伴隨終生，因此本研究通過地塞米松、IBMX、羅格列酮、三碘代-L-甲狀腺原氨酸、吲哚美辛和胰島素誘導分化以及羅格列酮、三碘代-L-甲狀腺原氨酸和胰島素的維持分化，最終可將脂肪前體細胞誘導分化為成熟的米黃色脂肪細胞。油紅染色結(jié)果表明，分化成熟的米黃色脂肪細胞中含有多個小脂滴，這與已有的研究報道結(jié)果一致[15]。熒光定量PCR和Western blot檢測結(jié)果表明，分化后的細胞中米黃色脂肪細胞標志蛋白Ucp1、Pparγ和Prdm16的表達相比于未分化的脂肪前體細胞明顯上調(diào)，表明此法可以將脂肪前體細胞誘導分化為米黃色脂肪細胞。

米黃色脂肪細胞主要存在于白色脂肪組織中，與白色脂肪細胞來源相同，它們的分化均受Pparγ調(diào)控，成熟的米黃色脂肪細胞和白色脂肪細胞胞內(nèi)都含有脂滴。本研究中，判斷分化成熟的脂肪細胞是否是米黃色脂肪細胞時，不僅觀察了脂滴的存在形式和Pparγ的表達，同時也檢測了米黃色脂肪細胞功能蛋白Ucp1和關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子Prdm16的表達。在觀察到胞內(nèi)存在多個小脂滴且Ucp1、Pparγ、Prdm16表達均顯著上調(diào)的情況下，判定分化后的脂肪細胞為米黃色脂肪細胞。

3T3-L1細胞系經(jīng)誘導分化為米黃色脂肪細胞后，整體基因表達發(fā)生非常明顯的變化。首先，其基礎代謝狀態(tài)發(fā)生改變，KEGG pathway分析表明參與脂肪酸合成和降解代謝的基因出現(xiàn)明顯的富集，表明分化后的脂肪酸的合成和降解均比較活躍，這是脂肪細胞基本的代謝特征[16]。此外，氨基酸代謝，如丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸以及碳源的代謝也呈現(xiàn)明顯富集。值得注意的是，Ppar信號途徑在米黃色脂肪細胞分化的過程中也出現(xiàn)明顯的富集，這與文獻報道一致，說明本研究中建立的米黃色脂肪細胞分化方法是成功的。差異表達基因中除包括上述參與各種代謝的基因外，還有許多轉(zhuǎn)錄因子也呈現(xiàn)不同程度的上調(diào)或下調(diào)，如zf-C2H2、Homeobox、ARID、COE、RHD等家族的轉(zhuǎn)錄因子。這些轉(zhuǎn)錄因子的上下調(diào)將從基因表達調(diào)控的層面激活米黃色脂肪細胞代謝及行使功能所需的基因，并抑制與米黃色脂肪細胞無關(guān)基因的表達。

米黃色脂肪能夠高表達Ucp1，將機體積累的能源物質(zhì)轉(zhuǎn)變?yōu)闊崮?，是機體重要的代謝調(diào)控者，通過人為干預，控制機體中米黃色脂肪細胞的含量，來調(diào)節(jié)體內(nèi)的能源物質(zhì)水平，特別是脂類的含量，將是改善肥胖所致的代謝紊亂及引起的各種并發(fā)癥的有效手段。但是由于目前人們對米黃色脂肪細胞形成的過程和機制認識尚淺，因此以米黃色脂肪細胞為靶點的防治肥胖的手段尚未建立。本研究建立了體外誘導脂肪前體細胞向米黃色脂肪細胞分化的方法，并對未分化和分化后的細胞進行了初步的轉(zhuǎn)錄測序分析，更深入的分析及機制研究將揭示米黃色脂肪細胞形成的機制，也將為以米黃色脂肪細胞為靶點的防治肥胖藥物的開發(fā)研究提供理論依據(jù)。