曹建佳 王開翔 黃貴閩 曹貴華 劉光濤 何祥彪

（樂山市人民醫(yī)院泌尿外科 四川 樂山 614000）

腎癌是泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，每年全世界有超過100,000例患者因此死亡。目前，腎癌的治療手段很有限，RCC治療仍靠外科手術(shù)，晚期治療非常棘手。隨著基因靶向治療近年來在臨床腫瘤診斷和治療領(lǐng)域的開展并取得良好應(yīng)用，因此，本實驗將研究方向集中在腎細(xì)胞癌的基因靶向治療。

Yes相關(guān)蛋白(Yes-associated protein，YAP) 因與Src蛋白激酶家族中的Yes蛋白的SH3區(qū)域結(jié)合而命名為Yes-associated protein65（YAP65）[1]。最近研究發(fā)現(xiàn)YAP是Hippo通路的關(guān)鍵效應(yīng)因子，而Hippo通路是調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和凋亡的關(guān)鍵信號通路。TEAD是位于Hippo通路中YAP下游的最主要的轉(zhuǎn)錄因子之一，YAP通過與TEAD的相關(guān)結(jié)構(gòu)域結(jié)合而發(fā)揮重要作用[2]。盡管越來越多的研究表明YAP在腫瘤的發(fā)展中具有重要作用，但YAP在腎癌中的作用仍不甚清楚，相關(guān)研究尚未深入開展。本研究目的旨在通過慢病毒介導(dǎo)的干擾載體沉默YAP基因，探討沉默YAP后對腎透明細(xì)胞癌增殖和凋亡的影響及其可能的機制。

1.資料與方法

1.1 一般資料

ACHN腎癌細(xì)胞株購自ATCC；786-O、caki-2腎癌細(xì)胞株及HEK-293細(xì)胞株由本實驗組保存；PRMI 1640、DMEM培養(yǎng)基購自Hyclone公司；胎牛血清FBS購自杭州四季青公司及Hyclone公司；引物由華大基因公司構(gòu)建并檢測；Total RNA提取試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、TaqDNA 聚合酶及Marker購自大連寶生物工程有限公司（Takara）；YAP兔抗人多克隆抗體購自美國Santa Cruz生物技術(shù)公司，TEAD1抗體購自美國Proteintech Group生物技術(shù)有限公司.；CCK-8細(xì)胞計數(shù)試劑盒購自美國Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 腎透明癌細(xì)胞系786-O、caki-2、ACHN以含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液，HEK-293細(xì)胞株以含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，于37℃、5%C02孵育箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞密度長至80%～90%時，用0.125%胰酶將貼壁生長的細(xì)胞消化傳代培養(yǎng)。

1.2.2 慢病毒干擾載體的設(shè)計合成及腎癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)染 3條YAP-shRNA和一條陰性對照shRNA (negative control shRNA,NC-sh RNA) 慢病毒重組質(zhì)粒載體[均含綠色熒光蛋白(green fluorescence protein,GFP ]由上海生博生物醫(yī)藥科技有限公司合成。根據(jù)我們實驗組前期的研究基礎(chǔ)，慢病毒在腎癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率上，最佳感染復(fù)數(shù) ( Multiplicity of infection,MOI)為20，ShYAP-3慢病毒干擾載體抑制效率最高。

1.2.3 RT-PCR檢測細(xì)胞中mRNA的表達(dá) 收集實驗所培養(yǎng)的各組細(xì)胞，根據(jù)Trizol試劑盒說明書提取各組細(xì)胞中的總RNA，總RNA的質(zhì)量由紫外線分光光度儀檢測。取1 μg總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，并進(jìn)行PCR擴增YAP和TEAD1基因，GAPDH作為內(nèi)參基因。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min，95℃變性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s，共30個循環(huán)后，72℃終末延伸5 min。PCR產(chǎn)物于2.5%瓊脂糖凝膠電泳，電泳后放置于凝膠成像儀紫外光下觀察并拍照。Quantity One軟件照相并對相應(yīng)條帶定量做分析。

