郝志強(qiáng)，王勤章，錢 成，徐 浩，申茂磊，李 朋，錢 彪

在腎結(jié)石的基礎(chǔ)與臨床研究工作中，設(shè)計(jì)和建立合理的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型是重要的一環(huán)。通過建立腎結(jié)石實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型可以深入了解腎結(jié)石的形成過程，研究腎結(jié)石的形成機(jī)制，印證或否定某一涉及結(jié)石成因的代謝問題，篩選抑制結(jié)石生長(zhǎng)的藥物并確認(rèn)其臨床藥理等。由于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)易于控制實(shí)驗(yàn)條件，易重復(fù)，所以在臨床與基礎(chǔ)研究中得到廣泛的應(yīng)用［1，2］。該研究通過構(gòu)建乙二醇 Wistar雄性大鼠腎結(jié)石動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，?shí)時(shí)動(dòng)態(tài)分析大鼠血、尿生化的改變，旨在為進(jìn)一步腎結(jié)石形成機(jī)制及其病因?qū)W的深入研究提供數(shù)據(jù)資料及技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組 自新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心購得SPF級(jí)［合格證號(hào)SCXK（新）2013-0001］、體重相近［（200±20）g］的 Wistar雄性大鼠 60 只，隨機(jī)分為2組，乙二醇造模組與空白對(duì)照組，兩組大鼠均先適應(yīng)性飼養(yǎng)1 W，標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，飼料來源于石河子大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器與試劑 電子天平（LT1000B，江蘇常熟市大量?jī)x器有限責(zé)任公司）、全自動(dòng)生化分析儀（Modual DPP，德國羅氏）、多功能光學(xué)顯微鏡及圖像采集系統(tǒng) （BX40，日本Olympus）、透射電鏡（JEOL-1230 Electronics，日本 JEOL）。 試劑：1.25%乙二醇飲水、1%氯化銨等。

1.3方 法

1.3.1 模型建立及標(biāo)本采集 將60只大鼠隨機(jī)分為乙二醇組 （1.25%乙二醇飲水+1%氯化銨2 ml/d灌胃，30只）和空白對(duì)照組（正常飲水+生理鹽水2 ml/d灌胃，30只），兩組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物灌胃時(shí)間持續(xù)2 W，實(shí)驗(yàn)周期為10 W，每周每組各處死大鼠3只，處死前采集大鼠血、尿標(biāo)本，供生化分析，并取兩側(cè)鮮活腎臟標(biāo)本，供病理結(jié)晶情況檢測(cè)及腎體比（腎臟重量/體重×100%）的計(jì)算。

1.3.2 記錄大鼠一般情況 連續(xù)觀察10 W內(nèi)各組大鼠飲食飲水、行為活動(dòng)等情況，并實(shí)時(shí)測(cè)量記錄其體重變化。

1.3.3 病理切片 肉眼觀察腎臟的顏色及其大小改變。將標(biāo)本經(jīng)固定、脫水透明、浸蠟包埋、切片貼片、脫蠟染色、脫水透明、封固等步驟，制成石蠟病理切片，常規(guī)HE染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察結(jié)晶的形成情況，按文獻(xiàn)提供的腎臟結(jié)晶分級(jí)判定標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)［1］。

1.3.4 生化指標(biāo) 使用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)肌酐，尿素，尿酸，尿鈣，血鈣，血鎂，血磷等生化指標(biāo)，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)用±s表示，不同時(shí)間段的計(jì)量資料，組間分析運(yùn)用重復(fù)測(cè)量的方差分析，相同時(shí)間段的組間比較用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，組內(nèi)的比較采用SNK-q檢驗(yàn)，顯著性水準(zhǔn)α=0.05，P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 大鼠的一般情況 造模初期1～2周，兩組大鼠均表現(xiàn)無異，飲食飲水良好，且性情溫順。連續(xù)性觀察，空白對(duì)照組3～10周造模期間，飲食及性情等均無沒明顯改變，而乙二醇組出現(xiàn)了階段性的明顯異常。第3～8周，乙二醇組大鼠煩躁興奮、活潑好動(dòng)，至第9～10周，乙二醇組大鼠表現(xiàn)為飲水量下降、精神倦怠、活動(dòng)度明顯下降、針刺反應(yīng)遲鈍，而且在造模期間乙二醇組大鼠墊料可見明顯血尿痕跡，并有2只大鼠意外死亡。

