鄧紅艷 王麗穎 劉紅軍

神經(jīng)膠質(zhì)瘤(簡稱為膠質(zhì)瘤)是一種發(fā)生在神經(jīng)外胚層的惡性腫瘤，是神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤中發(fā)病率較高的惡性腫瘤之一，占30%左右[1,2]。膠質(zhì)瘤具有生長速度較快、治愈率低、術(shù)后復(fù)發(fā)率較高、存活率低、預(yù)后較差等特點(diǎn)，患者通常出現(xiàn)顱內(nèi)壓增高、癲癇、嘔吐等臨床癥狀，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量和生命安全[3,4]。因此，膠質(zhì)瘤已成為臨床和基礎(chǔ)研究的重點(diǎn)問題[5]。

MicroRNA(miRNA)是一種廣泛存在于真核生物、長度約22個(gè)核苷酸的內(nèi)源性非編碼小RNA，其本身并不能翻譯蛋白質(zhì)，而是通過與mRNA的3’端非翻譯區(qū)的堿基序列互補(bǔ)配對(duì)在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控靶基因表達(dá)[6,7]。近年來，有研究報(bào)道m(xù)iRNAs能夠參與細(xì)胞分化、增殖、衰老、凋亡等生物學(xué)過程，并能夠在腫瘤等疾病的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要調(diào)控作用[8,9]。本文主要研究miR-432在神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者中的表達(dá)及臨床意義，為今后神經(jīng)膠質(zhì)瘤的治療提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和理論依據(jù)。

1.資料與方法

1.1 一般資料 收集2016年1月至2018年1月我院收治的膠質(zhì)瘤患者的腦組織15例，并收集同期在我院接受治療的創(chuàng)傷性腦損傷患者腦組織15例作為正常對(duì)照組。膠質(zhì)瘤患者年齡范圍為10～75歲，平均年齡為(42.5±26.75)歲，其中男性8例，女性7例，根據(jù)《WHO中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤分類》分期標(biāo)準(zhǔn)：Ⅰ期1例，Ⅱ期3例，Ⅲ期3例，Ⅳ期8例。對(duì)照組患者年齡范圍為10～75歲，平均年齡為(41.75±27.05)歲，其中男性8例，女性7例。兩組患者在年齡、性別比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，具有可比性。

所有標(biāo)本病理結(jié)果均經(jīng)病理科及2名醫(yī)師證實(shí)，采集樣本前患者均未接受任何放療、化療等輔助治療。本研究經(jīng)過我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者及家屬自愿簽署知情同意書。標(biāo)本采集后立即置于液氮或-80℃冰箱保存。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U87細(xì)胞購于南京科佰生物科技有限公司(中國)。U87細(xì)胞采用含有10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素混合物的DMEM培養(yǎng)液(Hyclone公司，美國)，并置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱(Thermo公司，美國)中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)到50%～60%時(shí)，采用轉(zhuǎn)染試劑Lipo2000(Invitrogen，美國)進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。細(xì)胞分組分為miR-432過表達(dá)組(miR-432mimic組)、miR-432敲減組(miR-432inhibitor組)、miR-432過表達(dá)陰性對(duì)照組(mimic-NC)、miR-432敲減陰性對(duì)照組(inhibitor-NC)。使得miR-432mimic和mimic-NC終濃度為50nM，miR-432inhibitor和inhibitor-NC終濃度為100nM。細(xì)胞轉(zhuǎn)染24小時(shí)后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 RNA提取和實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qRT-PCR) 根據(jù)Trizol Reagent試劑(Invitrogen，美國)說明書提取組織、血清和細(xì)胞中總RNA，并使用NanoDrop2000檢測(cè)RNA濃度和純度。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(ABI，美國)說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。根據(jù)SYBR Green PCR Master Mix(羅氏，中國)說明書進(jìn)行qRT-PCR實(shí)驗(yàn)。反應(yīng)條件如下：先95℃預(yù)變性10分鐘后，95℃變性15 秒，60℃退火60秒，完成40個(gè)循環(huán)，進(jìn)入熔解程序：95℃ 15秒，60℃ 60秒，95℃ 15秒，最后72℃延伸10 分鐘，置4℃保存。以U6為內(nèi)參基因，檢測(cè)miR-432的表達(dá)水平。所有引物均購于吉瑪公司(中國)。

1.4 CCK-8實(shí)驗(yàn) 采用CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞活力。首先，將細(xì)胞以1×104個(gè)細(xì)胞/孔密度接種于96孔板中，細(xì)胞轉(zhuǎn)染24小時(shí)后，在每孔中加入10μL CCK-8溶液(北京百奧萊博，中國)，孵育4小時(shí)。采用酶標(biāo)儀檢測(cè)450nm處的吸光度。每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔取平均值，另設(shè)單孔只加入培養(yǎng)基作為空白對(duì)照。

