盧峪霞 楊長青
隨著近年來宏基因組學(xué)和代謝組學(xué)的進(jìn)步,發(fā)現(xiàn)了腸道微生態(tài)在很多疾病發(fā)生、發(fā)展中的作用,最新的文獻(xiàn)總結(jié)了腸道菌群在調(diào)節(jié)宿主生理及病理變化中的作用,并將焦點集中于腸—肝軸[1]。Marshallpo[2]于1998年正式提出了“腸-肝軸”的概念。由于腸道菌群失調(diào)及其他因素的影響,導(dǎo)致肝功能異常、肝脂肪變性和結(jié)締組織重塑等慢性肝病進(jìn)展,其中有炎癥介質(zhì)、細(xì)胞因子、氧化應(yīng)激、線粒體功能紊亂等參與。腸道屏障功能被破壞時,腸道滲透性增加導(dǎo)致腸衍生細(xì)菌產(chǎn)品如脂多糖(LPS)的易位,刺激toll樣受體(tlr),激活庫普弗氏細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、樹突細(xì)胞、膽道上皮細(xì)胞、肝星狀細(xì)胞,導(dǎo)致肝纖維化,引起慢性肝病[3]。越來越多的研究表明腸道微生物群失調(diào)與各種肝病有關(guān),如酒精性肝病、非酒精性脂肪肝、肝硬化、自身免疫性肝病和肝癌等。腸道微生態(tài)與慢性肝病之間的關(guān)系,成為了新的研究熱點,本文對近年來這方面最新進(jìn)展作一綜述。
腸道微生物群的變化在誘導(dǎo)和促進(jìn)乙肝病毒引起的慢性肝病進(jìn)展方面起到了重要的作用。為闡明慢性乙肝早期腸道微生物的組成、功能特征,及其在疾病進(jìn)展中的影響,有學(xué)者[4]入組85名低Child-Pugh scores慢性乙型肝炎患者及20名健康對照,收集糞便樣本,應(yīng)用 Illumina MiSeq 測序平臺進(jìn)行菌群鑒定,發(fā)現(xiàn)與對照組比較,慢乙肝組腸道菌群有以下顯著變化:5個物種操作單元(operational taxonomic units, OTUs)增加,包括Actinomyces、Clostridium sensu stricto、unclassified Lachnospiraceae和Megamonas;27個OTUs減少,包括Alistipes、 Asaccharobacter、Bacteroides、Butyricimonas、Clostridium IV、 Escherichia/Shigella、Parabacteroides、 Ruminococcus、unclassified Bacteria、unclassified Clostridiales、Unclassified Coriobacteriaceae、 unclassified Enterobacteriaceae、unclassified Lachnospiraceae和unclassified Ruminococcaceae等。
另有研究在患有乙型肝炎病毒感染的患者中,應(yīng)用定量PCR和免疫學(xué)技術(shù),研究糞便參數(shù),包括糞便占主導(dǎo)地位的細(xì)菌數(shù)量,以及從大腸桿菌、脆弱擬桿菌、梭狀芽胞桿菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌以及一些免疫學(xué)參數(shù)[5]。