司華哲，李志鵬，南韋肖，金春愛(ài)，李光玉，劉晗璐

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所，吉林 長(zhǎng)春 130112)

青貯是一個(gè)包含復(fù)雜的微生物活動(dòng)和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)變化的過(guò)程，其原理是首先通過(guò)創(chuàng)造無(wú)氧或少氧環(huán)境，抑制好氧微生物繁殖，然后促進(jìn)原料上附著的厭氧微生物乳酸菌以其中的可溶性糖為底物發(fā)酵生成乳酸，降低青貯pH值，再抑制其他厭氧微生物生長(zhǎng)，從而減少青貯營(yíng)養(yǎng)成分的消耗，提高青貯發(fā)酵品質(zhì)，達(dá)到長(zhǎng)期保存并保留更多的原料營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的目的[1-2]。青貯過(guò)程中微生物組成變化與發(fā)酵產(chǎn)物，尤其是揮發(fā)性脂肪酸的生成息息相關(guān)。大量研究發(fā)現(xiàn)，優(yōu)勢(shì)微生物的種類(lèi)將直接影響青貯的品質(zhì)[3-5]。

高通量測(cè)序技術(shù)的不斷發(fā)展和廣泛應(yīng)用，打破了以往變性梯度凝膠電泳(denaturing gradinent electrophoresis，DDGE)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR(quantitative real-time polymerase chain reaction，qPCR)，末端限制性片段長(zhǎng)度多樣性(terminal-restriction fragment length polymorphism，T-RFLP)等分子技術(shù)只局限優(yōu)勢(shì)或已知微生物的缺點(diǎn)，全面呈現(xiàn)了青貯過(guò)程中復(fù)雜的微生物組成及變化[6-9]。陶蓮等[10]應(yīng)用高通量測(cè)序技術(shù)研究了原料附著及青貯后微生物組成變化；McGarvey等[3]應(yīng)用高通量技術(shù)研究了青貯過(guò)程微生物動(dòng)態(tài)變化；Ennahar等[5]，Eikmeyer等[11]通過(guò)高通量技術(shù)研究了不同青貯原料微生物組成變化研究。較多應(yīng)用高通量測(cè)序技術(shù)的青貯微生物組成研究均集中在常規(guī)青貯方法或較好的青貯材料中微生物組成變化[3,5,11]，對(duì)于低水分青貯發(fā)酵過(guò)程微生物組成變化關(guān)注較少。因此，本試驗(yàn)以低水分粳稻秸稈為研究對(duì)象，以高通量測(cè)序?yàn)榧夹g(shù)手段，以添加植物乳桿菌為試驗(yàn)組，以青貯過(guò)程中微生物組成變化及與揮發(fā)性脂肪酸間的關(guān)系為主要研究方向，對(duì)青貯過(guò)程中微生物變化及其代謝產(chǎn)物進(jìn)行研究，為更好地了解青貯過(guò)程中微生物的重要作用提供更多科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與設(shè)計(jì)

以實(shí)驗(yàn)室前期分離鑒定的植物乳桿菌(Lactobacillusplantraum)S2406作為試驗(yàn)菌株。以吉林省長(zhǎng)春市雙陽(yáng)區(qū)種植的粳稻(Oryzasativa)副產(chǎn)品秸為青貯材料(含水量47%)。使用半徑4 cm，高20 cm，壁厚0.1 cm，容積為1 L的螺口樹(shù)脂瓶作為青貯容器。

試驗(yàn)根據(jù)添加物質(zhì)分為2個(gè)處理組：試驗(yàn)組(SS)噴灑植物乳桿菌S2406，添加量為5×106cfu·g-1FM；對(duì)照組(CS)噴灑等量的無(wú)菌水。

1.2 低水分青貯制作

2016年10月7日，將刈割脫粒后的粳稻秸稈切碎至1.0～1.5 cm長(zhǎng)短，使用無(wú)菌水稀釋植物乳桿菌培養(yǎng)液后，均勻噴灑于稻秸上，噴灑量為5×106cfu·g-1FM。取950～1000 g充分混合后稻秸快速壓實(shí)填緊于樹(shù)脂瓶中；對(duì)照組的制作噴灑等量的無(wú)菌水。青貯瓶放置于室溫下，試驗(yàn)期60 d。每日檢查瓶口封閉狀態(tài)，如有松動(dòng)及時(shí)旋緊瓶蓋。

