朱 琳 付曉丹 李 麗 韓振蓮 牟海津

(中國海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 青島 266003)

蝦殼是凡納濱對蝦(Litopenaeus vannamei)加工過程中的副產(chǎn)物，大部分蝦殼被填埋處理，造成了資源的浪費。凡納濱對蝦蝦殼可作為生產(chǎn)殼聚糖的原料(Al Sagheeret al,2009)。目前，工業(yè)中以蝦殼為原料采用HCl和NaOH制備殼聚糖，生產(chǎn)過程產(chǎn)生的廢水中含有高濃度的Cl-和Na+，回收價值低，造成資源浪費和環(huán)境污染。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展和生態(tài)文明建設(shè)的要求，人們對減少環(huán)境污染的需求越來越高，因此，殼聚糖的清潔化生產(chǎn)及蝦殼的高值化利用成為亟待解決的問題。

殼寡糖(Chitooligosaccharides)是殼聚糖降解后的產(chǎn)物，具有促進種子萌發(fā)、幼苗生長和提高植物抗病性等功能(袁建平等,2011; 張洪艷等,2011)。殼寡糖的生物活性與脫乙酰度和分子量密切相關(guān)(Daset al,2015)。目前，關(guān)于殼寡糖分子量對生物活性的影響已經(jīng)進行了大量的研究(扈學(xué)文等,2007)，然而，殼寡糖脫乙酰度與其生物活性之間的關(guān)系卻鮮有報道。 本文以凡納濱對蝦蝦殼為原料，研究了不同脫乙酰度殼寡糖的綠色生產(chǎn)工藝，并探究了殼寡糖脫乙酰度對煙草花葉病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)的影響，期望為實現(xiàn)凡納濱對蝦蝦殼資源的高值化綠色應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗原料：凡納濱對蝦蝦殼。供試植物：烤煙MSK326品種，由國家農(nóng)作物種質(zhì)資源平臺煙草種質(zhì)資 源子平臺(National Infrastructure for Crop Germplasm Resources(Tobacco,Qingdao))提供，其保存單位為中國海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院。供試毒源：煙草花葉病毒(TMV)，由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所提供。

1.2 實驗方法

1.2.1 甲殼素的制備 預(yù)處理：將凡納濱對蝦蝦殼洗凈、烘干和粉碎后，過100目網(wǎng)篩。

脫鹽：稱取一定量蝦殼，按物料比1∶6，加入3% H3PO4，室溫攪拌30 min，沉淀用水洗至中性，烘干，測定樣品中灰分含量，計算脫鹽率。

脫蛋白：脫鹽后的產(chǎn)物按物料比1∶6，加入3% KOH，70℃攪拌30 min，沉淀用水洗至中性，烘干，測定上清液中蛋白質(zhì)含量，計算脫蛋白率。

1.2.2 不同脫乙酰度殼聚糖和殼寡糖的制備 不同脫乙酰度殼聚糖的制備：稱取一定質(zhì)量的甲殼素，置于聚四氟乙烯坩堝中，按物料比1∶15，加入45% KOH溶液，微波功率為600 W，分別反應(yīng)6、7、8和8.5 min，反應(yīng)結(jié)束后，沉淀水洗至中性，溶于2% HAC，4800 r/min離心15 min，將上清液pH調(diào)至中性，析出的沉淀即為殼聚糖。烘干后，采用雙突躍電位法測定殼聚糖脫乙酰度(賈之慎等,2001)。

殼寡糖的制備：殼聚糖濃度2%，加入1% H2O2，170 r/min水浴搖床中50℃反應(yīng)6 h，反應(yīng)結(jié)束后，用1 mol/L KOH調(diào)節(jié)反應(yīng)液pH至中性，于4800 r/min離心15 min，上清液旋蒸濃縮、凍干。采用高效液相色譜法測定殼寡糖分子量，色譜柱：TSK-Gel G4000 PWXL，柱溫為25℃，流速為0.4 ml/min; 流動相：0.1 mol/L NaNO3+0.01 mol/L NaH2PO4緩 沖 溶 液(pH=7.0)；進樣體積為20 μl。

