伍文憲，張蕾，黃小琴，楊瀟湘，薛龍海，劉勇*

(1.四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，四川 成都 610066；2.農(nóng)業(yè)部西南作物有害生物綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610066)

川西北高寒草地位于青藏高原東部邊緣半濕潤地區(qū)，主要由草甸草原和沼澤濕地組成，是四川省重要的畜牧業(yè)生產(chǎn)基地，也是我國長江、黃河兩大水系的重要水源涵養(yǎng)區(qū)，其生態(tài)地位、生態(tài)價(jià)值和戰(zhàn)略意義突出[1]。與此同時(shí)，該區(qū)域作為全球高寒草原的典型區(qū)域，受全球氣候變化影響強(qiáng)烈，是我國境內(nèi)對(duì)全球變化反應(yīng)較為敏感的生態(tài)系統(tǒng)之一。近幾十年來，受全球氣候變化及人為因素影響，川西北高寒草地“三化”(退化、沙化、荒漠化)現(xiàn)象嚴(yán)重，導(dǎo)致草地生產(chǎn)力下降，草畜矛盾尖銳，草原生態(tài)環(huán)境不斷惡化，極大限制了該地區(qū)經(jīng)濟(jì)社會(huì)的可持續(xù)發(fā)展，削弱了川西北地區(qū)生態(tài)環(huán)境屏障的作用[2-3]。

建植和培育人工草地是恢復(fù)草原植被、遏制草原退化、改善生態(tài)環(huán)境的有效措施，同時(shí)也對(duì)該地區(qū)畜牧業(yè)穩(wěn)定和可持續(xù)發(fā)展具有重大意義[4]。紫花苜蓿(Medicagosativa)、燕麥(Avenasativa)等牧草對(duì)高寒氣候適應(yīng)性強(qiáng)，容易栽培，飼用價(jià)值優(yōu)良，已成為川西北高寒牧區(qū)大力推廣的優(yōu)選人工草地牧草種類[5]。通過十多年的努力，川西北高寒牧區(qū)采取了人工種草等一系列植被恢復(fù)綜合治理措施，在維持天然草地草畜平衡，緩解草地生態(tài)壓力及遏制局部生態(tài)環(huán)境惡化上取得了積極成效[2]。

土壤微生物是土壤生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，參與并推動(dòng)了生態(tài)環(huán)境中物質(zhì)和能量的流動(dòng)和轉(zhuǎn)移[6]。土壤中微生物群落多樣性不僅有助于維持土壤生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定，還具有提高對(duì)抗土壤生態(tài)環(huán)境惡化的緩沖能力[7-8]。前人研究表明，土壤微生物群落結(jié)構(gòu)受土壤質(zhì)量和地上植物種類、組成、生物量等變化影響，例如地上部植被可通過其根際生理過程和根系分泌物等化感物質(zhì)影響到土壤微生物群落的結(jié)構(gòu)和組成，而土壤微生物反過來也會(huì)通過其自身的生理生化作用或分泌一些激素等物質(zhì)對(duì)植被產(chǎn)生影響[9]。因此，研究土壤微生物群落對(duì)地上植物群落變化的響應(yīng)，有助于理解該地區(qū)植被變化帶來的生態(tài)學(xué)效應(yīng)及其機(jī)制。目前關(guān)于人工草地的研究主要集中在地上植被群落演替及地下土壤的理化性狀研究[10-11]，而人工草地對(duì)土壤微生物群落影響的研究有待加強(qiáng)，已經(jīng)開展的研究也主要集中在采用變性梯度凝膠電泳(polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis, PCR-DGGE)、磷脂脂肪酸(phospholipid-derived fatty acids, PLFAs)等方法分析土壤微生物生物量與群落結(jié)構(gòu)變化[12]。本研究圍繞人工草地上種植的不同牧草對(duì)其地下土壤微生物群落結(jié)構(gòu)與組成的影響，采用Illumina Hiseq高通量測序等分子生態(tài)學(xué)方法，結(jié)合生物信息學(xué)技術(shù)分析土壤細(xì)菌和真菌物種組成、群落結(jié)構(gòu)及多樣性，研究紫花苜蓿人工草地、燕麥人工草地和天然草地土壤微生物群落的差異，為合理開發(fā)利用人工草地及科學(xué)評(píng)價(jià)人工草地生態(tài)系統(tǒng)健康狀況提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)區(qū)概況和土壤采集

