尹國(guó)麗，蔡卓山，陶茸，吳芳，陳建綱，師尚禮

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院，草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中-美草地畜牧業(yè)可持續(xù)研究中心，甘肅 蘭州 730070)

紫花苜蓿(Medicagosativa)具有優(yōu)良的飼用價(jià)值和固氮、保持水土、改良土壤結(jié)構(gòu)等多重生態(tài)功能，在世界五大洲廣泛種植，素有“牧草之王”的美稱[1]，隨著農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展戰(zhàn)略和糧改飼工程的實(shí)施，紫花苜蓿的重要性日益凸顯。但是，作為多年生牧草，紫花苜蓿連作一定年限后會(huì)產(chǎn)生連作障礙，成為限制紫花苜蓿種植的一個(gè)瓶頸問(wèn)題。研究證實(shí)，連作障礙的發(fā)生不僅與土壤理化性質(zhì)的改變有關(guān)，還與土壤微生物的組成有關(guān)[2]，土壤微生物作為土壤中的活性因子，是反應(yīng)土壤質(zhì)量最敏感的指標(biāo)之一，近年來(lái)已有大量的研究表明土壤微生物與連作障礙之間存在密切關(guān)系[3-5]。除此而外，作物的自毒作用也是引起連作障礙一個(gè)不容忽視的方面[6]。紫花苜蓿種子中含有水溶性自毒物質(zhì)[7]，植株分泌自毒物質(zhì)，經(jīng)過(guò)多年連續(xù)種植后的累積，會(huì)產(chǎn)生自毒現(xiàn)象，導(dǎo)致土壤養(yǎng)分過(guò)度積累或消耗、自毒物質(zhì)積累、苜蓿產(chǎn)量品質(zhì)下降等。

草田輪作是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中消減連作障礙普遍采用的措施之一，試驗(yàn)證明輪作不僅可以調(diào)節(jié)不同作物之間對(duì)養(yǎng)分吸收的差異，避免養(yǎng)分失衡，提高土壤養(yǎng)分的有效性和酶活性，還可以通過(guò)根系分泌物的變化，調(diào)節(jié)根際微生物群落的組成，減少土傳病蟲(chóng)害的發(fā)生，同時(shí)利用不同作物對(duì)自毒物質(zhì)的反應(yīng)不同，可減輕自毒危害，提高經(jīng)濟(jì)效益[8]。王勁松等[9]研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)高粱(Sorghumbicolor)連作3年地輪作苜蓿和蔥(Alliumfistulosum)，可以提高土壤微生物活性和酶活性，控制高粱的連作障礙，增加高粱產(chǎn)量。秦舒浩等[10]研究得出合理輪作天藍(lán)苜蓿(Medicagolupulina)、隴東苜蓿(Medicagosativa)和箭筈豌豆(Viciasativa)3種豆科植物，對(duì)馬鈴薯(Solanumtuberosum)連作農(nóng)田土壤速效氮、速效磷及速效鉀含量均有不同程度的促進(jìn)作用。

科學(xué)合理的輪作模式可以有效緩解連作障礙引起的土壤環(huán)境惡化，使土壤中微生物活性增強(qiáng)、多樣性增加，為后續(xù)作物生長(zhǎng)提供健康穩(wěn)定的土壤生態(tài)環(huán)境[11]。目前關(guān)于紫花苜蓿草田輪作的研究報(bào)道相對(duì)較多，但前人的研究多集中在輪作對(duì)農(nóng)田土壤肥力及產(chǎn)量的影響方面，缺乏紫花苜蓿-作物輪作系統(tǒng)中土壤自毒物質(zhì)含量方面的研究報(bào)道[12]。鑒于此，本試驗(yàn)以5齡紫花苜蓿草地為研究材料，分析在不同輪作模式下土壤自毒物質(zhì)含量、土壤肥力及土壤微生物的動(dòng)態(tài)變化及其相互關(guān)系，旨在探索紫花苜蓿連作障礙的形成機(jī)制，為采用輪作措施消減紫花苜蓿連作土壤自毒效應(yīng)提供科學(xué)依據(jù)，并為半干旱地區(qū)草田輪作和草地生態(tài)農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地概況