1.2.3 脫鹽率和脫蛋白率的計算 脫鹽率計算公式如下：

式中，AO為原始樣品中的灰分含量(g/g)，AP為脫鹽處理后樣品中的灰分含量(g/g)，O和P分別為原始樣品和磷酸處理后樣品的干重(g)。

脫蛋白率計算公式如下：

式中，PR為原始樣品中的蛋白質(zhì)含量(g)，PS為脫蛋白處理后上清液中的蛋白質(zhì)含量(g)。

1.2.4 不同脫乙酰度殼寡糖抗TMV效果分析

1.2.4.1 殼寡糖對TMV體外鈍化的作用 將帶有TMV的煙草葉片中按1∶40加入磷酸鹽緩沖溶液(pH=7.2)進行研磨，10000 r/min離心5 min后，取上清液與濃度為100 μg/ml不同脫乙酰度殼寡糖溶液(COS1、COS2、COS3和COS4)按1∶1進行混合，置于25℃水浴中反應(yīng)30 min，接種于MSK326煙草葉片上，每株接種3片，重復(fù)3次，待植株呈病癥后，取病葉進行Evans blue染色(劉楠等,2011; Singhet al,2014)，觀察病斑情況。

1.2.4.2 殼寡糖對病毒復(fù)制作用的影響 選用長勢均一、3～4片真葉期的普通煙苗供試。采用葉圓片法測定殼寡糖對病毒在寄主內(nèi)復(fù)制作用的影響(申莉莉等,2007)，將TMV接種于健康煙草MSK326上6 h后，取直徑為12 mm的圓片葉，分別在蒸餾水和濃度為50 μg/ml不同脫乙酰度殼寡糖溶液(COS1、COS2、COS3和COS4)中進行漂浮處理48 h，再將圓片洗凈、研磨，10000 r/min離心5 min，然后接種于MSK326煙草葉片上，每株接種3片，重復(fù)3次，待植株呈病癥后，取病葉進行Evans blue染色，觀察病斑情況。

1.2.4.3 殼寡糖對煙草防御酶的影響 選用3～4片真葉期、長勢均一的普通健康煙苗，用50 μg/ml不同脫乙酰度殼寡糖溶液(COS1、COS2、COS3和COS4)和蒸餾水(CT)葉面噴霧誘導(dǎo)供試煙苗的下部第2片真葉，每組重復(fù)3次，殼寡糖誘導(dǎo)24 h后，采收處理葉的上位葉，裝入自封袋中，-80℃冰箱中保存。參照文獻中的方法測定過氧化氫酶(CAT)(張志良,2003)、過氧化物酶(POD)(高俊鳳,2000)、多酚氧化酶(PPO)(譚興杰等,1984)和苯丙氨酸解氨酶(PAL)(薛應(yīng)龍,1985)的活性。在處理葉的上位葉片，采用常規(guī)汁液摩擦接種法接種 TMV，觀察煙草植株的病癥表現(xiàn)。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用Microsoft Excel 2010和SPSS軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析，組間差異的判定選用t-檢驗方法，P＜0.05表示有顯著性差異，P＜0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 不同脫乙酰殼寡糖的制備

以凡納濱對蝦蝦殼為原料，采用H3PO4和KOH制備甲殼素，測得其脫鹽率和脫蛋白率分別為(94.04 ±0.52)%和(85.65±1.06)%，達到工業(yè)級甲殼素的標(biāo)準(zhǔn)。甲殼素與45% KOH混合后，于微波功率600 W條件下，反應(yīng)6、7、8和8.5 min后，制得脫乙酰度分別為63.79%、72.12%、79.34%和88.15%的殼聚糖，對其氧化降解后，通過高效液相色譜法測得殼寡糖分子量分別為1502、1515、1523和1509 Da。因此，COS1、COS2、COS3和COS4分別為脫乙酰度63.79%、72.12%、79.34%和88.15%，分子量為1500 Da左右的殼寡糖。

2.2 普通煙草抗病性表現(xiàn)

