孫藤芹 汪文俊 梁洲瑞 劉福利 孫修濤 曹 原 王飛久

(1.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院 上海 201306；2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部海洋漁業(yè)可持續(xù)發(fā)展 重點實驗室 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所 青島 266071)

紫菜味道鮮美，營養(yǎng)豐富，具有較高的經(jīng)濟價值，是我國養(yǎng)殖面積最大的大型經(jīng)濟海藻(李曉蕾等,2017)。近年來，隨著養(yǎng)殖需求增加，主產(chǎn)區(qū)養(yǎng)殖海區(qū)飽和，長期密集養(yǎng)殖，加之全球氣候變化、種質(zhì)退化等原因，紫菜在主產(chǎn)區(qū)養(yǎng)殖過程中頻繁出現(xiàn)病爛、生長遲緩、產(chǎn)量大幅下降等問題，我國紫菜養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)受到?jīng)_擊。

一些學(xué)者針對紫菜養(yǎng)殖和育苗過程的病害問題展開了研究。楊銳等(2008)發(fā)現(xiàn)假交替單胞菌(Pseudoalteromonas nigrifaciens)為健康紫菜表面的優(yōu)勢菌，且在周圍海水和病爛紫菜上未分離到該菌。王洪斌等(2011)研究表明，河豚毒素假交替單胞菌(Pseudoalteromonas tetraodonis)可能是條斑紫菜(Pyropia yezoensis)絲狀體黃斑病病原菌。陳國耀等(1999)研究表明，瓊脂降解菌主要附著在紫菜網(wǎng)繩上，可能引起紫菜脫落。閆詠等(2002)研究表明，導(dǎo)致條斑紫菜葉狀體綠斑病的致病菌是檸檬假交替單胞菌(Pseudoalteromonas citrea)。引起紫菜病變的致病菌大多數(shù)為條件致病菌。海洋環(huán)境瞬息萬變，海水環(huán)境中的微生物組成復(fù)雜多變，健康穩(wěn)定的水環(huán)境中微生物群落組成處于動態(tài)平衡，當(dāng)某種或某些因素突然改變打破這種平衡，某一或某些條件致病菌就會在這種失衡的狀態(tài)下迅速繁殖擴增，導(dǎo)致病害暴發(fā)。上述研究主要采用從病爛與健康紫菜藻體上分離、鑒定致病菌或藻際微生物方法展開研究，而針對紫菜養(yǎng)殖海區(qū)水環(huán)境微生物物種組成及群落結(jié)構(gòu)的研究幾乎沒有。

通過培養(yǎng)、分離、鑒定等傳統(tǒng)的方法研究微生物，受培養(yǎng)條件等限制，檢測到的微生物物種較少，尤其對一些低豐度和培養(yǎng)條件特殊的細(xì)菌往往難以檢測到。測序技術(shù)的發(fā)展帶動宏基因組學(xué)的誕生，第2代測序技術(shù)的產(chǎn)生徹底彌補了第1代測序技術(shù)通量低、成本高的缺點，且可實現(xiàn)平行測序、可定量(張丁予等,2016)?；诘?代測序技術(shù)的微生物宏基因組研究方法，可高通量檢測到樣品中幾乎全部微生物，包含一些新物種(蓋珊珊,2016)，能更精確的檢測出海洋水環(huán)境中菌群的組成和數(shù)量。

本研究采用高通量測序技術(shù)對山東長島紫菜養(yǎng)殖海區(qū)表層水環(huán)境中細(xì)菌多樣性進行調(diào)查，以期掌握長島紫菜養(yǎng)殖區(qū)水環(huán)境中的細(xì)菌多樣性分布，通過與鄰近非養(yǎng)殖海區(qū)水環(huán)境中微生物組成的比較，探索紫菜養(yǎng)殖活動對水環(huán)境細(xì)菌多樣性分布的影響，為紫菜養(yǎng)殖病害的預(yù)測及防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集與處理