數(shù)據(jù)分析表明,16 S rRNA基因拷貝數(shù)為柔嫩梭菌、糞腸球菌、腸桿菌、雙歧桿菌和乳酸菌(乳酸菌屬、片球菌屬、明串珠菌屬和魏斯氏菌屬),在乙肝肝硬化患者的腸道中顯示出明顯的變異。雙歧桿菌和腸桿菌科(B/E)比值,表明腸道菌群的定植抗力,從健康對照組(1.15±0.11)、無癥狀攜帶者(0.99±0.09),慢性乙型肝炎患者(0.76±0.08),到肝硬化失代償患者(0.64±0.09)依次顯著降低(P<0.01);表明(B/E)比值可以反映肝臟疾病進(jìn)展過程中腸道微生態(tài)的失調(diào)。致病基因增加表明在肝臟疾病惡化過程中,致病因子的多樣性增加。在失代償乙肝肝硬化患者中,糞便SIgA和腫瘤壞死因子的水平高于其他組,表明機體試圖通過復(fù)雜的自我調(diào)節(jié)系統(tǒng)達(dá)到新的腸道微生態(tài)平衡。
我國學(xué)者[6]設(shè)計了一項通過糞菌移植(FMT)治療經(jīng)過長期NA治療后HBeAg仍未轉(zhuǎn)陰的慢性乙型肝炎患者的病例對照、開放標(biāo)簽的前瞻性研究。該研究納入了18例經(jīng)恩替卡韋或替諾福韋治療3年以上但仍未實現(xiàn)HBeAg消失的慢性乙型肝炎患者?;颊咴诶^續(xù)接受抗病毒治療的同時,5例接受了FMT,13例作為對照。FMT治療組患者接受經(jīng)胃鏡FMT治療,每4周1次,直到HBeAg消失。4例患者接受了1~7次治療,1例患者在第5次FMT治療后退出了試驗。隨訪結(jié)束時,F(xiàn)MT組患者的HBeAg滴度較基線水平有顯著下降,且每次FMT治療后逐步下降。2例患者在接受了1次FMT后即實現(xiàn)HBeAg清除,還有1例在2次FMT治療后清除HBeAg。相反,對照組沒有1例患者清除HBeAg。
最近研究表明[7],腸道微生物群的改變可能與丙型肝炎病毒誘發(fā)慢性肝病(CHC)的發(fā)病機制有關(guān)。HCV患者腸道微生物群的組成在肝臟疾病階段是穩(wěn)定的,不同于非酒精性脂肪肝、乙型病毒性肝炎、艾滋病毒和丙肝病毒共同感染患者的腸道微生態(tài)的不穩(wěn)定性。丙型肝炎病毒感染對腸道滲透性的影響,可導(dǎo)致腸道菌群失調(diào)開始、進(jìn)行以及促炎作用,直至發(fā)展成肝硬化和肝癌。根除HCV消除了腸道微生物群不平衡對肝臟疾病發(fā)展的影響,并可能對益生菌的使用產(chǎn)生影響,從而改變肝硬化進(jìn)展的自然歷史。
Wei等[8]招募了120名乙肝肝硬化患者和120名健康對照組患者,通過對完整的元基因組DNA和生物信息學(xué)方法的高通量測序,對20例乙肝肝硬化患者及20個健康對照組進(jìn)行了比較,分析了糞便微生物群落和功能。發(fā)現(xiàn)兒童Child-Turcotte-Pugh 評分和擬桿菌(P<0.01)呈負(fù)相關(guān),而和腸桿菌科及韋榮氏球菌呈正相關(guān)(P<0.01)。對另外200個糞便微生物群樣本的分析表明,腸道微生物標(biāo)記可能有助于區(qū)分正常人群和肝硬化患者。與對照組相比,在肝硬化患者的糞便微生物群功能多樣性顯著降低。肝硬化病人的糞便微生物群顯示在谷胱甘肽、糖異生、支鏈氨基酸、氮和脂質(zhì)的代謝方面增加(P<0.05),而芳香族氨基酸、膽汁酸的代謝以及與新陳代謝相關(guān)的細(xì)胞周期減少(P<0.05)。研究提示肝硬化患者糞便微生物群有廣泛差異和代謝潛力,腸道微生物群落可以作為調(diào)節(jié)人體新陳代謝平衡的獨立器官,并影響肝硬化患者的預(yù)后。