用不同脫乙酰度的殼寡糖噴施煙草葉片后接種TMV，觀察普通煙的癥狀。結(jié)果顯示，空白組(蒸餾水誘導(dǎo))植株在接種5 d時出現(xiàn)輕花葉，接種9 d后出現(xiàn)重花葉，并且植株矮小，葉片狹窄，生長緩慢。不同脫乙酰度殼寡糖誘導(dǎo)后的植株病癥表現(xiàn)不同，COS1誘導(dǎo)后病癥出現(xiàn)時間和程度與空白組沒有明顯區(qū)別；COS2、COS3和COS4誘導(dǎo)后植株在接種7 d時出現(xiàn)輕花葉，接種13 d后出現(xiàn)重花葉，其中，COS3和COS4誘導(dǎo)后的植株患病程度最輕，說明這2種脫乙酰度的殼寡糖誘導(dǎo)煙草產(chǎn)生抗病性的效果最好。

2.3 不同脫乙酰度殼寡糖對TMV體外鈍化的作用

不同脫乙酰度的殼寡糖對TMV進行體外處理接種MSK326煙草后Evans blue染色結(jié)果如圖1所示，TMV經(jīng)殼寡糖處理后病葉中藍色染色區(qū)域較空白處理組小，隨著殼寡糖脫乙酰度的升高，病葉中藍色染色區(qū)域隨之減少，說明經(jīng)殼寡糖處理能減輕煙草感染TMV的程度，并且不同脫乙酰度的殼寡糖對TMV的體外鈍化程度不同，COS4對TMV的體外鈍化作用最好。

2.4 不同脫乙酰度殼寡糖對TMV復(fù)制作用的影響

不同脫乙酰度殼寡糖對TMV復(fù)制的作用結(jié)果如圖2所示，COS1和COS2處理后的煙草葉與空白組病葉中藍色染色區(qū)域沒有顯著差異，說明COS1和COS2對TMV在寄主內(nèi)的復(fù)制沒有影響；而當(dāng)COS3和COS4處理后病葉中藍色染色區(qū)域較空白組小，說明COS3和COS4能抑制TMV在寄主內(nèi)的復(fù)制作用。

2.5 不同脫乙酰度殼寡糖對煙草防御酶的影響

不同脫乙酰度殼寡糖對煙草誘導(dǎo)24 h后煙草葉片中過氧化氫酶活性結(jié)果如圖3所示。COS1誘導(dǎo)煙草后，煙草葉片中過氧化氫酶活性低于空白對照組(蒸餾水處理)；COS2誘導(dǎo)后，葉片中過氧化氫酶活性略高于空白對照組，但二者之間沒有顯著性差異。當(dāng)殼寡糖脫乙酰度大于72.12%時，誘導(dǎo)煙草后過氧 化氫酶活性均高于空白對照組，并且COS3誘導(dǎo)煙草后過氧化氫酶活性最高。以上結(jié)果表明，COS3和COS4誘導(dǎo)煙草后能提高過氧化氫酶活性，而COS3誘導(dǎo)后過氧化氫酶活性最高(P＜0.01)。

圖1 不同脫乙酰度殼寡糖對TMV體外鈍化的作用 Fig.1 The effects on inactivating TMV in vitro by induction of chitooligosaccharides with different DDAs

圖2 不同脫乙酰度殼寡糖對TMV復(fù)制作用的影響 Fig.2 The effects on multiplication of TMV by induction of chitooligosaccharides with different DDAs

圖3 不同脫乙酰度殼寡糖誘導(dǎo)對煙草葉片中 過氧化氫酶活性的影響 Fig.3 The effects on activity of CAT in tabacco leaves by induction of chitooligosaccharides with different DDAs

由圖4可以看出，COS3和COS4誘導(dǎo)煙草后，煙草葉片中過氧化物酶活性均高于其他處理組，COS4處理煙草后過氧化物酶活性最高。COS1誘導(dǎo)煙草后，過氧化物酶活性低于空白處理組，而COS2處理組的過氧化物酶活性與空白處理組沒有顯著性差異。以上結(jié)果表明，COS3和COS4誘導(dǎo)煙草能顯著提高葉片中過氧化物酶的活性(P＜0.05)。