1.3 樣品采集與分析

試驗(yàn)3、5、7、10、15、30、60 d后分別開(kāi)瓶取青貯樣品30 g，放入滅菌處理的500 mL錐形瓶中，加入270 mL無(wú)菌蒸餾水，攪拌均勻后放入4 ℃冰箱靜置12 h，收集上清液后使用氣相色譜儀(安捷倫 6890N，美國(guó))測(cè)定該濾液揮發(fā)性脂肪酸(volatile fatty acid，VFA)含量。

另取青貯樣品10 g進(jìn)行青貯微生物組DNA提取，使用MP公司Fast DNA spin kit for feces試劑盒。每個(gè)樣品分別提取3個(gè)DNA樣本混合后進(jìn)行PCR，將PCR產(chǎn)物送到上海生工生物公司使用Miseq測(cè)序平臺(tái)對(duì)細(xì)菌基因組的16S rDNA進(jìn)行測(cè)序。

1.4 數(shù)據(jù)分析

通過(guò)Flash軟件(FLASH v1.2.7)融合雙末端序列。采用prinseq軟件(PRINSEQ-lite 0.19.5)截掉質(zhì)量低的數(shù)據(jù)，按照97%相似性將序列聚類(lèi)為不同的操作分類(lèi)單元(operational taxonomic units，OTU)。OTU聚類(lèi)采用的軟件為uclust版本(uclust v1.1.579)，采用軟件RDP classifier進(jìn)行物種分類(lèi)[12]。通過(guò) QIIME 1.9.0計(jì)算菌群α多樣性指數(shù)(覆蓋度指數(shù)，ACE，Chao1，Simpson，Shannon)。對(duì)所取得OTU數(shù)據(jù)使用Canoco 4.5進(jìn)行主成分分析(principal components analysis， PCA)并繪圖，采用SPSS 20.0軟件中獨(dú)立T檢驗(yàn)分析差異性，P<0.05表示差異顯著。使用spearman進(jìn)行青貯微生物豐度與揮發(fā)性脂肪酸的相關(guān)性分析，取P<0.05，r>0.6分析結(jié)果使用Cytoscape 3.4.0繪制互作關(guān)系圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 添加乳桿菌對(duì)低水分稻稈青貯過(guò)程中VFA生成影響

青貯過(guò)程中VFA生成量如表1所示，5～60 d處理組乙酸生成顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，10～60 d對(duì)照組的丙酸、正丁酸(除15 d處理)、異丁酸、正戊酸、異戊酸生成量顯著高于處理組(P<0.05)。兩組中乙酸的含量從5 d后隨時(shí)間增加均逐漸增加。這表明，添加植物乳桿菌可以顯著降低青貯過(guò)程中丙酸、正丁酸、異丁酸、正戊酸、異戊酸的生成并可提高乙酸的生成。

2.2 添加乳桿菌對(duì)低水分稻秸稈青貯微生物組成影響

由表2可知，青貯中所有樣品Coverage指數(shù)均大于0.92，測(cè)序深度基本可代表青貯過(guò)程中微生物的核心組成。通過(guò)聚類(lèi)分析，共獲得4858個(gè)OTUs歸類(lèi)于15個(gè)菌門(mén)，496個(gè)屬。OTU數(shù)量與Shannon指數(shù)上，對(duì)照組顯著高于試驗(yàn)組(P<0.05)，其他α多樣性指數(shù)并未存在差異，這表明，添加植物乳桿菌可以減少青貯中細(xì)菌多樣性，但對(duì)細(xì)菌的豐度及均勻度并無(wú)顯著影響。