1.2.4 Western-blot檢測細(xì)胞中蛋白的表達(dá) 使用RIPA裂解液提取各組所需要細(xì)胞中的總蛋白。按照BCA法測定蛋白濃度及上樣時每孔應(yīng)加入蛋白體積。經(jīng)10%聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE)80V電壓下分離，250mA恒流將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移到0.45μm PVDF膜上，5%脫脂奶粉配制成封閉液37 ℃封閉已經(jīng)電轉(zhuǎn)好PVDF膜2 h。根據(jù)不同膜分別加入兔抗人YAP一抗（1：200），TEAD1一抗（1：200）及內(nèi)參β-actin抗體（1：1000）過夜后，最后經(jīng)TBST充分漂洗后于PVDF膜上，ECL化學(xué)發(fā)光顯影，Bio-Rad凝膠成像儀軟件對各組細(xì)胞Western-blot結(jié)果做出分析。

1.2.5 CCK-8檢測細(xì)胞增殖能力的改變 將處于對數(shù)生長期的786-O細(xì)胞制備成單細(xì)胞懸液，以每孔5x103/個細(xì)胞接種到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中。37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中孵育12小時，將細(xì)胞分為空白對照組、陰性對照組及實驗組3組，陰性對照組及實驗組分別轉(zhuǎn)染NC-shRNA及shYAP-3 慢病毒載體。每組設(shè)6個復(fù)孔，將96孔板置于37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)48，96，144小時，然后將10ulCCK-8試劑和90ul含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液混合均勻后加入到各孔，CO2培養(yǎng)箱，37℃繼續(xù)孵育1小時，用酶標(biāo)儀檢測各組細(xì)胞在450nm處吸光度。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，計數(shù)資料采用率（%）表示，進(jìn)行χ2檢驗，計量資料采用（±s）表示，進(jìn)行t檢驗，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2.結(jié)果

2.1 YAP在4種細(xì)胞中的表達(dá)

RT-PCR和Western blot法分別檢測YAP基因在786-O、caki-2、ACHN 三種腎癌細(xì)胞系及人胚腎細(xì)胞HEK-293細(xì)胞中表達(dá)情況。RT-PCR檢測結(jié)果顯示：YAP mRNA的表達(dá)在腎透明癌細(xì)胞系786-O、caki-2、ACHN中較HEK-293細(xì)胞中明顯增高；Western blot法檢測結(jié)果顯示YAP蛋白在腎透明癌細(xì)胞系786-O、caki-2、ACHN中的表達(dá)水平明顯高于人胚腎細(xì)胞HEK-293細(xì)胞，見表1。

表1 YAP在4種細(xì)胞中的表達(dá)

2.2 shRNA慢病毒轉(zhuǎn)染786-O細(xì)胞后YAP的表達(dá)

ShYAP-1、ShYAP-2和ShYAP-3組YAP mRNA表達(dá)水平分別為0.297±0.023、0.437±0.025、0.273±0.006，與陰性對照組（0.830±0.020）相比YAP mRNA表達(dá)水平明顯降低 (P＜0.05)，其抑制效率分別為64.3%、47.4%、67.1%。ShYAP-1、ShYAP-2和ShYAP-3組YAP蛋白表達(dá)量分別為0.323±0.006、0.357±0.021、0.193±0.015，較陰性對照組（0.883±0.012）有明顯減弱(P＜0.05)，蛋白表達(dá)抑制效率分別為63.4%、59.6%、78.1%。，結(jié)果表明3個實驗組shRNA慢病毒干擾載體有效抑制了YAP蛋白表達(dá)，其中ShYAP-3慢病毒干擾載體抑制效率最高。

2.3 轉(zhuǎn)染ShYAP-3慢病毒后TEAD1表達(dá)受到抑制

ShYAP-3組TEAD1 mRNA表達(dá)水平為0.620±0.036，與陰性對照組（0.923±0.006）相比ShYAP-3轉(zhuǎn)染組TEAD1 mRNA表達(dá)水平明顯降低 (P＜0.05)。ShYAP-3組TEAD1蛋白表達(dá)量為0.530±0.062，較陰性對照組（0.873±0.032）有明顯減弱(P＜0.05)，實驗結(jié)果表明轉(zhuǎn)染組ShYAP-3慢病毒干擾載體抑制YAP蛋白表達(dá)后，對下游轉(zhuǎn)錄因子TEAD1表達(dá)產(chǎn)生了明顯抑制效應(yīng)。