圖4 不同脫乙酰度殼寡糖誘導(dǎo)對煙草葉片中 過氧化物酶活性的影響 Fig.4 The effects on activity of POD in tabacco leaves by induction of chitooligosaccharides with different DDAs

由圖5可知，COS1和COS2處理組中多酚氧化酶的活性均低于空白對照組，而COS3和COS4處理組的多酚氧化酶活性均高于空白對照組，并且COS4誘導(dǎo)煙草后葉片中的多酚氧化酶活性顯著高于空白對照組。以上結(jié)果表明，COS4誘導(dǎo)煙草能顯著提高葉片中多酚氧化酶的活性(P＜0.01)。

從圖6可以看出，不同脫乙酰度殼寡糖誘導(dǎo)煙草后，COS1和COS2處理組中苯丙氨酸解氨酶活性雖略高于空白對照組，但與空白對照組之間沒有顯著性差異。而COS3和COS4處理組中苯丙氨酸解氨酶的活性均低于空白對照組，這說明殼寡糖脫乙酰度與苯丙氨酸解氨酶活性可能不存在相關(guān)性。

圖5 不同脫乙酰度殼寡糖誘導(dǎo)對煙草葉片中 多酚氧化酶活性的影響 Fig.5 The effects on activity of PPO in tabacco leaves by induction of chitooligosaccharides with different DDAs

圖6 不同脫乙酰度殼寡糖誘導(dǎo)對煙草葉片中 苯丙氨酸解氨酶活性的影響 Fig.6 The effects on activity of PAL in tabacco leaves by induction of chitooligosaccharides with different DDAs

3 討論與結(jié)論

3.1 殼寡糖的清潔化生產(chǎn)

凡納濱對蝦是目前世界養(yǎng)殖產(chǎn)量最高的三大蝦種之一(李曉麗等,2017)。蝦殼中的甲殼素與蛋白質(zhì)交錯形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，在交錯的網(wǎng)絡(luò)中還含有以鈣鹽為主的礦物鹽沉淀(Saitoet al,2000)。蛋白質(zhì)和鈣鹽的存在會降低甲殼素的生物活性，需要通過脫鹽和脫蛋白途徑制得純度較高的甲殼素。已有研究表明，采用0.5～1.5 mol/L HCl和1～5 mol/L NaOH處理蝦殼，脫鹽率達到90%以上(Youneset al,2015)，而脫蛋白率可達到80%以上(Hddeet al,2006)。目前，工業(yè)制備殼聚糖主要為傳統(tǒng)加熱法，將甲殼素與45%～60% NaOH混合后，于105～130℃下加熱反應(yīng)60～180 min(Viarsaghet al,2010; Yenet al,2009)。以上生產(chǎn)過程雖然能制得達到工業(yè)級標(biāo)準(zhǔn)的殼聚糖，但HCl和NaOH的添加使生產(chǎn)廢水中含有大量的氯元素和鈉元素，易導(dǎo)致土壤鈉質(zhì)化(李小剛等,2004)，影響作物生長。本研究選用H3PO4和KOH分別對蝦殼進行脫鹽、脫蛋白和脫乙酰處理，其脫鹽和脫蛋白效果與傳統(tǒng)化學(xué)法效果一致。而且與傳統(tǒng)化學(xué)方法相比，采用H3PO4和KOH處理蝦殼，生產(chǎn)過程中產(chǎn)生的廢水含有植物生長需要的N、P和K元素，該廢水可回收后作為肥料應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，減少生產(chǎn)過程中產(chǎn)生的環(huán)境污染。此外，采用H2O2氧化降解殼聚糖，降解產(chǎn)物為殼寡糖、氧氣和水，對環(huán)境無污染。可見，本研究不同脫乙酰度殼寡糖制備方法實現(xiàn)了殼聚糖的清潔化生產(chǎn)和凡納濱對蝦蝦殼的高值化利用。