研究區(qū)位于四川省阿壩藏族羌族自治州紅原縣邛溪鎮(zhèn)(N 32°50′-32°83′，E 102°35′-102°58′，海拔3520 m)，屬典型的大陸高原寒溫帶季風(fēng)氣候，降水集中于5-10月，年均降水量792 mm，平均相對(duì)濕度71%；年均氣溫0.9 ℃，最高氣溫在7月，平均氣溫10.9 ℃，最低氣溫在12月，平均氣溫-10.3 ℃，年均積溫1432.2 ℃，≥10 ℃年積溫322 ℃，年均積雪期達(dá)70 d以上，無絕對(duì)的無霜期。主要植被類型為高寒草甸、沼澤草甸、高山灌叢草地等；土壤類型以亞高山草甸土為主，沼澤土、沼澤化草甸土和風(fēng)沙土等均有分布[3,13-15]。

2017年9月在位于紅原縣邛溪鎮(zhèn)的西南民族大學(xué)青藏高原基地選取3塊試驗(yàn)樣地，分別為紫花苜蓿人工草地、燕麥人工草地及天然草地，其中紫花苜蓿人工草地和燕麥人工草地建植期均為5年，天然草地植被主要為垂穗披堿草(Elymusnutans)+車前草(Plantagoasiatica)+密花早熟禾(Poapachyantha)+珠芽蓼(Polygonumviviparum)，蓋度為75%～90%。在3個(gè)樣地內(nèi)選取呈三角形的3個(gè)采樣點(diǎn)，各樣點(diǎn)間距離約50 m，每個(gè)樣點(diǎn)按5點(diǎn)取樣法取0～10 cm土層土樣，混合均勻后合為一個(gè)土壤樣品[16]。試驗(yàn)設(shè)置3個(gè)平行重復(fù)，最終得到3個(gè)紫花苜蓿人工草地土壤樣品、3個(gè)燕麥人工草地土壤樣品和3個(gè)天然草地土壤樣品，土樣裝密封袋低溫帶回實(shí)驗(yàn)室，過2 mm篩后立即保存在超低溫冰箱(-80 ℃)冷凍暫存。

1.2 土壤微生物總DNA提取、PCR擴(kuò)增和高通量測序

采用E.Z.N.A.?Soil DNA Kit(OMEGA土壤基因組DNA提取試劑盒)提取土壤總DNA，DNA含量和純度采用NanoDrop 2000(Thermo Fisher Scientific Massachusetts, The United States of America)測定，利用引物515F(5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)對(duì)細(xì)菌16S rRNA基因的V4高變區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增[17]。采用引物ITS1-1737F(5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′)和ITS2-2043R(5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′)對(duì)真菌rRNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增[18]。PCR反應(yīng)體系50 μL：模板DNA(10 ng) 2 μL，10×PCR buffer(Mg2+Plus) 5 μL，dNTP(10 mmol·L-1) 5 μL，Bar-PCR引物F(50 μmol·L-1) 0.5 μL，引物R(50 μmol·L-1) 0.5 μL，TaKaRa Taq(5 U·μL-1) 0.5 μL，滅菌雙蒸水36.5 μL。PCR反應(yīng)條件為：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。將純化質(zhì)量合格的PCR產(chǎn)物用于DNA文庫構(gòu)建，建庫及測序工作委托北京諾和致源科技有限公司執(zhí)行。

1.3 數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)分析

根據(jù)Barcode序列和PCR擴(kuò)增引物序列從下機(jī)數(shù)據(jù)中拆分出各樣品數(shù)據(jù)。使用FLASH(v1.2.7, http://ccb.Jhu.Edu/software/FLASH/)軟件對(duì)每個(gè)樣品的序列進(jìn)行拼接并過濾掉低質(zhì)量的序列[19-20]。參照QIIME(v1.9.1, http://qiime.org/scripts/split_libraries_fastq.html)的序列質(zhì)量控制流程進(jìn)行序列截取和長度過濾。經(jīng)過以上處理后得到的序列需要進(jìn)行去除嵌合體序列處理，通過UCHIME Algorithm(http://www.drive5.com/usearch/m- anual/uchime_algo.html)與數(shù)據(jù)庫(Gold database, http://drive5.com/uchime/uchime_download.html)進(jìn)行比對(duì)檢測嵌合體序列，并最終去除其中的嵌合體序列，得到最終的有效數(shù)據(jù)。利用Uparse 軟件(Uparse v7.0.1001, http://drive5.com/uparse/)對(duì)所有樣品的全部有效序列進(jìn)行聚類，將相似性大于97%的有效序列聚類成一個(gè)操作分類單元(operational taxonomic unit, OTU)，并為每個(gè)OTU對(duì)應(yīng)的代表序列分配分類單元[21-22]。對(duì)OTUs代表序列進(jìn)行物種注釋，用Mothur方法與SILVA(http://www.arb-silva.de/)[23]的SSUrRNA數(shù)據(jù)庫[24]進(jìn)行物種注釋分析(設(shè)定閾值為0.8～1.0)，獲得分類學(xué)信息并分別在各個(gè)分類水平：界(kingdom)，門(phylum)，綱(class)，目(order)，科(family)，屬(genus)，種(species)統(tǒng)計(jì)各樣本的群落組成。使用MUSCLE[25](Version 3.8.31，http://www.drive5.com/muscle/)軟件進(jìn)行快速多序列比對(duì)，得到所有OTUs代表序列的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系。最后對(duì)各樣品的數(shù)據(jù)進(jìn)行均一化處理，以樣品中數(shù)據(jù)量最少的為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行均一化處理，后續(xù)的Alpha多樣性分析和Beta多樣性分析都是基于均一化處理后的數(shù)據(jù)。對(duì)各個(gè)樣品的OTU進(jìn)行組成分析，得到不同分類水平上的細(xì)菌和真菌類群組成及相對(duì)豐度信息，將其中無法鑒定到分類水平的類群統(tǒng)稱為未知類群(Unknown)，將相對(duì)豐度低于1%的類群合并統(tǒng)稱為其他類群(Others)[20]。

