普元倩，梅 雯，王唯斯，李 彬，張 態(tài)，張若鵬，熊 偉

宮頸癌是全球婦女中僅次于乳腺癌的第二個(gè)最常見的惡性腫瘤。在我國，宮頸癌的每年新發(fā)病例為13.2萬，約占世界新發(fā)病例的28.8%［1］。宮頸癌病死率居女性惡性腫瘤病死率的第二位，在女性生殖器官腫瘤中居首位［2］。腫瘤的生物學(xué)特性不僅取決于核內(nèi)遺傳物質(zhì)，而且與核外的線粒體DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）也有一定的關(guān)系［3］。線粒體轉(zhuǎn)錄終止因子 （mitochondrial transcription termination factor，MTERF）是一類由核基因編碼通過特殊的方式轉(zhuǎn)運(yùn)到線粒體，并能與mtDNA特異結(jié)合的蛋白質(zhì)，在mtDNA的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄以及翻譯中發(fā)揮調(diào)控作用［4］。線粒體轉(zhuǎn)錄終止因子蛋白家族有4個(gè)成員（MTERF1~F4），其中線粒體轉(zhuǎn)錄終止因子2 （mitochondrial transcription termination factor 2，MTERF2）又稱線粒體轉(zhuǎn)錄終止因子D3（mitochondrial transcription termination domain containing 3，MTERFD3）或線粒體轉(zhuǎn)錄終止樣因子（mitochondrial transcription termination-like factor，MTERFL）［5］。MTERF2基因是通過比較正常血清培養(yǎng)與血清饑餓培養(yǎng)的人成纖維細(xì)胞基因表達(dá)譜差異發(fā)現(xiàn)的一個(gè)細(xì)胞增殖抑制基因［6］。人MTERF2基因定位于12q23.3，可編碼由385個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成的蛋白質(zhì)，定位于線粒體內(nèi)［7］。研究表明，人MTERF2蛋白在體內(nèi)與mtDNA的結(jié)合沒有序列特異性，且抑制線粒體基因的表達(dá)［8-11］。MTERF2蛋白在線粒體內(nèi)的含量相對(duì)豐富，是線粒體擬核的重要組成成分［12］。目前，對(duì)于MTERF2基因在宮頸癌發(fā)生發(fā)展的作用及其機(jī)制尚不清楚，該研究旨在利用TCGA數(shù)據(jù)集分析MTERF2在宮頸癌中的表達(dá)及其預(yù)后意義。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)集下載 利用R3.3.3軟件Bioconductor/TCGA Biolinks函數(shù)包從 TCGA 數(shù)據(jù)庫（https：//tcga-data.nci.nih.gov/tcga/）下載并預(yù)處理宮頸癌數(shù)據(jù)集的MTERF2 mRNA表達(dá)RNA SeqV2數(shù)據(jù)。

1.2 GEPIA數(shù)據(jù)庫分析TCGA數(shù)據(jù)集中宮頸癌和正常宮頸組織MTERF2表達(dá)差異 基因表達(dá)譜動(dòng)態(tài)分析 （Gene Expression Profiling Interactive Analysis，GEPIA）（http：//gepia.cancer-pku.cn/） 是由北京大學(xué)研制開發(fā)可用于分析基因在癌癥和正常組織的差異表達(dá)的在線應(yīng)用，可對(duì)TCGA數(shù)據(jù)庫進(jìn)行可視化分析。TCGA宮頸癌數(shù)據(jù)集中包括306例宮頸癌組織樣本和13例正常宮頸組織樣本，用GEPIA分析MTERF2在宮頸癌和正常宮頸組織中的表達(dá)差異。