3.2 不同脫乙酰度殼寡糖對煙草抗TMV的影響

殼寡糖作為自然界唯一的陽離子寡糖，可作為飼料添加劑和植物誘抗劑應(yīng)用于動植物生長過程中(蔡勝昌等,2015; 張洪艷等,2011)。脫乙酰度是影響殼寡糖生物活性的因素之一，目前，已有研究報道，殼寡糖的脫乙酰度改變對種子萌發(fā)(Lanet al,2016)和植物生長(劉啟順等,2012)等生理過程有一定的影響。本研究表明，不同脫乙酰度的殼寡糖對煙草抗TMV的影響有所不同，脫乙酰度為63.79%的殼寡糖誘導(dǎo)植株患病程度與空白組沒有明顯區(qū)別，而脫乙酰度為79.34%和88.15%的殼寡糖誘導(dǎo)后的植株具有較好的抗病性，植株患病程度最輕。

3.3 不同脫乙酰度殼寡糖對TMV體外鈍化和復(fù)制的作用

殼寡糖對真菌類病菌具有廣譜的抑制作用(Alejandrobet al,2008)，并且對植物病原真菌、細菌和病毒有體外抑制作用(趙小明等,2006)。當(dāng)病毒在植物體外受到寡糖抑制時，一定程度上會阻礙病毒侵入植株內(nèi)，從而減輕植物患病程度。本研究表明，不同脫乙酰度的殼寡糖對TMV進行體外處理，接種煙草葉片后植株的患病程度不同，脫乙酰度為88.15%的殼寡糖對TMV的體外鈍化作用最好，說明高脫乙酰度的殼寡糖可以通過對TMV的體外鈍化阻礙病毒對寄主的侵染，從而減輕植株的患病程度。TMV在侵入植物進行復(fù)制后，將病毒運輸?shù)街参锔鱾€部位引起系統(tǒng)性侵染(張微,2010)。本研究表明，脫乙酰度為79.34%和88.15%的殼寡糖能抑制TMV在寄主內(nèi)的復(fù)制作用，這可能是由于以上2種脫乙酰度的殼寡糖抑制了病毒的復(fù)制，使病毒被限制在最初的侵染點，從而避免植物遭受系統(tǒng)性侵染。

3.4 不同脫乙酰度殼寡糖對煙草防御酶的影響

植物體內(nèi)防御酶活性的變化與其抗病性相關(guān)，如過氧化氫酶、過氧化物酶、多酚氧化酶和苯丙氨酸解氨酶。過氧化氫酶與植物體內(nèi)活性氧清除有關(guān)，通過影響活性氧的積累而改變植物的抗病性(宋瑞芳等,2007)；過氧化物酶能有效清除植物內(nèi)源性活性氧，還能促進多酚的氧化(Kushalappaet al,2016)；多酚氧化酶與植物次生代謝產(chǎn)物的生成有密切關(guān)系(郭紅蓮等,2003)；苯丙氨酸解氨酶是苯丙烷類次生代謝途徑中的關(guān)鍵酶和限速酶，與木質(zhì)素的生成和沉積有關(guān)，能有效阻止病原的擴散(馬俊彥等,2007)。本研究表明，脫乙酰度為79.34%和88.15%的殼寡糖誘導(dǎo)煙草后能提高過氧化氫酶、過氧化物酶和多酚氧化酶活性。因此，脫乙酰度為79.34%和88.15%的殼寡糖誘導(dǎo)植株產(chǎn)生抗病性，可能是通過對病毒的體外鈍化作用、抑制病毒在寄主內(nèi)的復(fù)制和提高植物體內(nèi)過氧化氫酶、過氧化物酶和多酚氧化酶活性而實現(xiàn)的。植物抗病性的產(chǎn)生是一個復(fù)雜的生理過程，體外鈍化、病毒復(fù)制和植物防御酶系活性的變化并不能具體說明殼寡糖脫乙酰度與煙草抗病機理的關(guān)系，所以，還需要從基因調(diào)控方面對植物抗病機理進行深入研究。