采用Excel 2013、SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理、分析，采用One-way ANOVA單因素方差分析和LSD多重比較檢驗(yàn)分析紫花苜蓿人工草地(Group 1)、燕麥人工草地(Group 2)以及天然草地(Group 3)土壤在P=0.05水平上的組間顯著性差異。利用各樣品OTUs之間的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系，用QIIME軟件(Version 1.9.1)計(jì)算豐富度指數(shù)(Chao index)，香農(nóng)指數(shù)(Shannon index)，ACE指數(shù)(ACE index)以及覆蓋度(Goods-coverage)，使用R軟件(Version 2.15.3)繪制稀釋曲線，計(jì)算Unifrac距離(Unweighted Unifrac)和Weighted Unifrac距離(Weighted Unifrac)，形成距離矩陣熱圖。使用R軟件(Version 2.15.3)的Ade 4和Ggplot 2軟件進(jìn)行主成分差異分析并繪制主成分分析(principal component analysis, PCA)圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 人工草地與天然草地土壤細(xì)菌和真菌群落Alpha多樣性特征

對(duì)3個(gè)區(qū)組共計(jì)9個(gè)土壤樣本進(jìn)行高通量測序，結(jié)果顯示紫花苜蓿人工草地(Group 1)細(xì)菌和真菌分別獲得有效序列為83615和79884條；燕麥人工草地(Group 2)細(xì)菌和真菌分別獲得有效序列為84167和81628條；而天然草地(Group 3)細(xì)菌和真菌分別獲得有效序列為85725和84091條。稀釋曲線可反映測序深度，是評(píng)估測序量是否足以覆蓋所有類群的一個(gè)關(guān)鍵指標(biāo)，如圖1所示，隨著測序數(shù)量的增加，各區(qū)組土壤細(xì)菌和真菌稀釋曲線趨向平坦，說明3個(gè)區(qū)組土壤樣本測序深度已近乎飽和，基本涵蓋了土壤中所有細(xì)菌和真菌種群。

圖1 3種草地植被下土壤細(xì)菌和真菌的稀釋曲線Fig.1 Bacterial and fungal rarefaction curve analysis in three vegetations Group 1: 紫花苜蓿人工草地土壤；Group 2: 燕麥人工草地土壤；Group 3: 天然草地土壤。下同。Group 1: Artificial meadow (alfalfa) soils；Group 2: Artificial meadow (oats) soils； Group 3: Natural grassland soils. The same below.

