袁夢琴，王艷清，鮮舒，張莉，楊冬詠，劉詩意，程艷香

卵巢癌是一種高侵襲性腫瘤，是全世界婦科惡性腫瘤死亡的主要原因。卵巢癌患者手術(shù)減滅和化療的最初臨床反應(yīng)通常較好，但約80%的晚期卵巢癌患者在12～24個月內(nèi)發(fā)生腫瘤進展和復(fù)發(fā)，并且最終由于化療耐藥而導(dǎo)致死亡，5年總生存率僅約為30%[1]。因此，明確卵巢癌化療耐藥機制并進行靶向干預(yù)，有望成為攻克卵巢癌耐藥這一難題的有效途徑。

外泌體（exosomes）具有廣泛的生物學(xué)效應(yīng)，在很多生理病理過程中發(fā)揮重要的作用，如免疫中抗原呈遞、腫瘤生長與遷移、組織損傷的修復(fù)等。外泌體可由多種不同類型的細胞分泌，包括免疫細胞、肥大細胞和多種腫瘤細胞等，且普遍存在于包括血清、腹水、腦脊液等在內(nèi)的多種生物體液中[2]。不同細胞分泌的外泌體具有不同的組成成分和功能，因此可作為疾病診斷的生物標記物[3]。許多研究表明，外泌體與多種癌癥中腫瘤細胞與腫瘤微環(huán)境中的細胞間耐藥性的傳遞過程密切相關(guān)，其中也包括卵巢癌[4]?，F(xiàn)對外泌體的生理、病理學(xué)效應(yīng)及其在卵巢癌細胞化療耐藥方面的研究進展進行綜述。

1 外泌體的合成與組成

外泌體最初于1983年從綿羊網(wǎng)織紅細胞中鑒定出來，研究發(fā)現(xiàn)，真核生物細胞質(zhì)膜內(nèi)陷形成小的管狀內(nèi)體，并逐漸發(fā)育球形晚期內(nèi)體，其特征是形成腔內(nèi)囊泡（intraluminal vesicles，ILV）。ILV通過局部膜內(nèi)陷芽生，隨機吞噬部分胞質(zhì)內(nèi)容物并將跨膜蛋白和外周蛋白結(jié)合到內(nèi)陷膜中，轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂袆討B(tài)亞細胞結(jié)構(gòu)的多囊泡體（multi-vesicle bodys，MVBs），隨后當MVBs與細胞膜融合，其內(nèi)的囊泡再次凹陷，以內(nèi)出芽方式形成顆粒狀小囊泡，并釋放入細胞外環(huán)境，即外泌體[5]。

外泌體含有許多不同的細胞表面分子，能夠同時與許多不同的細胞受體結(jié)合，從而參與細胞之間的物質(zhì)交換?，F(xiàn)有研究表明，外泌體內(nèi)成分非常復(fù)雜，有多種核酸[微小RNA（microRNA）、長鏈非編碼RNA（lncRNA）、環(huán)狀RNA（circRNA）等]、蛋白、膽固醇等組成。外泌體內(nèi)含蛋白包括促膜融合的胞質(zhì)蛋白Rabs家族及膜聯(lián)蛋白（膜聯(lián)蛋白Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ和Ⅺ），跨膜蛋白（CD63、CD81和CD9），分子伴侶熱休克蛋白（HSP60、HSP70和HSP90）以及一些細胞特異性蛋白，如MHC-Ⅱ（抗原提呈細胞來源）等[6]。近年來，隨著研究的逐漸深入，現(xiàn)已證實除蛋白質(zhì)外，外泌體還攜帶多種核酸類物質(zhì)，如微小RNA（miRNA，包括miR-373、miR-200等）、lncRNA（包括FMR1-AS1、HISLA等）以及少量的circRNA（如circ-0044520）等，并通過此途徑參與細胞間物質(zhì)的傳遞[7]。