試驗(yàn)在甘肅省武威市涼州區(qū)甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)黃羊鎮(zhèn)牧草實(shí)驗(yàn)站開(kāi)展。該地區(qū)位于甘肅河西走廊東端(E 103°5′，N 37°30′)，屬冷溫帶干旱區(qū)，是典型的大陸性氣候，日照充足，春季多風(fēng)沙，夏季有干熱風(fēng)。平均海拔1776 m，降水年際變化不大，但季節(jié)變化較大，多年平均降水量160 mm，主要集中在7、8、9三個(gè)月，冬春季干旱，降水無(wú)法滿足作物生長(zhǎng)的需要。年蒸發(fā)量2400 mm，年平均氣溫7.2 ℃，1月最低氣溫 -27.7 ℃，7月最高氣溫34.0 ℃，≥0 ℃年積溫3513.4 ℃，≥10 ℃年積溫2985.4 ℃。全年無(wú)霜期156 d，絕對(duì)無(wú)霜期118 d，年日照時(shí)數(shù)2945 h。土壤以荒漠灌淤土為主，粉沙壤質(zhì)，土層深厚。

1.2 供試材料

供試材料小麥(Triticumaestivum)品種為雜交種春寧4號(hào)，玉米(Zeamays)品種為雜交種隴單4號(hào)，紫花苜蓿品種為甘農(nóng)3號(hào)。小麥及玉米種子市售，紫花苜蓿種子由甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院提供。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)地位于甘肅省武威市黃羊鎮(zhèn)甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)牧草實(shí)驗(yàn)站。選取地勢(shì)平坦的紫花苜蓿草地進(jìn)行草田輪作試驗(yàn)。設(shè)計(jì)如表1所示5個(gè)處理。試驗(yàn)小區(qū)面積為4 m×5 m，不同小區(qū)間設(shè)1 m隔離帶，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，不同小區(qū)的土壤肥力狀況及管理方式相同。

1.4 土樣采集

于2017年7月中旬采集土壤樣品，處理按照“5點(diǎn)取樣法”，用土鉆分別取0～30 cm土層土樣，將所得土壤樣品裝入無(wú)菌塑料袋，做好標(biāo)簽。除去雜質(zhì)，均勻混合后，過(guò)1 mm篩，分為3份，一份帶回實(shí)驗(yàn)室立即測(cè)定土壤酚酸類自毒物質(zhì)和香豆素的含量，一份用于測(cè)定土壤肥力，一份土壤-4 ℃保存，用于測(cè)定土壤微生物。

表1 紫花苜蓿-玉米/小麥不同輪作處理 Table 1 The different treatments of alfalfa-crop/wheat rotation

1.5 試驗(yàn)方法

1.5.1土壤化學(xué)性質(zhì)測(cè)定 采用重鉻酸鉀法測(cè)定土壤有機(jī)質(zhì)含量；采用凱氏定氮法測(cè)定土壤全氮含量；采用堿解擴(kuò)散法測(cè)定土壤堿解氮含量；采用火焰光度法測(cè)定全鉀含量；先用醋酸銨浸提，再用火焰光度法測(cè)定土壤有效鉀含量；采用HClO4-H2SO4消煮法測(cè)定全磷含量；采用碳酸氫鈉浸提-鋁銻抗比色法測(cè)定有效磷含量[13]。

1.5.2土壤微生物測(cè)定 土壤微生物采用選擇性培養(yǎng)基涂布篩選法：細(xì)菌用牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基，真菌用馬丁-孟加拉紅培養(yǎng)基，放線菌用改良高氏一號(hào)培養(yǎng)基，將土壤懸浮液按倍數(shù)(真菌10-3～10-1、放線菌10-5～10-3、細(xì)菌 10-6～10-4) 稀釋涂平板后置于28 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(細(xì)菌2～3 d、真菌4～5 d、放線菌5～7 d)后計(jì)數(shù)，3次重復(fù)[14-15]。