于2016年12月從山東長島紫菜養(yǎng)殖區(qū)分別采集了近岸區(qū)(CDCNS)、紫菜養(yǎng)殖區(qū)(CDPF)、外海區(qū)(CDCOS)的海水樣品3 L，每組6個重復(fù)?，F(xiàn)場用0.22 μm混合纖維濾膜抽濾海水樣品，濾膜對折后置凍存管于干冰中保存，帶回實驗室，放入-80℃保存。 用塑料水桶或顛倒式采水器采集表層水樣，測量指標(biāo)包括溫度、pH、溶解氧(DO)、鹽度、氨氮(NH4+-N)、磷酸鹽(PO43--P)、硅酸鹽(SiO32--Si)、總懸浮物(TSS)等。

1.2 實驗方法

1.2.1 基于16S rDNA序列的第2代測序與分析

該項工作委托廣州基迪奧生物科技有限公司完成。樣品微生物的提取采用DNA提取試劑盒(HiPureSoil DNA Kits)(Megan，廣州)。DNA的質(zhì)量檢測采用瓊脂糖凝膠電泳法，用帶有Barcode的特異引物對擴增16S rDNA V3+V4區(qū)(引物序列為F：CCTAYGGGRBGCASCAG; R：GGACTACNNGGGTATCTAAT)。PCR擴增產(chǎn)物切膠回收，用Qubit 3.0熒光計進行定量。將純化的擴增產(chǎn)物進行等量混合，連接測序接頭，構(gòu)建測序文庫，進行Hiseq 2500 PE250(Illumina,美國)測序。

對測序得到的原始數(shù)據(jù)進行處理，首先過濾掉低質(zhì)量的序列，得到Clean data。然后，根據(jù)PE reads之間的重疊關(guān)系，將成對雙端Reads拼接為一條序列(Tag)。利用Mothur(v.1.34.0)軟件包對Tag序列進行去冗余處理(Patricket al,2009)，挑選出 Unique tag序列。使用基于Naive Bayesian方法的分類器Rdp classifier工具，對Tag進行物種注釋。為了更好地獲得樣品中物種的多樣性信息，進一步對Tags進行OUT(Operating Taxonomic Unit)聚類，通過KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)數(shù)據(jù)庫進行比對和OTU Pathway注釋。計算Alpha多樣性指數(shù)(Chao、ACE、Shannon和Simpson)與樣品間Bray-Curtis系數(shù)，并根據(jù)Bray-Curtis系數(shù)的計算結(jié)果對樣品進行聚類分析。

1.2.2 環(huán)境因子分析 使用YSI多參數(shù)水質(zhì)分析儀Proplus(美國)現(xiàn)場測定水溫、pH、鹽度、DO，使用AA3連續(xù)流動分析儀(Seal，德國)測定各項營養(yǎng)鹽的濃度。N的測定采用靛酚藍(lán)法，Si的測定采用硅鉬藍(lán)法，P的測定采用抗壞血酸還原磷鉬藍(lán)法(GB/T 12763.4-2007)，檢測限分別為0.04、0.030、0.024 μmol/L。TSS通過稱量過濾前后濾膜的差值計算(GB17378.4-2007)。根據(jù)R語言的皮爾森相關(guān)系數(shù)計算環(huán)境因子與微生物的豐度之間的相關(guān)性。

2 結(jié)果

2.1 長島海區(qū)海水中細(xì)菌組成

對長島海區(qū)海水樣品測序結(jié)果通過KEGG數(shù)據(jù)庫進行比對和OTU Pathway注釋分析，共檢測出細(xì)菌42門。變形細(xì)菌門(Proteobacteria)為整個海區(qū)優(yōu)勢菌，其次為厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、浮霉菌門(Planctomycetes)、放線菌門(Actinobacteria)、SBR1093、疣微菌門(Verrucomicrobia)、廣古菌門(Euryarchaeota)、芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)、綠彎菌門(Chloroflexi)。

長島海區(qū)海水樣品中共檢測出217屬。其中，豐度最高的10個屬分別為噬甲基菌屬(Methylophaga)、鹽單胞菌屬(Halomonas)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、嗜氨菌屬(Ammoniphilus)、交替單胞菌屬(Alteromonas)、海洋粘細(xì)菌屬(Plesiocystis)、南極桿菌屬(Antarctobacter)、共生菌屬(Candidatus)、檸檬酸桿菌屬(Citrobacter)、十八桿菌屬(Octadecabacter)。