2 外泌體的生理學(xué)效應(yīng)

近年來研究發(fā)現(xiàn)，外泌體攜帶有多種生物活性物質(zhì)，細胞可以通過分泌外泌體與鄰近或遠距離細胞膜融合，介導(dǎo)生物活性物質(zhì)由供體細胞向受體細胞的轉(zhuǎn)運，進而在調(diào)節(jié)細胞生理活動，維持細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)及在細胞間信息、物質(zhì)交流等方面發(fā)揮著重要的作用[8]。根據(jù)細胞和組織的來源不同，外泌體有著不同的生物學(xué)效應(yīng)，如來源自內(nèi)皮干細胞的外泌體中的miR-126和miR-296可促進胰島血管內(nèi)皮細胞中的血管生成，該過程對于移植的胰島植入和存活至關(guān)重要。此外，外泌體還具有抗原提呈、免疫逃逸等免疫調(diào)節(jié)作用[9]。

3 外泌體與腫瘤

腫瘤微環(huán)境主要由成纖維細胞、內(nèi)皮細胞和淋巴細胞浸潤組成，可促進腫瘤進展，已有證據(jù)顯示腫瘤微環(huán)境可通過分泌蛋白質(zhì)等生物活性物質(zhì)促進正常細胞發(fā)生癌變及腫瘤進展。近年來多項研究表明，除經(jīng)典途徑外，腫瘤微環(huán)境中的循環(huán)外泌體和靶細胞表達的跨膜分子之間的表面相互作用也可啟動細胞間通訊。還有研究表明癌細胞比正常細胞分泌更多的外泌體，提示外泌體與腫瘤有著明顯相關(guān)性[10]。這些促進腫瘤發(fā)生、發(fā)展的外泌體既可來自非腫瘤細胞，也可來自腫瘤細胞，如侵襲性乳腺癌細胞可通過增加基質(zhì)細胞外泌體中的末端暴露的RN7SL1的含量，從而促進腫瘤生長及耐藥發(fā)生[11]。腫瘤來源的外泌體以自分泌或旁分泌等信號途徑影響其微環(huán)境，從而促進腫瘤新生血管形成、骨髓環(huán)境和腫瘤基質(zhì)重塑、促進腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移、逃避機體免疫機制、產(chǎn)生化學(xué)抗性等[12]。如黑色素瘤[13]、膀胱癌[14]衍生的外泌體在腫瘤微環(huán)境中促進上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT），從而促進癌細胞的轉(zhuǎn)移和發(fā)展，還有研究表明腫瘤外泌體可分泌抑制自然殺傷細胞活性并誘導(dǎo)T細胞凋亡的因子，為腫瘤自身創(chuàng)造了良好的生長環(huán)境。

4 外泌體在卵巢癌化療耐藥方面的作用機制

卵巢癌是女性生殖器常見的三大惡性腫瘤之一，由于卵巢位于盆腔深部，早期病變不易發(fā)現(xiàn)，晚期病變也缺乏有效的治療手段，因此卵巢癌致死率居婦科惡性腫瘤首位。目前卵巢癌主要的治療方法為腫瘤細胞減滅術(shù)和手術(shù)后輔助紫杉醇聯(lián)合鉑類化療，初始反應(yīng)一般較好，然而，由耐藥性導(dǎo)致的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移十分常見[15]。大量研究發(fā)現(xiàn)，外泌體對于卵巢癌的化療耐藥性的發(fā)生可能起著非常重要的調(diào)節(jié)作用。