2.2 大鼠腎臟標(biāo)本肉眼觀 動(dòng)態(tài)觀測(cè)10周內(nèi)兩組大鼠腎臟大體標(biāo)本的改變，可見：空白對(duì)照組大鼠腎臟無明顯改變，腎臟表面光滑，腎皮質(zhì)剖面為暗紅色，髓質(zhì)呈灰白色，腎門處可見腎乳頭、腎盞、腎盂等正常結(jié)構(gòu)；第1～2周，兩組大鼠腎臟無明顯差異，自第3周開始，乙二醇組較空白對(duì)照組大鼠腎臟略有增大，腎皮質(zhì)剖面呈紅褐色，髓質(zhì)呈橘黃色，皮髓結(jié)構(gòu)清晰，腎盞及腎盂良好。第6周以后乙二醇組大鼠腎臟腫大，顏色變淺或發(fā)白，剖面呈淡黃色，皮髓結(jié)構(gòu)不清晰，可見淡黃色顆粒沉積在皮髓交界處，觸之有沙粒樣感覺，在解剖顯微鏡下，晶體以腎盂為中心呈扇形分布。稱重計(jì)算腎體比得：第3～10周乙二醇組腎體比與空白對(duì)照組腎體比有明顯差異，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

2.3 大鼠腎臟光學(xué)顯微鏡觀察 光學(xué)顯微鏡下可見：1～10周造模期間，空白對(duì)照組大鼠腎臟組織未見明顯結(jié)晶；自第3周起，乙二醇組大鼠腎臟切片可見明亮晶體，主要分布于遠(yuǎn)曲小管，近曲小管及部分腎小球周圍，形態(tài)不規(guī)則，晶體多呈零星散在分布，少量晶體互相連接成片成團(tuán)。統(tǒng)計(jì)10周內(nèi)兩組結(jié)晶形成例數(shù)，計(jì)算成石率，結(jié)果顯示兩組之間成石率差異明顯且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表2。因EG組大鼠在第3周開始成石，而前兩周已處死的大鼠也存在成石的可能，所以在計(jì)算成石率時(shí)將前兩周已處死的大鼠排除在大鼠總計(jì)數(shù)之外。

表1 乙二醇組與空白對(duì)照組腎體比記錄（±s）

表1 乙二醇組與空白對(duì)照組腎體比記錄（±s）

注：乙二醇組在對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)上f1～f8P與對(duì)照組比較，P<0.05；f1～f8P為乙二醇組與對(duì)照組比較的P值。Pf1=0.049，Pf2=0.041，Pf3=0.025，Pf4=0.048，Pf5=0.023，Pf6=0.015，Pf7=0.003，Pf8=0.009。

組別時(shí)間（w）10乙二醇組 0.63±0.01 0.76±0.05 0.92±0.09 0.95±0.08 0.98±0.06 0.98±0.07 1.01±0.10 1.00±0.09 0.95±0.02 0.97±0.06對(duì)照組 0.67±0.04 0.71±0.02 0.76±0.05f1 0.81±0.02f2 0.83±0.05f3 0.79±0.10f4 0.76±0.08f5 0.76±0.06f6 0.77±0.05f7 0.76±0.05f8 1 2 3 4 5 6 7 8 9

表2 乙二醇組與空白對(duì)照組結(jié)晶情況

2.4 血液生化分析比對(duì) 采集兩組大鼠血液標(biāo)本進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果顯示：血肌酐、血尿酸、尿素氮、血鈣、血鎂、血磷等重要指標(biāo)均明顯增高；乙二醇造模組大鼠血液分析，第2～10周尿素、肌酐、尿酸，第5～10周血鈣，第6～10周血鎂、血磷與空白對(duì)照組進(jìn)行比較，差異明顯，且均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表3。其余各周差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P>0.05）。

2.5 尿液生化分析比對(duì) 收集兩組大鼠尿液標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)分析得：乙二醇造模組大鼠尿pH在第2～8周明顯上升（圖1），且與空白對(duì)照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），乙二醇組大鼠尿鈣水平自第2～10周，漲幅明顯（P＜0.05）（表 4），其余各周無明顯改變，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。24 h尿量及尿比重顯示，P＞0.05，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

表3 乙二醇組與對(duì)照組血液生化分析（±s）

表3 乙二醇組與對(duì)照組血液生化分析（±s）

注：在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)上，乙二醇組與對(duì)照組比較，＊P＜0.05。