青貯過(guò)程中兩組微生物(門(mén)水平)組成如圖1a所示，兩組在青貯過(guò)程中優(yōu)勢(shì)微生物菌門(mén)均為變形菌門(mén)(Proteobacteria)和厚壁菌門(mén)(Firmicutes)。其他菌門(mén)中包括擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes)、放線菌門(mén)(Actinobacteria)和藍(lán)菌門(mén)(Cyanobacteria)等。其中，對(duì)照組變形菌門(mén)占比較高為(72.8%～95.9%)，其次為厚壁菌門(mén)(3.9%～26.8%)，處理組則相反，其含量最高菌門(mén)為厚壁菌門(mén)(54.5%～93.9%)，其次為變形菌門(mén)(5.4%～43.9%)。這說(shuō)明添加植物乳桿菌可以提高青貯中厚壁菌門(mén)的豐度，極大抑制變形菌門(mén)所占比例。

青貯過(guò)程中兩組微生物(屬水平)組成如圖1b所示，對(duì)照組的優(yōu)勢(shì)菌為腸桿菌屬(Enterobacter)(豐度均>53%)，其次為乳桿菌屬(Lactobacillus)，克雷伯氏桿菌屬(Klebsiella)，沙雷氏菌屬(Serratia)，乳球菌屬(Lactococcus)，泛菌屬(Pantoea)，檸檬酸桿菌屬(Citrobacter)，拉烏爾菌屬(Raoultella)，腸球菌屬(Enterococcus)，沙門(mén)氏菌屬(Salmonella)，梭菌屬(Clostridium)。試驗(yàn)組優(yōu)勢(shì)微生物為乳桿菌屬，其次為腸桿菌屬，其他菌屬含量均低于對(duì)照組，這表明添加乳桿菌可提高乳桿菌屬的豐度，降低腸桿菌屬及其他菌屬的豐度。由圖2可知，前兩個(gè)主成分分別解釋了總變量的97.9%和1.3%，兩組間距離較遠(yuǎn)且組內(nèi)相近，這表明兩組間細(xì)菌組成有顯著區(qū)別。添加植物乳桿菌可以顯著的改變青貯微生物組成。

表1 低水分粳稻青貯發(fā)酵過(guò)程揮發(fā)性脂肪酸生成量 Table 1 Volatile fatty acids content in low moisture rice stalk ensiling (μmol·g-1 FM)

注：同列不同小寫(xiě)字母表示數(shù)值差異顯著(P<0.05)。CS：對(duì)照組; SS：試驗(yàn)組; s.e.m：標(biāo)準(zhǔn)誤。下同。

Note:The values within column with different letters indicate different significantly (P<0.05). CS: Control group; SS: Treatment group; s.e.m: Standard error of mean. The same below.

表2 低水分粳稻青貯過(guò)程中細(xì)菌的操作分類(lèi)單元數(shù)和α多樣性指數(shù) Table 2 OTU number and α-diversity index in low moisture rice stalk ensiling

2.3 低水分稻秸青貯微生物與VFA互作關(guān)系

青貯過(guò)程中微生物與揮發(fā)性脂肪酸互作關(guān)系如圖3所示，乳桿菌屬表現(xiàn)出與乙酸正相關(guān)，戊酸負(fù)相關(guān)，同時(shí)與腸桿菌屬、檸檬酸桿菌屬、芽孢桿菌屬(Bacillus)、日溝維腸桿菌屬(Pluralibacter)、乳球菌屬、魏斯氏菌屬(Weissella)等6屬微生物呈負(fù)相關(guān)，這些微生物均表現(xiàn)出與丙酸、正丁酸、異丁酸、正戊酸、異戊酸其中2或3種VFA正相關(guān)。乳球菌屬、厭氧桿菌屬(Anaerobacter)、腸球菌屬、梭菌屬均表現(xiàn)出與丙酸、正丁酸、異戊酸正相關(guān);戊酸與氣球菌屬(Aerococcus)、芽孢桿菌屬、檸檬酸桿菌屬、梭菌屬、腸桿菌屬、歐文氏菌屬(Erwinia)、哈夫尼菌屬(Hafnia)、克雷伯氏菌屬、歐美楊潰瘍病菌屬(Lonsdalea)、類(lèi)諾卡菌屬(Nocardioides)、泛菌屬、日溝維腸桿菌屬、沙門(mén)氏菌屬、沙雷氏菌屬、特布爾西氏菌屬(Trabulsiella)等15種微生物菌屬表現(xiàn)出正相關(guān)。腸桿菌屬、芽孢桿菌屬、檸檬酸桿菌屬、勒克氏菌屬(Leclercia)、日溝維腸桿菌屬等5屬微生物與乙酸表現(xiàn)出負(fù)相關(guān)；魏斯氏菌屬表現(xiàn)出與丙酸、異丁酸正相關(guān)。