測序樣本中，紫花苜蓿人工草地(Group 1)土壤中檢測到3782個(gè)細(xì)菌OTUs，1206個(gè)真菌OTUs；燕麥人工草地(Group 2)土壤中檢測到3872個(gè)細(xì)菌OTUs，962個(gè)真菌OTUs；天然草地(Group 3)土壤中則檢測到3821個(gè)細(xì)菌OTUs，1016個(gè)真菌OTUs。OTUs表示土壤微生物豐富度實(shí)際觀測值，可以看出，紫花苜蓿人工草地、燕麥人工草地與天然草地土壤微生物OTUs值相當(dāng)，差異不顯著。3種草地類型下的土壤細(xì)菌覆蓋率均超98.90%，真菌覆蓋率分別為92.37%、92.10%和93.45%(表1和表2)，表明測序土壤樣本中細(xì)菌和真菌序列沒有被測出的概率低，測序結(jié)果能夠表示土壤中細(xì)菌和真菌的真實(shí)存在情況。Chao指數(shù)和ACE指數(shù)表示土壤微生物的豐富度，而Shannon指數(shù)可反映土壤微生物的多樣性程度[26]。如表1所示，土壤細(xì)菌α-多樣性指數(shù)在不同草地植被類型之間均無顯著性差異。從表2可知，各草地植被類型在土壤真菌Chao指數(shù)和ACE指數(shù)上也無顯著性差異，但紫花苜蓿人工草地(Group 1)土壤真菌Shannon指數(shù)顯著高于燕麥人工草地(Group 2)和天然草地(Group 3)，表明各區(qū)組土壤樣本間的細(xì)菌和真菌群落豐富度無顯著性差異，僅紫花苜蓿人工草地土壤真菌群落多樣性程度與燕麥人工草地和天然草地比較有顯著性提高(P<0.05)。

表1 3種草地植被類型下土壤細(xì)菌多樣性指數(shù) Table 1 Diversity indices for soil bacteria communities in three vegetation types

注：同列不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，下同。

Note:The different letters mean the significant differences atP<0.05, the same below.

表2 3種草地植被類型下土壤真菌多樣性指數(shù) Table 2 Diversity indices for soil fungal communities in three vegetation types

2.2 人工草地與天然草地土壤細(xì)菌群落組成分析

OTU物種注釋結(jié)果表明，3個(gè)草地植被類型土壤中的11475個(gè)OTUs隸屬于42門92綱171目330科547屬。主要細(xì)菌門類(相對(duì)豐度≥1%)分別是：變形菌門(Proteobacteria)28.47%、酸桿菌門(Acidobacteria)21.13%、放線菌門(Actinobacteria)15.11%、疣微菌門(Verrucomicrobia)12.19%、綠彎菌門(Chloroflexi)5.34%、浮菌門(Planctomycetes)3.54%、硝化螺旋菌門(Nitrospirae)2.74%、芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)3.68%、擬桿菌門(Bacteroidetes)2.81%以及厚壁菌門(Firmicutes)1.66%，其余門類所占比例均低于1%，共占3.32%。通過物種差異分析得出，天然草地土壤中的酸桿菌門(Acidobacteria)和硝化螺旋菌門(Nitrospirae)豐度顯著高于人工草地(P<0.05)；人工草地土壤中放線菌門(Actinobacteria)豐度顯著高于天然草地(P<0.05)；紫花苜蓿人工草地土壤中綠彎菌門(Chloroflexi)豐度顯著高于燕麥人工草地和天然草地。紫花苜蓿人工草地土壤樣本中厚壁菌門(Firmicutes)豐度顯著高于天然草地(P<0.05)，但與燕麥人工草地比較卻無顯著性差異；其他細(xì)菌門在燕麥人工草地與天然草地之間存在顯著差異(P<0.05)(圖2)。

細(xì)菌綱分類水平上，3種植被類型的土壤優(yōu)勢菌為：Spartobacteria綱，α-變形菌綱(α-proteobacteria)，β-變形桿菌綱(β-proteobacteria)，Thermoleophilia綱，酸桿菌綱(Acidobacteria)，放線菌綱(Actinobacteria)，Blastocatellia綱，γ-變形菌綱(γ-proteobacteria)以及硝化螺旋菌綱(Nitrospira)等。3個(gè)草地植被類型土壤中綱水平優(yōu)勢菌群豐富度高低順序不一致，在紫花苜蓿人工草地土壤中，Spartobacteria綱豐度最高，α-變形菌綱次之；在燕麥人工草地土壤中，細(xì)菌綱水平相對(duì)豐度順序?yàn)椋害?變形菌綱>Spartobacteria綱>β-變形桿菌綱>Thermoleophilia綱>放線菌綱；而在天然草地土壤中的豐度從高到低依次為：β-變形桿菌綱>Spartobacteria綱>α-變形菌綱>酸桿菌綱>Blastocatellia綱>γ-變形菌綱。物種差異結(jié)果如圖3所示，人工草地與天然草地土壤中的α-變形菌綱、Thermoleophilia綱、酸桿菌綱、放線菌綱、Blastocatellia綱和硝化螺旋菌綱相對(duì)豐度存在顯著性差異(P<0.05)。

圖2 門水平下的細(xì)菌群落組成Fig.2 Composition of bacterial community at phylum level 1:變形菌門 Proteobacteria;2:酸桿菌門 Acidobacteria;3:放線菌門Actinobacteria;4:疣微菌門 Verrucomicrobia;5:綠彎菌門 Chloroflexi;6:浮霉菌門 Planctomycetes;7:消化螺菌門 Nitrospirae;8:芽單胞菌門 Gemmatimonadetes;9:擬桿菌門 Bacteroidetes;10:厚壁菌門Firmicutes;11:其他Others.不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，下同。The different letters mean the significant differences at P<0.05, the same below.