2.4 轉(zhuǎn)染后786-O細(xì)胞的增殖變化

將最佳轉(zhuǎn)染沉默效果的ShYAP-3慢病毒干擾載體，NC—shRNA轉(zhuǎn)染786-O細(xì)胞96小時后細(xì)胞重懸制備為5×103/ml的單細(xì)胞懸液，ShYAP-3組786-0細(xì)胞在培養(yǎng)48h、96h、144h后，細(xì)胞吸光度值較對照組明顯減小（P＜0.05）。這表明ShYAP-3組細(xì)胞生長較對照組細(xì)胞生長速度減慢，并且病毒感染144h后這種生長抑制持續(xù)存在，進(jìn)一步說明shRNA干擾慢病毒抑制YAP在腎癌786-0細(xì)胞表達(dá)后，有效抑制細(xì)胞增殖，見表2。

表2 各組細(xì)胞的吸光度值和增殖抑制率

3.討論

Hippo-YAP信號通路最初于果蠅中發(fā)現(xiàn)，調(diào)控細(xì)胞生長、增殖及器官大小的發(fā)育。在哺乳動物體內(nèi)，Hippo-YAP信號通路包括Mst1/2、SAV1、LATS1/2、YAP、TAZ和TEAD等。TEAD是位于YAP下游的轉(zhuǎn)錄因子，YAP通過與TEAD相互結(jié)合發(fā)揮作用。人類YAP基因位于染色體11q22上，蛋白則廣泛表達(dá)于機體各組織中。Hippo-YAP信號通路中YAP一旦激活，可導(dǎo)致下游轉(zhuǎn)錄因子和調(diào)節(jié)因子表達(dá)量增加，進(jìn)而發(fā)揮促進(jìn)細(xì)胞增殖和抑制細(xì)胞凋亡的作用。

在眾多的Hippo通路的下游轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子中，TEAD是目前研究較多且較深入的。由于YAP不具有直接調(diào)控轉(zhuǎn)錄的功能，YAP能夠與Hippo通路下游轉(zhuǎn)錄因子相結(jié)合，而轉(zhuǎn)錄因子TEADl具有抑制某些基因轉(zhuǎn)錄的功能。TEAD在前列腺癌、卡波濟肉瘤，基底細(xì)胞型乳腺癌中發(fā)現(xiàn)高表達(dá)[3]。研究顯示抑制YAP的活性可以通過阻礙YAP-TEAD結(jié)合的方式降低TEAD的轉(zhuǎn)錄活性。最近有研究證實通過基因靶向藥物干擾YAP-TEAD的結(jié)合，都可有效抑制YAP的致癌作用[4]。

本實驗研究腎癌細(xì)胞中YAP的表達(dá)情況。研究證實，同對照細(xì)胞HEK-293 相比，YAP基因在腎癌細(xì)胞系中高度表達(dá)，這提示YAP在腎癌的發(fā)病機制中可能扮演的是癌基因的角色。這與YAP在肺癌，肝癌，卵巢癌中的表達(dá)情況相似。接下來繼續(xù)研究YAP在腎癌細(xì)胞中的作用并探討其作用機制。本實驗前期構(gòu)建了3條帶有目的RNAi 序列的慢病毒pLV-GFP，利用慢病毒載體高效的轉(zhuǎn)染效率及長期穩(wěn)定表達(dá)的特點[5]，將帶有特異性沉默YAP的RNAi 序列慢病毒載體轉(zhuǎn)染進(jìn)入786-O細(xì)胞，用RT-PCR及Western blot法檢測慢病毒沉默YAP前后腎癌786-O細(xì)胞中YAP、TEAD1表達(dá)情況，YAP 和TEAD1 mRNA及蛋白的表達(dá)明顯降低。通過CCK-8法對轉(zhuǎn)染ShYAP-3慢病毒干擾載體細(xì)胞不同時間段細(xì)胞吸光度值檢測，證實shRNA慢病毒干擾載體沉默YAP后能有效抑制786-0細(xì)胞增殖。

本結(jié)果提示YAP基因沉默可能阻止YAP和TEAD1的結(jié)合，該反應(yīng)抑制了TEAD1的表達(dá)并影響其轉(zhuǎn)錄活性，導(dǎo)致下游細(xì)胞生長調(diào)節(jié)因子失活，最終導(dǎo)致腎癌細(xì)胞增殖抑制，但其詳盡的分子機制有待進(jìn)一步研究。