1.3 數(shù)據(jù)集篩選與宮頸癌臨床病理學(xué)參數(shù)資料相關(guān)研究 TCGA數(shù)據(jù)庫中下載得到含有人MTERF2 mRNA表達(dá)量的宮頸癌組織樣本306例，剔除臨床病理參數(shù)不詳或不完整的病例以及重復(fù)的資料病例，僅保留TCGA數(shù)據(jù)集中包含完整臨床參數(shù)和生存資料的病例，最后得到含有完整臨床病理參數(shù)和生存資料的病例246例。按病例的ID號(hào)將患者的臨床資料與MTERF2 mRNA表達(dá)RNA SeqV2數(shù)據(jù)合并成同一個(gè)Excel表格。根據(jù) 表達(dá)譜數(shù)據(jù)，對(duì)宮頸癌組織樣本的MTERF2表達(dá)量進(jìn)行由低到高排序，樣本中MTERF2表達(dá)量為62.420~911.306，中位數(shù)為212.666。將數(shù)據(jù)進(jìn)行二等分，低于中位數(shù)的樣本為低表達(dá)組，高于中位數(shù)的樣本為高表達(dá)組。獲取的TCGA數(shù)據(jù)集宮頸癌患者M(jìn)TERF2低表達(dá)組123例，高表達(dá)組123例。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法建立患者臨床資料庫，將患者年齡、腫瘤大小及浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、AJCC臨床分期、病理分級(jí)、病理類型、MTERF2 mRNA表達(dá)水平等指標(biāo)進(jìn)行量化賦值后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，具體賦值見表1。使用R 3.3.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用Shapiro-wilk法檢測(cè)宮頸癌組織中MTERF2 mRNA表達(dá)量的數(shù)據(jù)正態(tài)分布情況，結(jié)果表明MTERF2 mRNA表達(dá)水平不符合正態(tài)分布，所以宮頸癌組織中MTERF2表達(dá)水平采用Mannwhitney U非參數(shù)檢驗(yàn)。臨床病理參數(shù)相關(guān)性分析，組間比較采用χ2檢驗(yàn)及Fisher確切概率法。使用R語言Survival軟件包以Kaplan-Meier法繪制生存曲線并進(jìn)行Log-rank檢驗(yàn)，多因素分析采用Cox回歸模型。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 宮頸癌與正常宮頸組織MTERF2表達(dá)差異使用GEPIA數(shù)據(jù)庫對(duì)TCGA數(shù)據(jù)集進(jìn)行數(shù)據(jù)挖掘和可視化分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，相較于正常宮頸組織，宮頸癌組織中MTERF2 mRNA表達(dá)水平顯著降低，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖1。

圖1 宮頸癌組織和正常宮頸癌組織中MTERF2 mRNA 表達(dá)差異（＊P＜0.05）

2.2 MTERF2表達(dá)與宮頸癌患者臨床病理學(xué)參數(shù)相關(guān)性 在TCGA數(shù)據(jù)集中共納入246例臨床病理參數(shù)完整的病例資料，年齡21~85歲，中位年齡46歲。對(duì)該數(shù)據(jù)集中宮頸癌患者預(yù)后影響因素進(jìn)行賦值（表1），通過統(tǒng)計(jì)分析資料可知，宮頸癌患者M(jìn)TERF2 mRNA表達(dá)量與腫瘤浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、AJCC臨床分期和病理分級(jí)無關(guān)（P＞0.05）；與年齡（P=0.018）、病理類型（P＜0.001）明顯相關(guān)。見表2。

表1 宮頸癌患者預(yù)后影響因素及其賦值

圖2 人MTERF2 mRNA表達(dá)水平與宮頸癌患者預(yù)后的相關(guān)性

表 2MTERF2 mRNA表達(dá)水平與宮頸癌臨床病理參數(shù)的相關(guān)性分析（n=246）

2.3 MTERF2表達(dá)與宮頸癌患者預(yù)后的相關(guān)性使用R語言Survival軟件包對(duì)TCGA數(shù)據(jù)集中MTERF2高表達(dá)組和MTERF2低表達(dá)組宮頸癌患者的預(yù)后進(jìn)行Kaplan-Meier分析和Log-rank檢驗(yàn)，分別繪制總體生存率（overall survival，OS）和無疾病進(jìn)展生存率（disease free survival，DFS）生存函數(shù)曲線（圖2）。結(jié)果表明，MTERF2 mRNA表達(dá)量與宮頸癌患者的OS和DFS均無明顯的相關(guān)性（Log-rank P＞0.05）。

2.4 影響宮頸癌患者預(yù)后的COX多因素回歸分析 單因素分析結(jié)果顯示，腫瘤浸潤程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、AJCC臨床分期均能影響患者的預(yù)后（P<0.05）。 年齡、病理分級(jí)、病理類型、MTERF2 mRNA表達(dá)量與宮頸癌患者預(yù)后無相關(guān)性 （P>0.05）。將單因素分析中對(duì)預(yù)后有影響的指標(biāo)納入COX模型行多因素回歸分析，結(jié)果提示，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是影響宮頸癌患者預(yù)后的獨(dú)立因素（P<0.05）。見表3。