圖3 綱水平下土壤細(xì)菌群落組成Fig.3 Composition of bacterial community at class level 1:Spartobacteria;2:α-變形桿菌綱 α-proteobacteria;3:β-變形桿菌綱 β-proteobacteria;4:Thermoleophilia;5:酸桿菌綱 Acidobacteria;6:放線菌綱 Actinobacteria;7:Blastocatellia;8:Subgroup_6;9:γ-變形菌綱 γ-proteobacteria;10:硝化螺旋菌綱 Nitrospira;11:其他 Others.

根據(jù)每個(gè)區(qū)組土壤中各細(xì)菌屬的豐度均值，選取豐度排名為前35的細(xì)菌屬，對(duì)不同植被類型之間細(xì)菌的相對(duì)豐度進(jìn)行聚類分析，得到熱圖(Heatmap)(圖 4)。從圖4中可知，紫花苜蓿人工草地土壤有11個(gè)屬相對(duì)豐度較高，分別為紅游動(dòng)菌屬(Rhodoplanes)、節(jié)桿菌屬(Pseudarthrobacter)、嗜酸棲熱菌屬(Acidothermus)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、芽孢八疊球菌屬(Sporosarcina)、Pseudolabrys屬、嗜鹽囊菌屬(Haliangium)、Bryobacter屬、Dokdonella屬等；燕麥人工草地土壤相對(duì)豐度較高的有12個(gè)屬，主要是鞘氨醇單孢菌屬(Sphingomonas)、馬賽菌屬 (Massilia)、芽單孢菌屬(Gemmatimonas)、土壤紅桿菌屬(Solirubrobacter)和類諾卡氏菌屬(Nocardioides)；而在天然草地土壤中則以地桿菌屬(Geobacter)、厭氧粘細(xì)菌(Anaeromyxobacter)和其他未命名細(xì)菌屬為主。

圖4 3種土壤樣品細(xì)菌屬水平相對(duì)豐度熱圖Fig.4 Heatmap diagram of bacterial genus in different soil samples

2.3 人工草地與天然草地土壤真菌群落組成分析

3個(gè)草地植被類型土壤樣品中的3184個(gè)OTUs分屬于6門29綱95目221科331屬，大于1%的真菌門類有子囊菌門(Ascomycota)、接合菌門(Zygomycota)、擔(dān)子菌門(Basidiomycota)、球囊菌門(Glomeromycota)、壺菌門(Chytridiomycota)，如圖5所示，燕麥人工草地與紫花苜蓿人工草地土壤中接合菌門豐度有顯著性差異(P<0.05)，除此之外，3個(gè)草地植被類型土壤中的其他真菌門類相對(duì)豐度均無顯著性差異。

綱水平上，3種植被類型的土壤優(yōu)勢菌綱有接合菌綱(Zygomycotes)、糞殼菌綱(Sordariomycetes)、傘菌綱(Agaricomycetes)、散囊菌綱(Eurotiomycetes)、Archaeorhizomycetes綱、盤菌綱(Pezizomycetes)、錘舌菌綱(Leotiomycetes)、座囊菌綱(Dothideomycetes)、球囊菌綱(Glomeromycetes)、子囊菌綱(Ascomycetes)，還有10.97%的未能分類。在紫花苜蓿人工草地土壤中，按照豐富度由高到低排列順序?yàn)椋杭S殼菌綱>接合菌綱>座囊菌綱>錘舌菌綱>傘菌綱>散囊菌綱；燕麥人工草地土壤綱水平相對(duì)豐度排名為：接合菌綱>糞殼菌綱>錘舌菌綱>傘菌綱>座囊菌綱>散囊菌綱；而在天然草地土壤中的豐度順序是：接合菌綱>Archaeorhizomycetes綱>傘菌綱>散囊菌綱>糞殼菌綱>盤菌綱。圖6分析顯示3個(gè)區(qū)組在綱水平上物種差異較大，表明紫花苜蓿人工草地、燕麥人工草地及天然草地土壤中真菌綱水平的相對(duì)豐度差異明顯。

圖5 土壤真菌在門水平上的群落組成Fig.5 Soil fungal phylum community composition 1:子囊菌門 Ascomycota;2:接合菌門 Zygomycota;3:擔(dān)子菌門 Basidiomycota;4:球囊菌門 Glomeromycota;5:壺菌門 Chytridiomycota.