1.5 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn) 采用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力。首先，將細(xì)胞接種于六孔板中，細(xì)胞轉(zhuǎn)染24小時(shí)后，利用一次性進(jìn)口吸頭在每孔中豎直劃一條直線，用PBS(索萊寶，中國)清洗細(xì)胞，以去掉漂浮的細(xì)胞，然后更換新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。分別于0小時(shí)、24小時(shí)后觀鏡下觀察并拍照，對(duì)比不同時(shí)間細(xì)胞劃痕寬度。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)均表示為均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差，用graphpad軟件對(duì)所有數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。計(jì)量資料行t值檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料行卡方檢驗(yàn)，組間差異經(jīng)P進(jìn)行判定，當(dāng)P<0.05時(shí)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.結(jié)果

2.1 膠質(zhì)瘤患者中miR-432的表達(dá) qRT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與非膠質(zhì)瘤患者的腦組織相比，膠質(zhì)瘤患者癌癥組織中miR-432的表達(dá)顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.0019)，見圖1A。此外，檢測(cè)膠質(zhì)瘤患者和非膠質(zhì)瘤患者血清中miR-432的表達(dá)，結(jié)果顯示與非膠質(zhì)瘤患者相比，膠質(zhì)瘤患者血清中miR-432的表達(dá)顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.0228)，見圖1B。

2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染后miR-432的表達(dá)量變化 與mimic-NC組比較，細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-432的類似物，即miR-432mimic后，miR-432的表達(dá)量顯著升高(P=0.0018)，見圖2A。與inhibitor-NC組比較，細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-432抑制劑，即miR-432inhibitor后，miR-432的表達(dá)量顯著降低(P=0.0161)，見圖2B。

圖1

圖2

2.3 miR-432對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞活力和遷移能力的影響 CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與mimic-NC組相比，miR-432mimic顯著降低膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U87細(xì)胞的活力，而與inhibitor-NC組相比，miR-432inhibitor顯著升高U87細(xì)胞活力，見圖3A。細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)表明，與mimic-NC組相比，miR-432mimic顯著降低膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U87細(xì)胞的遷移能力，而與inhibitor-NC組相比，miR-432inhibitor顯著升高U87細(xì)胞的遷移能力，見圖3B。

圖3

3.討論

神經(jīng)膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)復(fù)雜的多因素多階段病理生理過程[10,11]。有研究表明，miR-432能夠參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡等，進(jìn)而調(diào)節(jié)心肌肥厚、胰島素敏感性、肥胖、炎癥、肌生成等[12～16]。Jiale Zhang等人通過基因芯片技術(shù)發(fā)現(xiàn)miR-432在人膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)顯著降低[17]。然而，miR-432與膠質(zhì)瘤的關(guān)系尚不明確，因此本研究應(yīng)用qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)miR-432在15例膠質(zhì)瘤患者的癌癥組織和15例非膠質(zhì)瘤患者的腦組織中的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，miR-432在膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)顯著降低。qRT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，miR-432在膠質(zhì)瘤患者血清中miR-432的表達(dá)水平顯著低于非膠質(zhì)瘤患者。有研究證實(shí)，miR-432與肝細(xì)胞性肝癌、乳腺癌、前列腺癌等人類癌癥密切相關(guān)[18～20]，然而鮮見報(bào)道m(xù)iR-432與膠質(zhì)瘤存在相關(guān)性。本研究通過向膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U87細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染miR-432類似物或抑制劑，構(gòu)建miR-432過表達(dá)細(xì)胞和敲減細(xì)胞，進(jìn)行CCK-8實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)miR-432類似物或抑制劑對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞活力和遷移能力的影響。CCK-8結(jié)果表明，miR-432過表達(dá)組細(xì)胞活力低于陰性對(duì)照組，而miR-432敲減組細(xì)胞活力高于陰性對(duì)照組。細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)表明，與陰性對(duì)照組細(xì)胞相比，miR-432過表達(dá)組細(xì)胞遷移能力顯著降低，而miR-432敲減組細(xì)胞遷移能力顯著升高。

綜上所述，miR-432在膠質(zhì)瘤患者癌癥組織和血清中表達(dá)均顯著降低，并在神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87中發(fā)揮抑癌作用，我們認(rèn)為miR-432可以作為臨床診斷、預(yù)測(cè)、治療神經(jīng)膠質(zhì)瘤的重要標(biāo)記物。我們將在后續(xù)的研究中探究miR-432抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的活力和遷移能力的分子機(jī)制，為臨床治療腦膠質(zhì)瘤提供有價(jià)值的依據(jù)。