4.1 卵巢癌細胞通過外泌體增加化療藥物的排出介導(dǎo)化療耐藥 Safaei等[16]的研究發(fā)現(xiàn)順鉑（CDDP）耐藥的卵巢癌細胞釋放出的外泌體中順鉑含量是CDDP敏感的卵巢癌細胞的2.6倍。卵巢癌細胞通過釋放出更多的外泌體來增加順鉑的排放，同時外泌體中轉(zhuǎn)運蛋白的增多也與耐藥產(chǎn)生有關(guān)。前期研究表明，正常情況下CDDP在溶酶體中濃縮，而CDDP抗性的腫瘤的溶酶體室明顯縮小，約為敏感細胞中的溶酶體區(qū)室的40%，并且外泌體釋放更多的CDDP輸出轉(zhuǎn)運蛋白，包括MRP2、ATP7A、ATP7B和溶酶體相關(guān)蛋白1（LAMP1）。近年來也有研究表明攜帶P-糖蛋白（P-gp）的外泌體與卵巢癌紫杉醇及阿霉素耐藥性有關(guān)。P-gp的作用是從細胞中外排化療藥物，維持化療藥物在細胞內(nèi)的低濃度水平，其升高意味著對化療產(chǎn)生耐藥性。Zhang等[17]研究發(fā)現(xiàn)在膜結(jié)合蛋白水平，P-gp通過外泌體的細胞間轉(zhuǎn)移途徑在人卵巢癌細胞之間實現(xiàn)“共享”。通過比較野生型親本系（A2780/WT）與紫杉醇耐藥卵巢癌細胞（A2780/PTX）發(fā)現(xiàn)，耐藥細胞產(chǎn)生并釋放更多的外泌體，且A2780/PTX細胞分泌的外泌體攜帶大量P-gp，而A2780/WT細胞中幾乎檢測不到P-gp。由于高水平的P-gp表達，阿霉素不能進入A2780/PTX細胞的細胞核而產(chǎn)生耐藥。此外，將卵巢癌耐藥細胞來源的外泌體與其親本系共孵育后，發(fā)現(xiàn)敏感細胞對阿霉素和紫杉醇的抗性均較未孵育前高出5倍。這提示外泌體中的P-gp促進卵巢癌細胞對紫杉醇和阿霉素的耐藥性。也有研究表明外泌體中的肺耐藥相關(guān)蛋白（LRP）也可通過加速藥物排出細胞[18]，以及增加DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1（DNMT1）的表達[19]，介導(dǎo)卵巢癌化療耐藥發(fā)生。

4.2 膜聯(lián)蛋白A3（Annexin A3）的分泌增加可介導(dǎo)卵巢癌化療耐藥性的產(chǎn)生 Yan等[20]通過蛋白質(zhì)組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)Annexin A3（一種Ca2+和磷脂結(jié)合膜聯(lián)蛋白家族）的表達在鉑耐藥卵巢細胞系中顯著增加，且可能是通過阻止細胞中鉑的攝取或積累來介導(dǎo)卵巢癌耐藥。Yin等[21]的研究也表明，與親本細胞系A(chǔ)2780和SKOV3相比，鉑類耐藥卵巢癌細胞系A(chǔ)2780/Cis和SKOV3/Cis表達更高水平的Annexin A3，且Annexin A3高表達的卵巢癌細胞在其細胞質(zhì)中具有更多的囊泡，其中一些囊泡是Annexin A3+，提示Annexin A3的分泌可能與含有Annexin A3的囊泡的胞吐作用和外泌體的釋放有關(guān)。通過將20例鉑耐藥患者、30例鉑敏感患者與正常女性的血清進行對比發(fā)現(xiàn)，鉑類耐藥卵巢癌患者的Annexin A3水平顯著升高。這些研究均提示，Annexin A3的增加可能與外泌體介導(dǎo)耐藥相關(guān)，可能成為卵巢癌及順鉑耐藥的潛在生物學(xué)標志物。