圖6 土壤真菌在綱水平上的群落組成Fig.6 Soil fungal community composition at the class level 1:接合菌綱 Zygomycetes;2:糞殼菌綱 Sordariomycetes;3:傘菌綱 Agaricomycetes;4:散囊菌綱 Eurotiomycetes;5:Archaeorhizomycetes;6:盤菌綱 Pezizomycetes;7:錘舌菌綱 Leotiomycetes;8:座囊菌綱 Dothideomycetes;9:球囊菌綱 Glomeromycetes;10:子囊菌綱 Ascomycetes;11:其他 Others.

圖7 3種土壤樣品真菌屬水平相對(duì)豐度熱圖Fig.7 Heatmap diagram of fungal genus in three soil samples

在屬分類水平上，紫花苜蓿人工草地土壤真菌組成中豐度較高的有10個(gè)屬，主要為：木霉屬(Trichoderma)、假散囊菌屬(Pseudeurotium)、錐蓋傘屬(Conocybe)、節(jié)水霉屬(Gonapodya)、短梗蠕孢屬(Trichocladium)、裂殼菌屬(Schizothecium)、枝孢屬(Cladosporium)、小光殼屬(Leptosphaerulina)等；在燕麥人工草地土壤中，豐度排名靠前的已知真菌屬主要為鐮刀菌屬(Fusarium)、實(shí)苔屬(Pyrenula)、黑粉菌屬(Ustilago)、Eucasphaeria屬、短梗霉屬(Aureobasidium)、光黑殼屬(Preussia)、圓盤菌屬(Orbilia)、附球菌屬(Epicoccum)等16個(gè)屬；在天然草地土壤中，豐度較高的有4個(gè)真菌屬，分別是囊壺菌屬(Phlyctochytrium)、粉褶菌屬(Entoloma)、哈氏菌屬(Harzia)和擬鎖瑚菌屬(Clavulinopsis)。

2.4 人工草地與天然草地土壤微生物群落Beta多樣相關(guān)性分析

Beta多樣性分析關(guān)注樣品間的微生物群落構(gòu)成差異，距離矩陣熱圖、主坐標(biāo)分析(principal co-ordinates analysis, PCoA)、主成分分析(principal component analysis, PCA)、無度量多維標(biāo)定法(non-metric multi-dimensional scaling, NMDS)等均可反映樣品間的Beta多樣性差異。距離矩陣熱圖是由Unweighted Unifrac距離和Weighted Unifrac 距離構(gòu)成，Unweighted Unifrac 距離是利用各樣品中微生物序列間的進(jìn)化信息來計(jì)算樣品間距離，Weighted Unifrac距離則是利用OTUs的豐度信息對(duì)Unweighted Unifrac距離進(jìn)一步構(gòu)建而成，這兩個(gè)指標(biāo)均可以指示樣品間的微生物群落構(gòu)成差異性， 其值越大， 表示樣品間在物種結(jié)構(gòu)上存在的差異越大[27]。 主成分分析是通過正交變換將變量個(gè)數(shù)較多的復(fù)雜數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為一組線性不相關(guān)的變量，從而將多維數(shù)據(jù)的差異反映在二維坐標(biāo)圖上，從中發(fā)現(xiàn)不同樣品(組)間的差異，如果樣品的群落組成差異越大，則它們?cè)赑CA圖中的距離越遠(yuǎn)[20-22]。

圖8 土壤樣品細(xì)菌(A、C)、真菌(B、D)距離矩陣熱圖(A、B)及主成分相關(guān)分析(C、D)Fig.8 Distance matrix heatmap (A, B) and principle component analysis (C, D) of bacteria (A, C) and fungi (B, D) difference in groups among soil samples A、B方格里的上方數(shù)字為Weighted Unifrac距離系數(shù)，方格里下方數(shù)字為Unweighted Unifrac距離系數(shù)。The upper numbers in the grid are weighted unifrac distance coefficient; the numbers below are unweighted unifrac distance coefficient.