研究者[9]對在兩種不同的動物設(shè)施中的ALD進(jìn)行了不同的處理,以測試兩種互補策略(糞便微生物群移植和益生菌治療)的有效性,以逆轉(zhuǎn)不正常生活和防止ALD的發(fā)生。在兩種不同的動物設(shè)施中,老鼠被喂食酒精,并使用Lieber DeCarli的飲食(一種酒精性脂肪肝造模飼料)。用對酒精抵抗的供體老鼠的新鮮糞便移植到對酒精敏感的老鼠,每周三次。另一組老鼠在喂食酒精期間給予了果膠。結(jié)果顯示:對酒精敏感的小鼠,酒精引起脂肪變性和肝臟炎癥,與腸道內(nèi)穩(wěn)態(tài)破壞有關(guān),對酒精抵抗的小鼠則不然。腸道菌群分析表明,在酒精敏感的小鼠中,擬桿菌屬的比例顯著減少(P<0.05)。分析顯示,酒精敏感和抵抗小鼠的腸道菌群聚集方式不同。果膠療法引起了對腸道菌群的重大改變,糞菌移植可以使對酒精敏感的小鼠與酒精抵抗小鼠的腸道菌群非常接近,這兩種方法都防止了脂肪變性、炎癥和恢復(fù)腸道內(nèi)穩(wěn)態(tài)。提示對酒精性肝病的敏感性是由老鼠的腸道微生物群引起的,可以用酒精抵抗的供體老鼠糞菌移植到對酒精敏感的老鼠或用益生元來治療酒精誘發(fā)的肝損傷。
有研究證實腸道微生物群會影響個體對酒精性肝病的易感性[10]:接受嚴(yán)重酒精性肝炎患者糞菌移植的老鼠比接受沒有酒精性肝炎的酗酒者糞菌移植的老鼠出現(xiàn)更嚴(yán)重的肝臟炎癥、肝T淋巴細(xì)胞亞群和自然殺傷T淋巴細(xì)胞(NKT) 數(shù)量增加、更多的肝細(xì)胞壞死、腸道通透性增加和更多的細(xì)菌易位;同樣,CD45+淋巴細(xì)胞在內(nèi)臟脂肪組織中增加,在腸系膜淋巴結(jié)中CD4(+)T和NKT淋巴細(xì)胞增多;嚴(yán)重酒精性肝炎和無酒精性肝病的腸道菌群的細(xì)菌豐度和成分存在差異;嚴(yán)重酒精性肝炎的腸道菌群主要是有害細(xì)菌,而無酒精性肝病的腸道菌群主要是腸球菌屬,熊去氧膽酸也更豐富。提示個體對ALD的敏感性在很大程度上是由腸道菌群驅(qū)動的,因此可以通過調(diào)節(jié)腸道菌群來預(yù)防和管理ALD。
為研究益生菌(培養(yǎng)乳酸菌/鏈球菌)對酒精性肝炎治療的影響,一項隨機對照的多中心研究提示7 d口服補充乳酸菌、鏈球菌可以重建腸道菌群和改善患者的內(nèi)毒素(LPS)水平[11]。從2010年9月到2012年4月,有117例患者(益生菌60和安慰劑57)被前瞻性隨機分配,接受7 d的培養(yǎng)乳酸菌/鏈球菌(1 500 mg/d)或安慰劑。通過糞便培養(yǎng),對肝功能試驗、促炎細(xì)胞因子、LPS和菌落形成單位進(jìn)行了研究和比較。結(jié)果顯示兩組中天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶/丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶、堿性磷酸酶、谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶、膽紅素、凝血酶原時間均顯著改善。在益生菌組(基線和之后),白蛋白[(35±7)和(37±6) g/dL,P=0.038]和腫瘤壞死因子[(121±244)和(71±123) pg/mL,P=0.047]顯示出差異。此外,大腸桿菌的菌落形成單位數(shù)量顯著減少[(435±287)和(168±210),P=0.002]。在安慰劑組中,LPS的水平[(1.7±2.8)和(2.0±2.7) EU/mL]顯著增加。在組間比較中,各組間觀察到腫瘤壞死因子(P=0.042)和LPS(P=0.028)的顯著差異。