圖1 低水分粳稻青貯過(guò)程中微生物組成豐度Fig.1 The relative abundance of bacterial community in low moisture rice stalk ensiling

圖2 CS，SS處理組微生物組成主成分分析(PCA)Fig.2 Microbial structure PCA analysis in CS and SS group P1代表第一主成分，P2代表第二主成分。P1 presents the first principal component，P2 presents the second principal component.

3 討論

我國(guó)農(nóng)副秸稈資源豐富，東北地區(qū)作為我國(guó)主要糧食種植區(qū)之一，其稻秸年產(chǎn)量約為1.89億t[13]，但對(duì)秸稈綜合利用的不足導(dǎo)致大量秸稈被堆放在田間或隨意焚燒，對(duì)空氣造成嚴(yán)重污染。自然風(fēng)干后的稻秸是一種劣質(zhì)的粗飼料，即使反芻動(dòng)物也很難加以分解利用，這也是制約稻秸作為動(dòng)物粗飼料的主要因素，而經(jīng)過(guò)加工處理后的秸稈，可提高反芻動(dòng)物的采食量和消化率[14]。其中生物法加工秸稈飼料因其可較好的保留秸稈營(yíng)養(yǎng)價(jià)值且延長(zhǎng)其保存時(shí)間等優(yōu)點(diǎn)已在我國(guó)畜牧生產(chǎn)中普遍推廣使用[15]。秋收后，稻秸多經(jīng)暴曬，水分含量較低，僅適宜制作低水分青貯。低水分青貯因其水分較低，糖分較少等原因多使用添加劑提高青貯效果，其中添加乳酸菌可克服原料本身附著乳酸菌少等缺點(diǎn)，加速青貯過(guò)程，提高發(fā)酵品質(zhì)[16-17]。

圖3 低水分粳稻青貯微生物與VFA互作關(guān)系Fig.3 Co-occurrence network analysis among microbial populations and contents of VFA in low moisture rice stalk silage 圖中藍(lán)色方塊代表微生物種屬，綠色方塊代表?yè)]發(fā)性脂肪酸種類(lèi)。每對(duì)互作關(guān)系(實(shí)線為正相關(guān)r>0.6，虛線為負(fù)相關(guān)r<0.6)P值均小于0.05。Colored nodes represent bacterial population (blue), VFAs (green). Each co-occurring pair has an absolute Spearman rank correlation above 0.6 [Solid line: Positive correlation (r>0.6); Dotted line: Negative correlation (r<0.6)] with significance level under 0.05 level.