1.5.3土壤中酚酸類自毒物質(zhì)測(cè)定方法 采用高效液相色譜(HPLC)法測(cè)定土壤中酚酸類自毒物質(zhì)，對(duì)土壤中各酚酸和香豆素含量進(jìn)行定性定量分析，待檢測(cè)的酚酸包括綠原酸、阿魏酸、咖啡酸、對(duì)羥基苯甲酸，香豆素。分析條件如下：高效液相色譜儀(Agilent 1100)，色譜柱(C18，PN 959990-902，5 μm，4.6 mm×250.0 mm)，流動(dòng)相A：甲醇[16]。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

采用Microsoft Excel 2013軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和作圖；用SPSS 24.0進(jìn)行單因素方差分析(One-way ANOVA)，采用最小顯著差異法(LSD)比較數(shù)據(jù)組間的差異，用Person相關(guān)系數(shù)評(píng)價(jià)不同因子間的相關(guān)性。用SPSS 24.0統(tǒng)計(jì)軟件完成相關(guān)關(guān)系分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同輪作處理對(duì)土壤養(yǎng)分的影響

紫花苜蓿輪作玉米和小麥后，土壤養(yǎng)分含量與CK相比均有不同程度的下降(表2)。輪作1年后，AC和AW的土壤有機(jī)質(zhì)含量均顯著低于CK(P<0.05)，較CK降低了17.29%和19.85%；AC的土壤全氮含量較CK顯著減少了14.76%(P<0.05)；土壤全磷、全鉀、速效鉀含量在不同輪作處理之間差異不顯著(P>0.05)；AC和AW土壤堿解氮含量比CK顯著下降 23.82%和10.27%、速效磷顯著降低 14.05%、8.04%(P<0.05)，兩處理之間差異顯著。輪作第2年，土壤養(yǎng)分消耗持續(xù)增加，土壤養(yǎng)分含量持續(xù)下降，和輪作第1年的變化趨勢(shì)相近，輪作玉米對(duì)土壤有機(jī)質(zhì)、全氮、堿解氮、速效磷的消耗量和輪作小麥相比顯著增多(P<0.05)。ACC和AWW的有機(jī)質(zhì)含量較CK顯著降低了23.13%，26.23%(P<0.05)；ACC的全氮、全磷含量顯著低于CK(P<0.05)，較CK分別降低了18.52%，35.61%；和CK相比，AWW的全氮含量顯著減少了14.81%(P<0.05)；ACC和AWW土壤堿解氮含量比CK顯著下降 31.03%和42.55%、速效磷顯著降低8.93%、10.10%(P<0.05)。

表2 不同輪作處理?xiàng)l件下的土壤養(yǎng)分含量 Table 2 Contents of soil nutrients under the different grass-crop rotation treatments

注：同列不同字母表示處理間差異顯著(P<0.05)，下同。

Note:Different letters in the same column meant significant difference among treatments at 0.05 level, the same below.

2.2 不同輪作處理對(duì)土壤微生物的影響

紫花苜蓿與玉米、小麥輪作后土壤中微生物數(shù)量的變化如圖1所示，不同輪作處理顯著提高了土壤細(xì)菌的數(shù)量(P<0.05)，AC、ACC、AW、AWW比CK顯著增加了34.75%、42.62%、69.00%、138.00%，輪作后土壤細(xì)菌數(shù)量增量大小順序?yàn)锳WW>AW>ACC>AC。紫花苜蓿輪作玉米、小麥后土壤真菌數(shù)量顯著降低(P<0.05)，AC、ACC、AW、AWW顯著低于CK，分別降低了48.96%、65.19%、66.72%、74.91%，而AW的土壤真菌數(shù)量與ACC之間差異不顯著(P>0.05)。放線菌數(shù)量的變化趨勢(shì)和細(xì)菌相同，AC、ACC、AW、AWW的土壤放線菌數(shù)量比CK顯著增加了3.90%、13.38%、217.30%、314.32%(P<0.05)。