通過白介素-22、粒細(xì)胞集落刺激因子或法尼酯X受體激動劑、抑制細(xì)胞凋亡、早期肝移植和通過抗生素或糞便移植方法調(diào)節(jié)腸道微生物群來促進(jìn)肝再生,是目前臨床研究的新課題。抑制氧化應(yīng)激、調(diào)節(jié)腸道菌群以及刺激祖細(xì)胞增殖和促炎途徑,將是今后的研究方向[12]。
非酒精性脂肪肝(NASH)的發(fā)生發(fā)展包括基因差異、脂肪堆積、胰島素抵抗和腸道微生物群的變化等多方面因素,其中腸道微生物群被認(rèn)為起著重要作用,會影響肝臟疾病的肝硬化前期和肝硬化,這可能會為診斷、治療和研究帶來新的策略[13]。
非酒精性脂肪肝(NAFLD)出現(xiàn)的進(jìn)展性纖維化是肝臟死亡的最重要預(yù)測因素。在一項前瞻性研究中[14],研究者用從糞便樣本中提取的DNA全基因組測序來描述腸道微生物組的組成。這項研究包括86例經(jīng)過肝活檢證實的NAFLD患者,其中72例有輕/中度(0~2纖維化)NAFLD,14例晚期纖維化(3級或4級纖維化),發(fā)現(xiàn)了一組40個特征(P<0.006),其中包括37種細(xì)菌,被用來構(gòu)建一個隨機的森林分類模型,以區(qū)分出輕/中度的NAFLD與晚期纖維化。該模型具有較強的診斷準(zhǔn)確性(AUC 0.936),用于檢測晚期纖維化,為通過糞便微生物宏基因組學(xué)特征來檢測肝纖維化進(jìn)展提供了初步的證據(jù)。
近年研究表明,腸道菌群作為門靜脈內(nèi)毒素的主要來源可能在肝硬化和肝細(xì)胞癌(HCC)的發(fā)生發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用[15]。Grat等[16]納入15例肝癌患者和15例非肝癌但因肝硬化及晚期肝病而行肝移植的患者,對其進(jìn)行了肝移植MELD評分,對其腸道微生物概況的分析是基于從移植前階段收集的糞便樣本。結(jié)果顯示有無肝細(xì)胞癌的患者在年齡(P=0.506)、性別(P=0.700)、丙型肝炎病毒(P=0.999)和乙型肝炎病毒(P=0.715)感染狀況、酒精性肝病(P=0.999)和MELD評分(P=0.337)等方面相似。值得注意的是,HCC的存在與顯著增加的大腸桿菌的排泄物數(shù)量有關(guān)(P=0.025)。基于大腸桿菌計數(shù)的HCC存在的預(yù)測與接受者-操作曲線下的面積為0.742(95%可信區(qū)間,0.564~0.920)相關(guān)聯(lián),最佳截點為17.728(每1克糞便的菌落形成單位的自然對數(shù))。確定的截點的敏感性和特異性比率分別為66.7%和73.3%。由此認(rèn)為,腸道微生物群與肝細(xì)胞癌的存在有關(guān),其特點是增加糞便大腸桿菌的數(shù)量,大腸桿菌的腸道過度生長可能導(dǎo)致肝癌發(fā)生。