本試驗(yàn)中，青貯60 d后植物乳桿菌添加組與對(duì)照組相比，處理組pH值顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，且干物質(zhì)、粗蛋白、水溶性碳水化合物含量均有顯著提高(P<0.05)，同時(shí)氨態(tài)氮含量顯著降低(P<0.05)，而中性洗滌纖維、酸性洗滌纖維、粗脂肪和粗灰分含量無(wú)顯著差異(P>0.05)[18]，這表明添加植物乳桿菌可以降低青貯干物質(zhì)、粗蛋白和水溶性碳水化合物的損耗，直接提高低水分粳稻青貯的發(fā)酵品質(zhì)。青貯過(guò)程中，揮發(fā)性脂肪酸的生成受微生物直接影響。微生物通過(guò)利用青貯原料中的水溶性碳水化合物生成揮發(fā)性脂肪酸。試驗(yàn)組各種揮發(fā)性脂肪酸生成量均低于對(duì)照組，這與前人的試驗(yàn)結(jié)果一致[19-20]。添加乳酸菌可以抑制青貯過(guò)程中各種好氧腐敗菌，降低營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的損失。本試驗(yàn)中，兩組乙酸含量均表現(xiàn)逐漸累積，這與劉晗璐[21]使用禾本科牧草青貯的試驗(yàn)結(jié)果一致，導(dǎo)致這種結(jié)果的原因可能是在青貯中可以分解利用乙酸的微生物種類(lèi)較少，數(shù)量較低。揮發(fā)性脂肪酸雖然可作為反芻動(dòng)物的直接供能物質(zhì)，被瘤胃直接吸收利用，但從青貯窖到動(dòng)物食槽的距離過(guò)長(zhǎng)，或長(zhǎng)期堆放在食槽內(nèi)易損失，這浪費(fèi)了青貯的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，且好氧腐敗菌在生成揮發(fā)性脂肪酸的過(guò)程往往伴隨大量粗蛋白、水溶性碳水化合物的損失[12]。因此，添加乳酸菌降低揮發(fā)性脂肪酸的生成可保留更多的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。

本試驗(yàn)中，添加植物乳桿菌降低了青貯過(guò)程中細(xì)菌的多樣性且青貯過(guò)程中含量較高的菌門(mén)等結(jié)果與前人的試驗(yàn)結(jié)果是一致的[22]，這說(shuō)明低水分青貯的微生物在菌門(mén)組成上與普通青貯一樣，多由厚壁菌門(mén)和變形菌門(mén)主導(dǎo)的，但對(duì)照組變形菌門(mén)所占豐度最高，變形菌門(mén)是革蘭氏陰性細(xì)菌，是細(xì)菌中最大的一門(mén)，包括很多病原菌，如大腸桿菌(Escherichiacoli)、沙門(mén)氏菌、弧菌(Vibrio)和螺桿菌(Helicobacterpylori)等種類(lèi)[10]，因此常規(guī)手段制作的低水分粳稻青貯可能對(duì)飼喂動(dòng)物的健康造成嚴(yán)重影響，而外源添加植物乳桿菌不僅可提高青貯的發(fā)酵品質(zhì)，還可增加低水分青貯飼料的安全性。添加植物乳桿菌可以降低青貯pH值，抑制其他微生物繁殖從而降低青貯細(xì)菌的多樣性。

Cai等[23]分析了不同時(shí)期水稻青貯中分離到的161株乳酸菌，將這些菌株主要分類(lèi)為乳桿菌屬、乳球菌屬、明串珠菌屬、腸球菌屬、片球菌屬(Pediococcus)和魏斯氏菌屬。本研究測(cè)序結(jié)果中也分別檢測(cè)到了這6屬乳酸菌，本試驗(yàn)中優(yōu)勢(shì)乳酸菌屬為乳桿菌屬，乳桿菌屬在青貯過(guò)程中起到的重要作用已被多次證明[11,24-25]。對(duì)照組與處理組均存在腸桿菌屬，且對(duì)照組優(yōu)勢(shì)微生物為腸桿菌屬，Redford等[26]研究發(fā)現(xiàn)在作物生長(zhǎng)環(huán)境中，腸桿菌屬均為優(yōu)勢(shì)微生物種類(lèi)；McGarvey等[3]研究發(fā)現(xiàn)腸桿菌屬在紫花苜蓿(Medicagosativa)青貯前期為優(yōu)勢(shì)微生物，但隨著青貯時(shí)間的延長(zhǎng)其豐度逐漸降低。本研究中，青貯原料為粳稻秸稈，中空，難以壓實(shí)，為青貯好氧菌繁殖階段提供了較多的氧氣，利于原料附著的腸桿菌屬的繁殖，并進(jìn)入了以腸桿菌屬為優(yōu)勢(shì)菌主導(dǎo)的穩(wěn)定期，因?yàn)榈退智噘A對(duì)原料糖分含量及最終的pH值高低要求不高，所以本試驗(yàn)對(duì)照組以腸桿菌為優(yōu)勢(shì)菌屬的粳稻青貯并不能定義為失?。欢囼?yàn)組在青貯初期接種大量乳桿菌利用原料中的可溶性糖迅速繁殖，產(chǎn)生大量乳酸，抑制其他種屬微生物的繁殖，進(jìn)入了以乳桿菌屬為主的發(fā)酵穩(wěn)定期。青貯飼料中的腸桿菌盡管不被認(rèn)為屬于致病菌，但因其會(huì)與乳酸菌競(jìng)爭(zhēng)性利用水溶性碳水化合物，并同時(shí)降解蛋白質(zhì)，產(chǎn)生毒素生物胺，既影響青貯口味又阻礙青貯飼料pH的降低；另外在青貯環(huán)境下腸道細(xì)菌還能將硝酸鹽轉(zhuǎn)化為亞硝酸鹽[10]。因此，添加乳桿菌對(duì)改善低水分粳稻秸稈青貯微生物組成，提高發(fā)酵品質(zhì)有重要意義。