3 討論

癌癥的發(fā)生不僅與核內(nèi)遺傳物質(zhì)相關(guān)，還與核外的mtDNA密切相關(guān)。由于mtDNA缺乏組蛋白的保護(hù)，無DNA修復(fù)系統(tǒng)，處在高氧化應(yīng)激環(huán)境中，容易受電子傳遞鏈產(chǎn)生的自由基的損傷，與化學(xué)致癌物的親和力較核基因組高等原因，使mtDNA具有較高的突變率，可能具有潛在的致癌性［13］。研究發(fā)現(xiàn)，在多種癌組織及其相應(yīng)的體液標(biāo)本存在mtDNA的突變，如宮頸癌、卵巢癌、頭頸癌、膀胱癌和大腸癌等［14-17］。惡性腫瘤的發(fā)生不僅與mtDNA結(jié)構(gòu)改變相關(guān)，還與其數(shù)量有密切聯(lián)系。與正常組織相比，不同類型的腫瘤組織中mtDNA數(shù)量有著不同程度的增多或者減少［18］。線粒體是細(xì)胞內(nèi)重要的細(xì)胞器，線粒體功能障礙與惡性腫瘤、線粒體糖尿病、神經(jīng)退行性疾病等疾病的發(fā)生密切相關(guān)［19］。研究表明，細(xì)胞內(nèi)過表達(dá)MTERF2基因顯著抑制細(xì)胞生長和增殖的作用，細(xì)胞周期阻滯于G1/S期，但并不誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［6］。最近，Han等報(bào)道人MTERF2蛋白對(duì)1-甲基-4苯基吡啶離子 （1-methyl-4-phenyl-pyridiniuiodide，MPP+）誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞線粒體功能障礙和細(xì)胞損傷具有促進(jìn)作用［20］。MTERF2是調(diào)控線粒體基因表達(dá)的重要蛋白因子，目前，MTERF2在腫瘤中的表達(dá)及其預(yù)后意義目前尚未見報(bào)道。

該研究中，筆者使用R語言軟件從TCGA數(shù)據(jù)庫下載306例宮頸癌組織和13例正常宮頸組織RNA SeqV2數(shù)據(jù)。GEPIA分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，相較于正常宮頸組織，宮頸癌組織中MTERF2 mRNA表達(dá)水平顯著降低，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），結(jié)果提示MTERF2基因在細(xì)胞內(nèi)的功能可能類似于細(xì)胞抑癌基因。TCGA數(shù)據(jù)集處理后獲取246例宮頸癌患者M(jìn)TERF2 mRNA表達(dá)量、臨床病理資料等完整的數(shù)據(jù)，根據(jù)MTERF2 mRNA的中位表達(dá)量，將研究對(duì)象分為MTERF2高表達(dá)及低表達(dá)兩組。分析發(fā)現(xiàn)，宮頸癌患者M(jìn)TERF2 mRNA表達(dá)量與腫瘤浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、AJCC臨床分期、病理分級(jí)均無關(guān)（P＞0.05）；而與年齡、病理類型相關(guān)（P＜0.05）。進(jìn)一步Kaplan-Meier生存分析宮頸癌患者M(jìn)TERF2表達(dá)量與預(yù)后的關(guān)系，結(jié)果提示MTERF2 mRNA高表達(dá)組與低表達(dá)組的總體生存率及無疾病進(jìn)展生存率的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＞0.05）。單因素分析顯示，腫瘤浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、臨床分期均能影響患者的預(yù)后（P<0.05）。年齡、病理分級(jí)、病理類型、MTERF2 mRNA表達(dá)與宮頸癌患者預(yù)后無相關(guān)性（P>0.05）。COX多因素回歸分析結(jié)果提示，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是影響宮頸癌患者預(yù)后的獨(dú)立因素（P<0.05）。

表3 影響宮頸癌患者預(yù)后的單因素和多因素回歸分析

該研究的優(yōu)勢(shì)在于利用TCGA在線數(shù)據(jù)庫，樣本量較大，臨床資料完整。而不足之處在于，TCGA數(shù)據(jù)集中提供的是mRNA水平的表達(dá)數(shù)據(jù)，可能無法完全代表MTERF2在蛋白質(zhì)水平的表達(dá)情況。在后續(xù)的研究中應(yīng)該結(jié)合Western blot和免疫組織化學(xué)方法進(jìn)一步分析討論。該研究為MTERF2在腫瘤中的基礎(chǔ)和臨床研究提供了線索和依據(jù)，需要進(jìn)一步的研究更深入地探討MTERF2在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用及機(jī)制，為腫瘤的靶向治療提供新思路。