由圖8A可知，紫花苜蓿人工草地(Group 1)與天然草地(Group 3)土壤細(xì)菌Weighted Unifrac、Unweighted Unifrac距離系數(shù)分別為0.158和0.382；燕麥人工草地(Group 2)與天然草地(Group 3)土壤細(xì)菌Weighted Unifrac、Unweighted Unifrac距離系數(shù)分別是0.167和0.327；而紫花苜蓿人工草地(Group 1)與燕麥人工草地(Group 2)土壤細(xì)菌Weighted Unifrac與Unweighted Unifrac距離系數(shù)分別是0.114和0.339。圖8B分析得知，對(duì)真菌而言，紫花苜蓿人工草地(Group 1)與天然草地(Group 3)相比，組間Weighted Unifrac距離系數(shù)達(dá)到1.103，Unweighted Unifrac距離系數(shù)為0.589；燕麥人工草地(Group 2)與天然草地(Group 3)相比，組間Weighted Unifrac距離系數(shù)達(dá)到0.969，Unweighted Unifrac距離系數(shù)為0.626；而紫花苜蓿(Group 1)與燕麥人工草地(Group 2)土壤真菌Weighted Unifrac距離系數(shù)是0.633，Unweighted Unifrac距離系數(shù)是0.579。以上結(jié)果說明天然草地與人工草地之間的土壤微生物差異系數(shù)大于兩種人工草地之間的土壤微生物差異系數(shù)。PCA分析可知，在細(xì)菌和真菌水平上，紫花苜蓿人工草地(Group 1)、燕麥人工草地(Group 2)以及天然草地(Group 3)3組間距離大，組內(nèi)之間距離小，并且天然草地與人工草地土壤之間的微生物差異距離大于兩種人工草地土壤之間的微生物差異距離，表明草地植被類型改變了地下土壤微生物群落結(jié)構(gòu)。

3 討論

為探討人工種植牧草后對(duì)地下土壤微生物群落和結(jié)構(gòu)的影響，本研究采用高通量測序結(jié)合生物信息學(xué)技術(shù)對(duì)土壤細(xì)菌和真菌物種組成、群落結(jié)構(gòu)及多樣性等進(jìn)行了分析，以期合理開發(fā)利用人工草地及科學(xué)評(píng)價(jià)人工草地生態(tài)系統(tǒng)健康狀況提供依據(jù)。

在3個(gè)不同處理土壤樣本中，我們共檢測到變形菌門、酸桿菌門、放線菌門、疣微菌門等42個(gè)細(xì)菌門類，變形菌門是3種草地植被土壤中豐度最高的細(xì)菌類群，這一結(jié)果與其他學(xué)者關(guān)于草地土壤細(xì)菌多樣性的大多數(shù)研究一致[16]。在已有的報(bào)道中，變形菌門被認(rèn)為與碳利用有關(guān)，是世界上最為普遍的菌門。酸桿菌門與土壤營養(yǎng)相關(guān)性較大，一般而言，營養(yǎng)貧瘠的土壤中，酸桿菌門豐富度較高，酸桿菌門豐度與碳的可用性呈負(fù)相關(guān)關(guān)系[28-30]，本研究中天然草地土壤中的酸桿菌門豐度顯著高于人工草地，且在綱水平上，天然草地土壤酸桿菌綱也顯著高于人工草地，這間接說明人工草地土壤相較于天然草地，其土壤養(yǎng)分更為肥沃。本研究中放線菌門是僅次于變形菌門、酸桿菌門的另一類優(yōu)勢類群，在門和綱水平上，人工草地土壤放線菌豐度均顯著高于天然草地，放線菌最突出的特性是能分泌產(chǎn)生多種抗生素類物質(zhì)，說明人工草地土壤中具有比天然草地更多抗生素資源。細(xì)菌屬水平上，分析了紫花苜蓿人工草地、燕麥人工草地和天然草地土壤相對(duì)豐度熱圖，在人工草地中，豐度較高的有芽孢桿菌屬、土壤桿菌屬、類諾卡氏菌屬等生防菌類群，而在天然草地土壤中，豐度較高的是厭氧菌屬和一些未知細(xì)菌屬，說明川西北高寒草地土壤經(jīng)人工種草后，生防菌資源豐富度增加。