時(shí)間（周） 血鈣（mmol/L） 血磷（mmol/L） 血鎂（mmol/L） 肌酐（μmol/L） 尿酸（μmol/L） 尿素（mmol/L）乙二醇組1 2.46±0.11 2.46±0.10 0.93±0.08 39.37±1.82 80.33±9.87 5.45±1.54 2 2.52±0.09 2.50±0.06 0.97±0.16 41.77±1.37 72.00±5.29 5.80±1.18 3 2.56±0.05 2.66±0.02 0.99±0.14 40.73±3.18 77.00±2.65 4.49±0.35 4 2.63±0.04 3.08±0.09 1.00±0.17 42.63±3.04 78.67±8.74 5.99±0.37 5 2.81±0.14 2.92±0.25 1.13±0.22 52.83±4.05 81.33±6.11 5.93±0.79 6 2.68±0.08 3.55±0.17 0.80±0.04 47.40±7.81 89.33±4.16 6.40±0.36 7 2.67±0.11 4.45±0.33 1.60±0.17 50.40±3.06 81.33±11.68 5.84±0.21 8 2.66±0.12 3.88±0.32 1.58±0.25 45.80±6.37 86.67±3.21 5.13±0.21 9 2.53±0.11 4.54±0.26 1.70±0.20 49.33±3.23 79.67±3.21 5.47±0.46 10 2.87±0.03 3.85±0.29 1.73±0.19 46.37±4.57 75.67±6.66 6.18±0.49對(duì)照組1 2.34±0.16 2.79±0.57 1.10±0.20 39.43±1.43 78.67±9.71 5.89±0.68 2 2.39±0.11 3.54±0.87 1.18±0.31 42.40±6.46＊ 78.67±7.37＊ 5.71±1.10＊3 2.54±0.13 3.45±1.25 1.17±0.14 42.33±1.79＊ 72.67±4.73＊ 5.04±0.62＊4 2.49±0.10 3.45±0.23 1.24±0.10 42.10±3.70＊ 72.67±3.51＊ 4.91±1.17＊5 2.47±0.16＊ 3.34±1.22 1.13±0.45 42.53±4.93＊ 73.00±6.24＊ 5.72±0.87＊6 2.10±0.05＊ 2.90±0.35＊ 1.27±0.20＊ 45.03±4.32＊ 82.67±4.73＊ 5.68±0.42＊7 2.20±0.09＊ 2.71±1.03＊ 1.09±0.24＊ 50.43±7.21＊ 89.00±7.00＊ 5.53±0.13＊8 2.35±0.03＊ 2.46±0.34＊ 1.06±0.20＊ 49.53±3.79＊ 80.67±3.21＊ 5.28±0.46＊9 2.32±0.04＊ 2.58±1.14＊ 1.08±0.12＊ 46.53±5.35＊ 84.33±7.23＊ 5.75±0.66＊10 2.42±0.27＊ 2.59±0.42＊ 1.20±0.15＊ 47.07±1.46＊ 78.67±4.16＊ 5.70±0.87＊

圖1 乙二醇組與空白對(duì)照組尿鈣、pH比較

表4 乙二醇組與對(duì)照組尿液生化分析（±s）

表4 乙二醇組與對(duì)照組尿液生化分析（±s）

注：在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)上，乙二醇組與對(duì)照組比較，＊P＜0.05。

（mmol/24 h） 尿pH 尿比重 24 h尿量（ml）乙二醇組1 1.09±0.07 7.17±0.29 1.013±0.003 6.67±1.202 1.13±0.09 7.33±0.29 1.010±0.005 7.77±2.143 1.60±0.25 7.67±0.29 1.012±0.006 8.13±1.844 2.00±0.78 7.50±0.50 1.015±0.005 8.87±3.175 2.35±0.52 7.50±0.50 1.013±0.003 9.47±0.876 2.35±0.18 7.33±0.58 1.017±0.008 9.53±1.317 2.20±0.28 7.67±0.58 1.015±0.005 9.07±1.008 1.98±0.26 8.33±0.29 1.015±0.005 9.27±1.359 1.88±0.04 8.33±0.29 1.015±0.009 8.47±1.16 10 2.08±0.15 8.00±0.50 1.015±0.005 8.80±0.87對(duì)照組1 1.11±0.16 6.67±0.29 1.013±0.006 7.70±0.872 1.00±0.05＊ 6.83±0.76＊ 1.018±0.008 9.03±1.023 1.59±0.27＊ 7.33±0.58＊ 1.018±0.003 11.30±2.884 2.22±0.16＊ 6.83±0.29＊ 1.018±0.003 10.90±2.195 2.15±0.30＊ 7.00±.087＊ 1.018±0.003 11.23±1.326 2.04±0.37＊ 6.67±0.58＊ 1.022±0.003 11.73±0.967 2.22±0.34＊ 7.00±0.50＊ 1.018±0.003 11.57±1.248 2.19±0.44＊ 6.80±0.29＊ 1.020±0.005 12.63±2.479 1.92±0.20＊ 6.83±0.29 1.018±0.010 9.77±0.85 10 2.01±0.21＊ 6.67±0.73 1.020±0.005 9.80±0.46時(shí)間（周） 尿鈣