2.2 長島海區(qū)水環(huán)境微生物多樣性分析

繪制不同海區(qū)樣品在0.03距離下的Alpha豐富程度表，Chao、ACE和Shannon 3種指數(shù)越大，Simpson指數(shù)越接近于0，表示樣品中的物種越豐富。結(jié)果顯示，長島整個海區(qū)海水微生物多樣性都比較高，其中，以CDCNS的微生物物種組成最豐富，且與其他2個海區(qū)差異明顯(表1)。

表1 樣品Alpha多樣性統(tǒng)計結(jié)果 Tab.1 Statistical results of sample Alpha diversity

2.3 長島海區(qū)海水菌群在各海區(qū)的聚類關(guān)系

根據(jù)在各個分類水平上各海區(qū)樣品OUT數(shù)據(jù)，計算樣品間Bray-Curtis系數(shù)，并根據(jù)Bray-Curtis系數(shù)的計算結(jié)果對樣品進行聚類分析，以判斷在屬分類水平上各樣品的相似性與特異性。CDPF明顯區(qū)分于CDCNS和CDCOS區(qū)，后二者優(yōu)先聚為一組(圖1)。表明CDCNS和CDCOS區(qū)微生物群落結(jié)構(gòu)更為相似，CDPF區(qū)的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)明顯區(qū)別于CDCNS和CDCOS區(qū)。

圖1 不同海區(qū)微生物群落結(jié)構(gòu)的聚類關(guān)系 Fig.1 Cluster of microflora structure

2.4 養(yǎng)殖區(qū)較其他海區(qū)的細(xì)菌物種組成差異

根據(jù)長島海水樣品細(xì)菌物種分類的OTU數(shù)據(jù)繪制熱圖，以展示豐度最高的前20個屬/種在不同區(qū)域間的表達情況(圖2)。聚類結(jié)果與圖1類似，CDCNS 與CDCOS區(qū)優(yōu)先聚在一起。其中，鼠尾菌屬(Muricauda)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、鹽單胞菌屬、赤桿菌屬(Erythrobacter)、海桿菌屬(Marinobacter)、海洋粘細(xì)菌、副球菌屬(Paracoccus)為CDPF區(qū)特異性的優(yōu)勢菌。冰川菌屬(Glaciecola)、共生菌、十八桿菌屬、假魯杰氏菌(Pseudoruegeria)、陸丹氏菌屬(Loktanella)為CDCNS區(qū)特異性的優(yōu)勢菌。嗜氨菌屬在CDCOS區(qū)相對豐度明顯高于其他2個區(qū)域(圖2)。

2.5 典型菌屬與環(huán)境因子的關(guān)聯(lián)性分析

3個區(qū)域海水鹽度、pH、DO、營養(yǎng)鹽等環(huán)境因子結(jié)果見表2。從表2可以看出，CDPF區(qū)的N 含量最低，CDCOS區(qū)最高。同時，整個海區(qū)鹽度較高，尤以CDPF區(qū)鹽度最高。DO和pH呈現(xiàn)由近岸向外海逐漸降低的趨勢，TSS則由近岸向外海逐漸增高。環(huán)境因子與環(huán)境微生物關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)，嗜氨菌屬的分布與N和TSS的空間分布呈正相關(guān)，CDPF區(qū)的嗜氨菌屬豐度最小，CDCOS區(qū)嗜氨菌屬豐度最大。鹽單胞菌屬和海桿菌屬的分布與鹽度具顯著相關(guān)性，CDPF區(qū)鹽單胞菌屬和海桿菌屬含量最多，其他2個海區(qū)鹽單胞菌含量較少(表3)。