前人研究發(fā)現(xiàn)青貯中豐度占比前十的細(xì)菌屬(種)主要有片球菌、類(lèi)芽孢桿菌(Paenibacillus)、嗜菌屬(Variovorax)、斯瓦米納坦桿菌屬(Swaminathania)、黃桿菌屬(Flavobacterium)、鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)、假單胞菌屬微小桿菌(Pseudomonasexiguobacterium)、根瘤菌屬(Rhizobium)、不動(dòng)桿菌屬鞘氨醇菌(Sphingomonaspaucimobilis)、布赫納氏菌屬(Buchnera)、魏斯氏菌、乳桿菌屬、薄層菌屬(Hymenobacter)和歐文氏菌屬等[10,27]。在本研究中，豐度占前十的有腸桿菌屬、乳桿菌屬、克雷伯氏菌、沙雷氏菌、乳球菌屬、泛菌屬、檸檬酸桿菌屬、拉烏爾菌屬、片球菌屬、沙門(mén)氏菌屬。其中克雷伯氏菌和沙門(mén)氏菌屬于致病菌[28-29]，泛菌屬、沙雷氏菌屬和腸桿菌屬可以產(chǎn)生對(duì)動(dòng)物體有害的組胺[30]，而處理組中以上菌屬豐度均低于對(duì)照組，這表明添加乳桿菌可抑制其他微生物的繁殖，并提高青貯飼料的安全性。因此，添加外源乳桿菌可以改變低水分青貯的微生物組成，提高其發(fā)酵品質(zhì)，使其達(dá)到常規(guī)青貯的水平。