2.3 不同輪作處理對(duì)土壤酚類自毒物質(zhì)的影響

不同輪作處理下土壤酚酸類物質(zhì)和香豆素含量如圖2所示，不同輪作處理下土壤自毒物質(zhì)總含量顯著低于CK(P<0.05)，AC、ACC、AW、AWW較CK分別降低了10.76%、25.23%、17.49%、37.46%，表明輪作小麥對(duì)酚類自毒物質(zhì)的降解作用比輪作玉米大。輪作1年后，AC土壤中的阿魏酸變化不明顯，綠原酸、咖啡酸、對(duì)羥基苯甲酸和香豆素含量比CK顯著下降(P<0.05)，AW土壤中對(duì)羥基苯甲酸和香豆素含量顯著低于AC(P<0.05)，其他自毒物質(zhì)與CK相比差異不顯著(P>0.05)，說(shuō)明紫花苜蓿與玉米、小麥輪作1年能夠減少土壤中自毒物質(zhì)的含量，對(duì)羥基苯甲酸和香豆素的含量變化體現(xiàn)出輪作小麥比輪作玉米對(duì)土壤自毒物質(zhì)的降解作用更大。輪作第2年，輪作土壤中的自毒物質(zhì)含量均顯著低于CK(P<0.05)，且低于第1年輪作處理，說(shuō)明輪作第2年對(duì)自毒物質(zhì)的消減效果更強(qiáng)，除了阿魏酸、咖啡酸，AWW的其他自毒物質(zhì)(綠原酸、對(duì)羥基苯甲酸、香豆素)含量均顯著低于ACC(P<0.05)，分別較ACC降低了19.62%、33.33%、12.50%。

2.4 土壤養(yǎng)分、土壤微生物數(shù)量和土壤自毒物質(zhì)之間的相關(guān)性分析

2.4.1土壤養(yǎng)分與土壤微生物之間的相關(guān)關(guān)系 由表3可以看出，土壤中的細(xì)菌、放線菌與速效鉀呈極顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系(P<0.01)，與有機(jī)質(zhì)和全鉀呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系(P<0.05)。真菌與有機(jī)質(zhì)、堿解氮、速效磷、速效鉀呈極顯著正相關(guān)關(guān)系(P<0.01)，與全氮呈顯著正相關(guān)關(guān)系(P<0.05)。

2.4.2土壤養(yǎng)分與土壤自毒物質(zhì)之間的相關(guān)關(guān)系 由表4可知，土壤速效磷、速效鉀和所有土壤自毒物質(zhì)指標(biāo)均呈極顯著正相關(guān)關(guān)系(P<0.01)，有機(jī)質(zhì)與綠原酸呈顯著正相關(guān)關(guān)系(P<0.05)、與其他自毒物質(zhì)指標(biāo)呈極顯著相關(guān)(P<0.01)。除了綠原酸，堿解氮與其余自毒指標(biāo)都具有顯著相關(guān)性(P<0.05)。

2.4.3土壤微生物數(shù)量與土壤自毒物質(zhì)之間的相關(guān)關(guān)系 由表5可知，土壤中的細(xì)菌、真菌與所有自毒物質(zhì)含量指標(biāo)均具有顯著相關(guān)性(P<0.05)。放線菌只與綠原酸、對(duì)羥基苯甲酸、香豆素、自毒物質(zhì)之和具有極顯著相關(guān)關(guān)系(P<0.01)。

表3 不同養(yǎng)分因子和3種微生物數(shù)量因子之間的相關(guān)性分析 Table 3 Simple correlation of soil nutrients and microorganism

*P<0.05,**P<0.01,下同。The same below.