3 討論

研究表明，泌尿系結(jié)石主要成分主要為尿中難溶的無機(jī)鹽、酸、蛋白和一些糖類，概括起來為晶體和基質(zhì)兩部分，其中晶體占據(jù)絕大部分，主要為草酸鹽、磷酸鹽、尿酸鹽和胱氨酸等，由此組成的結(jié)石中，以草酸鹽最多見，約存在于90%的結(jié)石中；其次為磷酸鹽，多數(shù)以羥基磷灰石的形式出現(xiàn)，磷酸鎂銨則多見于感染性結(jié)石內(nèi)。在腎結(jié)石的臨床與基礎(chǔ)研究中，大都通過構(gòu)建乙二醇大鼠模型進(jìn)行靜態(tài)的研究，在最終造模結(jié)束后，對(duì)結(jié)石情況進(jìn)行描述，從而缺乏了對(duì)結(jié)石形成過程的有效觀察。本研究通過連續(xù)不間斷的對(duì)大鼠血、尿生化進(jìn)行分析，旨在為進(jìn)一步結(jié)石形成機(jī)制的深入研究提供動(dòng)態(tài)的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)與理論支持。

乙二醇為草酸的前體，亦是草酸代謝通路的中間產(chǎn)物，進(jìn)入體內(nèi)后可轉(zhuǎn)化成羥乙酸，后者既可在羥乙酸氧化酶的作用下直接轉(zhuǎn)化為草酸，也可通過乳酸脫氧酶的催化轉(zhuǎn)化為乙醛酸，乙醛酸又可直接在非酶作用下轉(zhuǎn)化為草酸。因此，攝入乙二醇可導(dǎo)致動(dòng)物體內(nèi)草酸增加而形成草酸鈣［3-5］，從而成功構(gòu)建Wistar雄性大鼠腎結(jié)石模型。氯化銨在酸化尿液的同時(shí)也具有腎毒性，長(zhǎng)期服用可造成腎小管功能障礙，由此導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)過程中乙二醇組有2只大鼠死亡，自第9周開始，飲食飲水減少，活動(dòng)度減低，神情倦怠，針刺反應(yīng)遲鈍等情況的發(fā)生，許多研究表明腎小管上皮細(xì)胞的損害利于草酸鈣結(jié)晶滯留和生長(zhǎng)，與尿液中的其他成分共同啟動(dòng)結(jié)石形成的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，這可能是結(jié)石形成的開端［6-9］。光學(xué)顯微鏡下，空白對(duì)照組未見明顯結(jié)晶形成；乙二醇組結(jié)晶陽性16例，兩組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.01）。

該實(shí)驗(yàn)中采集兩組大鼠血液標(biāo)本進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果顯示：血肌酐、血尿酸、尿素氮、血鈣、血鎂、血磷等重要指標(biāo)均明顯增高；乙二醇造模組大鼠血液分析，第2～10周尿素、肌酐、尿酸，第5～10周血鈣，第6～10周血鎂、血磷與空白對(duì)照組進(jìn)行比較，差異明顯，且均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。對(duì)兩組大鼠尿液標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)分析得：乙二醇造模組大鼠尿pH在第2～8周明顯下降，且與空白對(duì)照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），乙二醇組大鼠尿鈣水平自第2周開始至第 10周，漲幅明顯（P＜0.05）。由此說明，乙二醇及氯化銨營(yíng)造的高濃度草酸環(huán)境和腎毒性作用，以損傷腎小管上皮細(xì)胞為起點(diǎn)，不斷加重對(duì)腎臟組織的損害，加劇腎功能的不斷下降［10，11］。

在造模初期，諸多重要指標(biāo)測(cè)得表明大鼠腎臟均受到不同程度的損傷，筆者推測(cè)，一方面由于草酸成分的大量堆積，致使結(jié)晶沉積于腎臟微觀結(jié)構(gòu)中，以腎小管上皮細(xì)胞為起點(diǎn)，破壞腎臟正常機(jī)能，氯化銨的存在，其腎毒性對(duì)腎臟亦造成一定程度的傷害；另一方面，鈣敏感受體受到刺激后表達(dá)上調(diào)［12，13］，抑制腎小管對(duì)鈣離子的重吸收，從而增加尿鈣排泄［14-16］，進(jìn)一步加劇結(jié)石的形成。相較于之前的研究，筆者的實(shí)驗(yàn)進(jìn)行改良，動(dòng)態(tài)觀測(cè)每一周血、尿生化的改變、結(jié)晶的形成情況等等，逐步明確腎結(jié)石的發(fā)展過程，實(shí)驗(yàn)的動(dòng)態(tài)描述有利于進(jìn)一步解釋結(jié)石的形成機(jī)制，為腎結(jié)石病因?qū)W的研究提供原始數(shù)據(jù)及技術(shù)支持。