圖2 不同海區(qū)屬分類水平的差異 Fig.2 Genus diversity among the three areas

3 討論

紫菜富含蛋白質(zhì)、維生素、礦物質(zhì)和不飽和脂肪酸，具有很高的營養(yǎng)價值，是我國重要的大型經(jīng)濟海藻之一。紫菜養(yǎng)殖面積大，養(yǎng)殖區(qū)域廣，其創(chuàng)造的經(jīng)濟價值占全球大型海藻年總產(chǎn)值的20%(陸勤勤等,2016)。養(yǎng)殖紫菜還兼具修復(fù)近岸海洋環(huán)境的生態(tài)效益。條斑紫菜是我國北方地區(qū)主要養(yǎng)殖海藻品種，近年來，其養(yǎng)殖過程病爛、生長遲緩等問題日趨嚴(yán)重。微生物是環(huán)境重要組成，其組成和結(jié)構(gòu)變化將對養(yǎng)殖 生物的生長產(chǎn)生重要影響。已有研究多從溫度、氣候、種質(zhì)與特定致病菌分離鑒定著手，而缺乏對養(yǎng)殖環(huán)境微生物群落結(jié)構(gòu)特征的解析。

表2 各海區(qū)環(huán)境因子分析 Tab.2 Environmental parameters of the three areas

表3 環(huán)境因子與部分菌屬之間的相關(guān)系數(shù) Tab.3 Correlation between environmental parameters and the abundance of some microorganisms

本研究發(fā)現(xiàn)，山東長島海域豐度最高的細(xì)菌菌群為變形細(xì)菌門、厚壁菌門、擬桿菌門、浮霉菌門、放線菌門、SBR1093、疣微菌門等。付新華等(2017)和白潔等(2009)研究表明，環(huán)境微生物群落因海區(qū)和季節(jié)不同呈動態(tài)變化。對比不同采樣時間，變形菌、擬桿菌、放線菌、浮霉菌等在渤海海洋保護區(qū)典型海域與黃海北部海域也被發(fā)現(xiàn)為主要優(yōu)勢菌，這些菌應(yīng)該是海洋環(huán)境中普遍存在的細(xì)菌門類。疣微菌在秋季的渤海海域也是優(yōu)勢菌門(付新華等,2017)，但白潔等(2009)研究表明，在黃海北部海域水環(huán)境的優(yōu)勢菌組成中未包含該菌，推測疣微菌門可能為渤海海域特有的優(yōu)勢菌。在屬分類水平上，本次調(diào)查海區(qū)發(fā)現(xiàn)217屬，付新華等(2017)調(diào)查的渤海海區(qū)為227屬，具有較好的區(qū)域一致性。然而，本次調(diào)查的長島海域與付新華等(2017)調(diào)查的渤海保護區(qū)在藍(lán)細(xì)菌門豐度上差異很大，這可能跟采樣季節(jié)有關(guān)，本次采樣時間在冬季，而付新華等(2017)采樣時間在秋季，肖天等(2002)研究表明，低溫不利于藍(lán)細(xì)菌生存繁殖。

藻類和微生物群落之間相互利用、相互選擇，在藻類周圍形成特有的微生物群落結(jié)構(gòu)(Fisheret al,1998)。通過聚類分析發(fā)現(xiàn)，長島海域紫菜CDPF的微生物群落結(jié)構(gòu)明顯區(qū)別于相鄰的2個區(qū)域，而相距較遠(yuǎn)的CDCNS和CDCOS區(qū)的微生物群落結(jié)構(gòu)反而更為接近，這說明紫菜養(yǎng)殖確實對環(huán)境中微生物群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了影響。條斑紫菜養(yǎng)殖區(qū)水環(huán)境中特有的優(yōu)勢菌屬包括鼠尾菌屬、假單胞菌屬、鹽單胞菌屬、赤桿菌屬、海桿菌屬、海洋粘細(xì)菌屬、副球菌屬，其中，部分種屬已在不同海區(qū)、不同紫菜樣品的藻際微生物中被證實為優(yōu)勢菌。楊銳等(2008)從山東青島的條斑紫菜葉狀體表面分離得到海桿菌；武洪慶(2012)分別在射陽、連云港和大平三地的條斑紫菜表面分離得到了假單胞菌屬；沈梅麗等(2013)在壇紫菜(Pyropia haitanensis)特有的共附生細(xì)菌中分離到赤桿菌屬和副球菌屬。在不同海區(qū)不同紫菜樣品或紫菜養(yǎng)殖區(qū)中，海桿菌屬、假單胞菌屬、赤桿菌屬和副球菌屬作為優(yōu)勢菌被檢測或分離到，因此，作者推測，它們是典型的紫菜外生細(xì)菌組成，應(yīng)與紫菜生長息息相關(guān)，但是，彼此間的互作關(guān)系尚需進一步深入探明。