表4 不同養(yǎng)分因子和不同自毒物質(zhì)因子之間的相關(guān)性分析 Table 4 Simple correlation of soil nutrients and allelochemical

表5 3種微生物因子和不同自毒物質(zhì)因子的相關(guān)性分析 Table 5 Simple correlation of soil microorganism and allelochemical

3 討論

3.1 自毒物質(zhì)與連作

紫花苜蓿的種子、根、莖、葉、花的組織及殘根、枯枝落葉可以向土壤釋放一定量的次生代謝物質(zhì)，阻礙紫花苜蓿自身的萌發(fā)和生長(zhǎng)[12]，被稱為苜蓿的自毒作用。自毒作用是化感作用的種內(nèi)形式，是作物產(chǎn)生連作障礙的原因之一。自毒現(xiàn)象直接影響紫花苜蓿草地的產(chǎn)量、管理、品質(zhì)和經(jīng)濟(jì)收入。酚酸類物質(zhì)和香豆素是紫花苜蓿常見(jiàn)報(bào)道的自毒物質(zhì)，酚酸類物質(zhì)在土壤中積累也是造成很多植物連作障礙的主要原因[17]。土壤中自毒物質(zhì)含量會(huì)直接影響植物的生長(zhǎng)，本研究表明輪作玉米和小麥后土壤中自毒物質(zhì)含量呈不同程度的降低，說(shuō)明輪作對(duì)紫花苜蓿自毒現(xiàn)象有一定的緩解作用，促進(jìn)后茬作物的生長(zhǎng)，輪作1年后已經(jīng)表現(xiàn)出緩解作用，第2年消減強(qiáng)度更大；輪作小麥對(duì)自毒物質(zhì)含量的消減幅度高于玉米。

有學(xué)者認(rèn)為土壤養(yǎng)分下降是導(dǎo)致連作障礙的主要原因[18]，但通過(guò)施肥來(lái)緩解連作障礙，效果并不顯著[19]。本研究發(fā)現(xiàn)紫花苜蓿輪作玉米、小麥后，土壤有機(jī)質(zhì)、全氮、堿解氮、速效磷含量呈不同程度的下降，輪作玉米的消耗幅度顯著增強(qiáng)，說(shuō)明種植玉米加大了對(duì)土壤有機(jī)質(zhì)、全氮、堿解氮和速效磷的消耗，種植小麥能夠維持農(nóng)田土壤肥力生長(zhǎng)季平衡。研究報(bào)道土壤養(yǎng)分缺乏，植物會(huì)分泌更多的次生代謝物質(zhì)[20]，但本研究發(fā)現(xiàn)輪作后土壤養(yǎng)分下降，土壤中酚酸類物質(zhì)和香豆素含量也隨之減少，表明土壤養(yǎng)分不是導(dǎo)致連作障礙的主要原因。通過(guò)典型性分析表明，土壤養(yǎng)分和土壤自毒物質(zhì)之間沒(méi)有顯著相關(guān)性。輪作后次生代謝物質(zhì)降低可能是后茬作物和紫花苜蓿分泌的自毒物質(zhì)發(fā)生互作作用，也可能是土壤微生物鈍化了自毒物質(zhì)活性、改變了自毒物質(zhì)的數(shù)量和種類。

3.2 土壤微生物與連作

自然條件下，在土壤中定殖著種類多樣、數(shù)量龐大的微生物，植物的生長(zhǎng)發(fā)育都與其有著密切的關(guān)系，微生物群落結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定對(duì)于預(yù)防土壤病害的發(fā)生有重要的作用。有研究顯示，連作作物的發(fā)病與其根際微生物群落結(jié)構(gòu)失衡有關(guān)[21]，特別是與根際有益微生物和有害微生物的比例失衡有關(guān)[22]。本研究結(jié)果顯示，輪作可以提高土壤細(xì)菌、放線菌的數(shù)量，降低真菌的數(shù)量。這一結(jié)果與前人得出的結(jié)論吻合，甄文超等[15]的研究表明草莓(Fragariaananassa)根際病害發(fā)生后，其根際真菌增加，細(xì)菌和放線菌數(shù)量減少。另有Benizri等[23]對(duì)桃樹(shù)根部病害的研究也表明其發(fā)病與根際土壤中細(xì)菌的數(shù)量和種類降低、真菌的種類和數(shù)量提高有密切關(guān)系。綜上，連作障礙的發(fā)生實(shí)際是土壤微生物群落結(jié)構(gòu)失衡的過(guò)程，而這一過(guò)程，涉及環(huán)境、土壤、植物及其根際微生物等多個(gè)因子之間的非常復(fù)雜的相互作用，土壤微生物在這一復(fù)雜系統(tǒng)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。因此從土壤微生態(tài)系統(tǒng)角度出發(fā)研究連作障礙的發(fā)生，能從根本上闡明連作障礙發(fā)生機(jī)制并采取相應(yīng)的調(diào)控措施加以防治。