為探討自身免疫性肝炎(AIH)患者腸道滲透、細(xì)菌易位和腸道菌群的變化、并評估這些變化與疾病分期的相關(guān)性,Lin R等[17]招募了24名自身免疫性肝炎患者和8名健康志愿者,通過對十二指腸活檢標(biāo)本的免疫組織化學(xué)分析,對腸內(nèi)緊密連接的完整性進(jìn)行了評估,16 S rDNA定量PCR腸道微生物群的變化,使用ELISA通過脂多糖水平分析細(xì)菌易位,發(fā)現(xiàn)腸道通透性增加、微生態(tài)紊亂、細(xì)菌易位與疾病的嚴(yán)重程度有關(guān),提示自身免疫性肝炎與腸道和腸道微生態(tài)失調(diào)有關(guān),受損的腸道屏障可能在AIH的發(fā)病機制中起著重要的作用。有研究發(fā)現(xiàn)攜帶HLA-DR3轉(zhuǎn)基因AIH小鼠的腸道菌群多樣性和豐度下降,無菌鼠對刀豆蛋白A誘發(fā)的肝損傷有拮抗作用,而腸道抗原則誘導(dǎo)激活自然殺傷T細(xì)胞,參與到肝損傷中,提示了微生物群和AIH之間的密切關(guān)系[18]。
回顧自身免疫性肝炎的發(fā)病機制和治療,發(fā)現(xiàn)了腸道微生態(tài)在先天和適應(yīng)性免疫反應(yīng)方面的作用,從而促進(jìn)系統(tǒng)免疫介導(dǎo)性疾病的發(fā)展[19]。腸道菌群組成的改變會擾亂腸道和系統(tǒng)的免疫耐受。腸內(nèi)的toll樣受體可以識別相關(guān)的分子模式,并形成T輔助淋巴細(xì)胞的子集,這些淋巴細(xì)胞可以與宿主產(chǎn)生抗原交叉反應(yīng)(分子模仿)。激活的腸道衍生的淋巴細(xì)胞可以遷移到淋巴結(jié),而由腸道衍生的微生物抗原可以轉(zhuǎn)移到腸道外的地方。炎癥因子可以在肝細(xì)胞和肝星狀細(xì)胞內(nèi)形成,并且可以驅(qū)動促炎癥、免疫介導(dǎo)性和纖維化反應(yīng)。飲食、益生菌、維生素補充劑、抗生素、減少腸道滲透性的藥物,以及阻斷信號通路的分子干預(yù),可能會成為補充常規(guī)免疫抑制管理的輔助療法。
盡管許多研究表明益生菌對慢性肝病有益,但還是有爭議。有國外學(xué)者研究探討益生菌療法在緩解慢性肝病的腸道細(xì)菌過度生長(SIBO)和通透性方面的功效[20]:53例慢性肝病患者被隨機分為益生菌治療或安慰劑,使用了6種細(xì)菌:雙歧桿菌、乳酸雙歧桿菌、長雙歧桿菌、嗜酸乳桿菌、鼠李糖乳桿菌和嗜熱鏈球菌,4周后研究糞便細(xì)菌、SIBO、腸道通透性和臨床癥狀的變化。結(jié)果提示:益生菌治療組(P<0.001)的糞便中增加了6種益生菌中的3種,而在安慰劑組中,糞便微生物群沒有發(fā)生變化。在許多益生菌治療組中SIBO消失了,但在安慰劑組一個都沒有消失(24%比0%,P<0.05);一般的胃腸道癥狀在益生菌組中也有改善,腸道通透率的提高在益生菌組比安慰劑組稍微多一些(50%比31.3%,P=0.248);糞便中乳酸菌的數(shù)量與腸道通透率負(fù)相關(guān)(P為趨勢<0.05);兩組中肝臟生化學(xué)并沒有顯著改善。由此認(rèn)為,慢性肝病的短期益生菌管理對緩解SIBO和臨床癥狀有效,但對改善腸通透性和肝功能無效。
隨著人們對腸-肝軸認(rèn)識的深入以及系統(tǒng)生物學(xué)的進(jìn)步,腸道微生態(tài)在慢性肝病的發(fā)生發(fā)展中的作用已越來越受到重視,但腸道微生態(tài)紛繁復(fù)雜,慢性肝病多種多樣,要進(jìn)一步闡明其作用機制和管理策略,尚需深入的基礎(chǔ)研究和大樣本的隨機對照臨床研究。