4.3 外泌體通過誘導(dǎo)SMAD同源物4（SMAD4）突變誘導(dǎo)EMT來介導(dǎo)卵巢癌化療耐藥 SMAD是轉(zhuǎn)化生長因子β（TGF-β）信號通路的效應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子，而SMAD4主要與受體激活的SMAD（SMAD2或SMAD3）結(jié)合，形成異二聚體，易位進入細胞核后，在核內(nèi)與其他輔因子結(jié)合并啟動靶基因的轉(zhuǎn)錄[22]。Crow等[1]通過使用不同鉑類耐藥程度的卵巢癌細胞系來研究外泌體對耐藥性的影響，發(fā)現(xiàn)敏感細胞系A(chǔ)2780細胞經(jīng)高度耐藥細胞C30和CP70分泌的外泌體預(yù)處理后，其細胞活力分別增加近1.5倍和2倍，同時細胞凋亡減少。當用卡鉑耐藥的OVCAR10細胞分泌的外泌體處理A2780細胞時，也觀察到類似的結(jié)果。對卵巢癌細胞系進行DNA測序結(jié)果顯示，在高度鉑耐藥細胞系（C30、CP70和OVCAR10）中均存在SMAD4的體細胞突變。進一步研究發(fā)現(xiàn)，鉑耐藥細胞系中EMT標志物顯著上調(diào)，EMT標志物已被確立為卵巢癌耐藥性的重要介質(zhì)。此外，用鉑耐藥細胞系衍生的外泌體處理敏感的A2780細胞后，EMT標志物也會顯著上調(diào)。綜上，鉑耐藥的卵巢癌細胞可通過衍生的外泌體導(dǎo)致鉑類敏感的卵巢癌細胞發(fā)生SMAD4突變，進而導(dǎo)致鉑類藥物敏感性降低。

4.4 miRNA通過外泌體轉(zhuǎn)移到鄰近基質(zhì)細胞介導(dǎo)卵巢癌紫杉醇耐藥及惡性表型 Au Yeung等[23]發(fā)現(xiàn)miR-21可通過外泌體從基質(zhì)成纖維細胞轉(zhuǎn)移到受體卵巢癌細胞系SKOV3ip，并且轉(zhuǎn)移的miR-21的量取決于外泌體中遞送的miR-21的量。該研究用從miR-21+MEFs（小鼠胚胎成纖維細胞）及miR-21-MEFs分離出的同等量的外泌體處理2種卵巢癌細胞OVCA432和SKOV3，給予紫杉醇治療后顯示miR21+MEFs外泌體處理的細胞中殘留的細胞數(shù)量更高。將轉(zhuǎn)染miR-21的CAAs和CAFs來源的外泌體與SKOV3細胞共孵育后發(fā)現(xiàn)，凋亡酶激活因子1（APAF1）mRNA水平顯著降低，進一步實驗驗證了基質(zhì)細胞通過外泌體將miR-21遞送至卵巢癌細胞，并激活A(yù)PAF1來增加卵巢癌細胞的侵襲性及介導(dǎo)卵巢癌細胞紫杉醇耐藥。同時，另有研究也表明多個miRNA對卵巢癌耐藥起著重要的介導(dǎo)作用，如Pink等[24]研究發(fā)現(xiàn)miR-21-3p可能在卵巢癌細胞中通過靶向NAV3來誘導(dǎo)順鉑耐藥。

5 結(jié)語

綜上所述，外泌體具有廣泛的生物學(xué)效應(yīng)，對機體的生理病理都起重要的調(diào)控作用。卵巢癌源性的外泌體對于卵巢癌的早期診斷、耐藥形成及治療等方面的研究有著重要的臨床意義。目前研究發(fā)現(xiàn)外泌體對于卵巢癌化療耐藥的調(diào)節(jié)作用可能是一個重大的突破點，有望成為卵巢癌化療療效評估的潛在生物學(xué)標志物及治療新靶點。然而目前外泌體的研究仍面臨一些困境，比如外泌體的分離提純等。隨著外泌體相關(guān)研究不斷深入，外泌體在卵巢癌化療耐藥方面的臨床應(yīng)用將為鉑類耐藥的卵巢癌的治療提供新的方法。