大量國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)均報(bào)道了微生物與VFA互作關(guān)系，Wang等[31]發(fā)現(xiàn)瘤胃VFA濃度與反芻獸月形單胞菌(Selenomonasruminantium)和埃氏巨球形菌(Megasphaeraeldenii)的數(shù)量相關(guān)。Carberry等[32]基于變性梯度凝膠電泳發(fā)現(xiàn)普雷沃氏菌(Prevotellaspp.)與異丁酸和異戊酸的濃度呈負(fù)相關(guān)。Mao等[33]采用454測(cè)序平臺(tái)分析了奶牛糞便中細(xì)菌區(qū)系和VFAs濃度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)糞便中短鏈揮發(fā)性脂肪酸和支鏈揮發(fā)性脂肪酸分別與不同的菌群相關(guān)。但顯有研究專(zhuān)注于青貯過(guò)程中，微生物與VFA互作聯(lián)系。在之前結(jié)果中，添加乳桿菌可以減少揮發(fā)性脂肪酸的生成，而互作關(guān)系圖中乳桿菌屬與腸桿菌屬、檸檬酸桿菌屬、芽孢桿菌屬、日溝維腸桿菌屬、乳球菌屬、魏斯氏菌屬等微生物呈負(fù)相關(guān)，這些微生物均表現(xiàn)出與2或3種VFA正相關(guān)，這為試驗(yàn)中添加乳桿菌減少VFA的生成量的結(jié)果提供了新的解釋思路，由于乳桿菌抑制了這6屬微生物的數(shù)量，從而影響了青貯揮發(fā)性脂肪酸的生成，乳桿菌在青貯發(fā)酵過(guò)程中，可以利用底物生成乳酸，乳酸的大量生成降低了青貯pH值，從而抑制了一些產(chǎn)揮發(fā)性脂肪酸的微生物。乳酸菌分為同型發(fā)酵乳酸菌和異型發(fā)酵乳酸菌，其中同型發(fā)酵乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)物為乳酸，而異型發(fā)酵乳酸菌可利用乳酸生成乙酸[34]，如布氏乳桿菌(Lactobacillusbuchneri)等，這解釋了乳桿菌屬與乙酸正相關(guān)的結(jié)果。腸桿菌屬、芽孢桿菌屬、檸檬酸桿菌屬、勒克氏菌屬、日溝維腸桿菌屬與乙酸分析為負(fù)相關(guān)，其原因可能是乙酸具有較強(qiáng)的抑菌效果[35]；試驗(yàn)分析得出乳桿菌屬與腸桿菌屬、芽孢桿菌屬、檸檬酸桿菌屬、日溝維腸桿菌屬負(fù)相關(guān)，這種結(jié)果的原因可能與乳酸菌生成乳酸導(dǎo)致pH值的降低有關(guān)，也可能與乳桿菌屬與乙酸含量正相關(guān)，同時(shí)乙酸與這4屬微生物負(fù)相關(guān)的結(jié)果有關(guān)，由于異型發(fā)酵乳桿菌對(duì)乙酸的生成有促進(jìn)作用及乙酸的抑菌效果導(dǎo)致這樣的互作關(guān)系?；プ麝P(guān)系圖中22屬微生物都分析出與除乙酸外其他VFA的正相關(guān)，應(yīng)與這些微生物利用水溶性碳水化合物后發(fā)酵產(chǎn)物有關(guān)，但在這些微生物中，氣球菌屬[36]、腸桿菌屬[29]、歐文氏菌屬[30]、哈夫尼菌屬[30]，克雷伯氏菌屬[28]、歐美楊潰瘍病菌屬[37]、類(lèi)諾卡氏屬[38]、泛菌屬[30]、日溝維腸桿菌屬[39]、沙門(mén)氏菌屬[29]、沙雷氏菌屬[30]、特布爾西氏菌屬均為致病菌、條件致病菌或可產(chǎn)生對(duì)動(dòng)物體有害的物質(zhì)[28-30,36-40]。明串珠菌屬，魏斯氏菌屬，芽孢桿菌屬和乳酸球菌屬等屬于益生菌[41]，但均表現(xiàn)與乳桿菌屬負(fù)相關(guān)，其中明串珠菌屬、魏斯氏菌屬和乳酸球菌屬均屬于乳酸菌，耐酸性更強(qiáng)的乳酸菌在青貯過(guò)程中會(huì)逐漸成為優(yōu)勢(shì)乳酸菌，乳桿菌耐酸性更強(qiáng)，在pH值較低情況下，仍可繁殖，但其他種類(lèi)乳酸菌因pH值過(guò)低受到抑制。乳桿菌屬豐度與戊酸含量呈負(fù)相關(guān)，這也驗(yàn)證了本試驗(yàn)中外源添加乳桿菌通過(guò)各種直接或間接影響抑制產(chǎn)戊酸微生物數(shù)量的試驗(yàn)結(jié)果。

4 結(jié)論

添加植物乳桿菌后可以顯著減少低水分青貯的丙酸、正丁酸、異丁酸、正戊酸和異戊酸的生成量，并提高乙酸生成量，并可抑制以腸桿菌屬為主的多種青貯無(wú)益微生物，降低微生物多樣性，增加厚壁菌門(mén)，乳桿菌屬的豐度，抑制變形菌門(mén)，腸桿菌屬的豐度。微生物組成變化直接影響青貯揮發(fā)性脂肪酸的生成，兩者間的互作關(guān)系為以后揭示微生物在青貯過(guò)程中的重要作用提供了更多的基礎(chǔ)。