通過藻際微生物研究發(fā)現(xiàn)，假交替單胞菌為條斑紫菜優(yōu)勢附生菌，且對條斑紫菜葉狀體和絲狀體生長均無不良影響(楊銳等,2008)。楊銳等(2008)沒有在其紫菜樣品的相應(yīng)生活水體中分離到該菌，可能由于所采用的第1代測序技術(shù)通量低，難以檢測到水體中的低豐度菌，而假交替單胞菌在水體中豐度較低。通過對條斑紫菜絲狀體黃斑病進行培養(yǎng)、分離等研究發(fā)現(xiàn)，河豚毒素假交替單胞菌可能為重要的致病菌組成(王洪斌等,2011)。對條斑紫菜葉狀體綠斑病的研究發(fā)現(xiàn)，檸檬假交替單胞菌是致病的直接因素(閆詠等,2002)。本研究對長島紫菜養(yǎng)殖區(qū)與非養(yǎng)殖區(qū)調(diào)查發(fā)現(xiàn)少量假交替單胞菌，其相對豐度小于0.1%，且不同區(qū)域間假交替單胞菌的分布沒有差異。調(diào)查結(jié)果未發(fā)現(xiàn)河豚毒素假交替單胞菌和檸檬假交替單胞菌，可能由于其豐度極低而未被檢測到。

水環(huán)境中細(xì)菌多樣性既與附近生物體的代謝活動、生理特征有關(guān)，又與環(huán)境因子(溫度、鹽度、DO、pH、營養(yǎng)鹽等)相關(guān)(胡曉娟,2013)。本次調(diào)查結(jié)果發(fā)現(xiàn)，環(huán)境因子在區(qū)域間具有較為明顯的規(guī)律性，如DO、pH呈現(xiàn)由近岸到外海逐漸遞減，TSS、Si和P呈由近岸到外海逐漸遞增，N的含量也在CDCOS區(qū)最高。由于調(diào)查海域有貝類養(yǎng)殖，且與CDCOS區(qū)較近，而離CDCNS區(qū)最遠(yuǎn)。貝類養(yǎng)殖消耗O2造成DO下降，排泄造成TSS和N、P等無機營養(yǎng)鹽升高。而CDPF區(qū)N大大低于CDCNS區(qū)，則是由紫菜生長消耗而致。而CDPF區(qū)的鹽度也略高于其他2個區(qū)域，其原因尚未知。通過關(guān)聯(lián)以上環(huán)境參數(shù)與環(huán)境微生物分析發(fā)現(xiàn)，二者在空間分布上具有一定的關(guān)聯(lián)性，如嗜氨菌屬需生長在高濃度氨離子的環(huán)境中，對氨有很強的依賴性(Zaitsevet al,1998)，因此，其分布與的空間分布呈顯著正相關(guān)，成為CDCOS區(qū)典型的優(yōu)勢菌。鹽單胞菌屬為嗜鹽菌，喜繁盛于鹽度較高的鹽場附近或海洋中(劉軍華等,2009)。本研究發(fā)現(xiàn)，鹽單胞菌屬的分布受鹽度影響較大。CDPF區(qū)鹽度較CDCNS和CDCOS區(qū)略高，鹽單胞菌屬則成為CDPF區(qū)特異性的優(yōu)勢菌。由于鹽單胞菌屬具有反硝化作用(趙貴成等,2011)，可將海水中的還原為，而紫菜在攝取氮鹽的過程中，優(yōu)先消耗N(Bronket al,1994)，因此，鹽單胞菌屬的富集對紫菜生長應(yīng)是有利的。