本研究中，3種草地類型土壤優(yōu)勢真菌門按照豐富度由高到低排列順序依次為子囊菌門 >接合菌門>擔(dān)子菌門>球囊菌門>壺菌門，高雪峰等[16]在短花針茅(Stipabreviflora)荒漠草原土壤微生物群落研究中發(fā)現(xiàn)子囊菌門、接合菌門、擔(dān)子菌門和壺菌門是優(yōu)勢真菌類群，朱琳等[31]對(duì)遼寧人工林根際土壤真菌研究中檢測到子囊菌門、接合菌門、擔(dān)子菌門和壺菌門這4個(gè)門外，還有球囊菌門和芽枝霉門，本研究與這些研究結(jié)果的真菌群落主要構(gòu)成類似。前人報(bào)道子囊菌門大多數(shù)為腐生菌，對(duì)降解土壤有機(jī)質(zhì)等養(yǎng)分循環(huán)起著重要作用，擔(dān)子菌門腐生或寄生，在潮濕的土壤中，可分解木質(zhì)纖維素[32-33]，子囊菌和擔(dān)子菌均是土壤中主要的真菌分解者，本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)人工草地與天然草地在子囊菌門和擔(dān)子菌門上豐度無顯著性差異，說明人工種草不會(huì)對(duì)土壤有機(jī)質(zhì)等養(yǎng)分循環(huán)起到干擾作用。真菌門水平上，人工草地土壤與天然草地土壤間的接合菌門豐度存在差異，這可能與耕作特別是施肥會(huì)影響土壤中接合菌門的含量有關(guān)。對(duì)真菌屬水平聚類分析發(fā)現(xiàn)，3個(gè)區(qū)組間差異較大，紫花苜蓿人工草地優(yōu)勢類群為木霉屬、散囊菌屬、錐蓋傘屬、短梗蠕孢屬、小光殼屬等；燕麥人工草地優(yōu)勢真菌屬是鐮刀菌屬、黑粉菌屬、附球菌屬、圓盤菌屬等；而天然草地優(yōu)勢菌群集中于囊壺菌屬、粉褶菌屬、哈氏菌屬等。紫花苜蓿優(yōu)勢真菌類群中，短梗蠕孢屬真菌大多可引起苜蓿根腐病的發(fā)生，小光殼屬則是苜蓿葉斑病的主要病原。燕麥人工草地優(yōu)勢真菌屬中，鐮刀菌可以引起禾本科植物根腐病的發(fā)生，黑粉菌屬是引起燕麥黑穗病的病原，附球菌屬可以引起葉片葉斑病發(fā)生。說明經(jīng)人工種植牧草后，草地土壤中病原真菌豐度相應(yīng)地增加。

土壤微生物的多樣性反映微生物群落的穩(wěn)定性及土壤環(huán)境對(duì)其群落結(jié)構(gòu)的影響，是土壤生態(tài)特征的關(guān)鍵指標(biāo)，可以通過α-多樣性和β-多樣性來反映，α-多樣性最常用的指標(biāo)有Chao、ACE、Shannon指數(shù)等，Chao指數(shù)和ACE指數(shù)表示土壤微生物的豐富度，而Shannon指數(shù)可反映土壤微生物的多樣性程度。研究結(jié)果表明，人工草地與天然草地在細(xì)菌Chao、ACE、Shannon指數(shù)上無顯著性差異，在真菌Chao、ACE指數(shù)上差異也不顯著，但紫花苜蓿人工草地土壤真菌Shannon指數(shù)顯著高于燕麥人工草地和天然草地，表明各區(qū)組土壤樣本間的細(xì)菌和真菌群落豐富度無顯著性差異，僅紫花苜蓿人工草地土壤真菌群落多樣性程度與燕麥人工草地和天然草地比較有顯著性提高。β-多樣性分析表明，草地植被改變了地下土壤微生物群落結(jié)構(gòu)組成，且天然草地與人工草地之間的土壤微生物差異系數(shù)大于兩種人工草地之間的土壤微生物差異系數(shù)。

4 結(jié)論

人工種植牧草后基本不會(huì)改變川西北高寒草地土壤中微生物群落豐富度和多樣性；但改變了地下土壤微生物群落構(gòu)成，天然草地與人工草地之間的土壤微生物差異系數(shù)大于兩種人工草地之間的土壤微生物差異系數(shù)；人工種植牧草降低了土壤酸桿菌門的相對(duì)豐度，提高了放線菌、芽孢桿菌、土壤桿菌、木霉菌等生防菌類群的相對(duì)豐度，與此同時(shí)，人工草地土壤中的諸如鐮刀菌屬、黑粉菌屬、小光殼屬等病原真菌豐度較天然草地土壤大幅增加。研究結(jié)果表明，人工種植牧草不會(huì)對(duì)土壤有機(jī)質(zhì)等養(yǎng)分循環(huán)起到干擾作用，相反土壤養(yǎng)分更為肥沃，生防菌資源豐富度增加，但土壤中病原真菌豐度會(huì)相應(yīng)地大幅增加。本研究結(jié)果可為認(rèn)識(shí)人工種草對(duì)川西北高寒牧區(qū)土壤微生物群落組成及多樣性影響提供科學(xué)參考。