3.3 自毒物質(zhì)與土壤微生物

由表5可以看出，自毒物質(zhì)與土壤微生物存在密切的關(guān)系。事實(shí)上，植株不論通過(guò)何種途徑產(chǎn)生和釋放自毒物質(zhì)，最終其中的絕大多數(shù)都將進(jìn)入土壤中進(jìn)行遷移和轉(zhuǎn)化。土壤微生物作為土壤自毒物質(zhì)的循環(huán)調(diào)節(jié)者，是研究植株自毒作用活躍的生物因子[24]。土壤微生物主要通過(guò)對(duì)土壤中自毒物質(zhì)進(jìn)行代謝、降解以及利用來(lái)使其發(fā)生轉(zhuǎn)變[25]，相互之間存在著拮抗和促進(jìn)作用，有些微生物能使自毒物質(zhì)的種類和數(shù)量發(fā)生改變，而有些自毒物質(zhì)能改變土壤微生物分布等。植物根際分泌的自毒物質(zhì)能改變根際微生物的種類、數(shù)量和分布，如棕櫚酸使茄子(Solanummelongena)根際土壤中微生物數(shù)量和其組成比例發(fā)生變化，其中真菌降低，而細(xì)菌和放線菌升高[26]。微生物對(duì)自毒物質(zhì)活性、轉(zhuǎn)化及在土壤中的持久性起重要作用[5]。研究表明土壤微生物能修飾自毒物質(zhì)的活性，使一些自毒活性物質(zhì)轉(zhuǎn)變?yōu)榉腔钚晕镔|(zhì)，同時(shí)也能將沒(méi)活性的物質(zhì)轉(zhuǎn)化為有活性的物質(zhì)。同樣，由于土壤中存在的酚酸物質(zhì)引起的自毒作用，可以通過(guò)微生物代謝來(lái)降低有毒酚酸濃度或有機(jī)殘余物中酚酸的釋放速度，進(jìn)而影響自毒作用的持續(xù)時(shí)間和大小[26]。在紫花苜蓿輪作過(guò)程中，土壤微生物和自毒物質(zhì)之間的互作關(guān)系是如何發(fā)生的，其機(jī)理是怎樣的，將是下一步研究的重點(diǎn)方向。

4 結(jié)論

5齡紫花苜蓿輪作玉米、小麥可有效降低土壤自毒物質(zhì)綠原酸、咖啡酸、對(duì)羥基苯甲酸、阿魏酸、香豆素的含量，輪作第2年的消減自毒物質(zhì)的效果強(qiáng)于第1年，同一年，輪作小麥的消減作用強(qiáng)于玉米。輪作后土壤微生物群落由真菌型向細(xì)菌型變化，土壤有機(jī)質(zhì)、全氮、堿解氮、速效磷的消耗顯著增加，種植玉米對(duì)土壤有機(jī)質(zhì)、全氮、速效氮和速效磷的消耗顯著強(qiáng)于種植小麥。結(jié)合輪作后土壤中自毒物質(zhì)含量、土壤養(yǎng)分、土壤微生物的變化，得出紫花苜蓿輪作小麥能夠維持農(nóng)田土壤肥力平衡，在半干旱地區(qū)多年生苜蓿草地向農(nóng)田轉(zhuǎn)變過(guò)程中，以輪作小麥為宜，輪作1年小麥解毒效果明顯，輪作2年更佳。