王賽賽，金海霞

1987年首例使用冷凍保存的MⅡ卵母細胞嬰兒出生，目前使用卵母細胞冷凍保存后出生的嬰兒約1 000余例，MⅡ期卵母細胞的成功冷凍保存，其發(fā)現(xiàn)和廣泛應用是過去十年中人類輔助生殖的最大成功之一。隨著冷凍卵母細胞保存生育力的需求增加，其低溫保存越來越引起重視。盡管卵母細胞冷凍技術已經(jīng)取得了很大的突破，且其成功率也逐年增高，但該技術尚未得到廣泛應用。玻璃化冷凍（vitrification cryopreservation）技術是一種快速冷凍技術，其基本原理是利用高濃度的滲透性冷凍保護劑[如：乙二醇（EG）、二甲基亞砜（DMSO）、聚乙二醇等]和非滲透性保護劑蔗糖，經(jīng)急速降溫使脫水后樣本殘留的水分由液態(tài)轉(zhuǎn)化為類似玻璃的非晶體化狀態(tài)。卵母細胞玻璃化冷凍保存對隨后的胚胎發(fā)育有很大影響[1]，闡述其對卵母細胞的影響至關重要。

1 卵母細胞冷凍的必要性

在輔助生育過程中，胚胎冷凍起了重要的作用。但在某些特殊的情況下，必須進行卵子的冷凍：①有些國家因為法律和宗教的因素，不可以進行胚胎的冷凍，但可以進行卵子的冷凍，如西班牙；②取卵當天男方未取到精子；③未婚的健康女性保存生育能力；④患有嚴重疾病影響生育功能的女性提早保存生育力；⑤一些夫婦要求冷凍女方卵子，而不是胚胎；⑥對于一些卵母細胞成熟障礙患者（如多囊卵巢綜合征）的生育力保存。

哺乳動物的卵母細胞是體內(nèi)最大的細胞，而且是一個體積/表面積大的細胞，由顆粒細胞和透明帶包圍，顆粒細胞又分為壁顆粒細胞（MGs）和卵丘細胞（CCs）。在卵泡生長發(fā)育過程中，MGs主要作用為類固醇激素合成和在排卵過程中促進卵泡壁破裂，CCs與卵母細胞之間通過縫隙連接和旁分泌信號通路進行復雜的密切聯(lián)系，CCs主要與卵母細胞共同組成卵丘卵母細胞復合物（cumulus-oocyte complex，COCs），形成特定的局部微環(huán)境，其為卵母細胞提供三大代謝所需的營養(yǎng)物質(zhì)，影響卵泡發(fā)育的始終；CCs在竇卵泡階段通過縫隙連接傳遞環(huán)磷酸腺苷（cAMP）和環(huán)磷酸鳥苷（cGMP）等維持卵母細胞的減數(shù)分裂停滯；在卵母細胞成熟期，CCs和卵母細胞共同完成卵丘擴張以及恢復減數(shù)分裂。

哺乳動物未成熟卵母細胞包括MⅠ期和GⅤ期卵母細胞，因其本身特殊的生物學結構和低溫敏感性，冷凍可能會帶來一些問題，如大多數(shù)哺乳動物（包括人類）的微管減數(shù)分裂紡錘體對冷卻非常敏感；冷凍可能導致不同程度的主軸瓦解；由于一些微管的松散或凝結導致染色體散在排列于細胞中。因不同減數(shù)分裂階段的卵母細胞可能對低溫保存表現(xiàn)出不同的敏感性，GⅤ期卵母細胞相較于MⅠ期卵母細胞內(nèi)的染色質(zhì)較松散且有核膜包繞，比MⅠ期更能抵抗冷凍損傷及非整倍體的風險，且未成熟卵母細胞比MⅡ階段的卵母細胞對低溫更敏感、細胞膜穩(wěn)定性更低[2]。

目前哺乳動物卵母細胞因其特殊的生物學結構和低溫敏感性，導致玻璃化冷凍后有關卵母細胞成熟的基因表達障礙[3]，以及卵母細胞本身的染色體等的變化導致受精率降低及受精后多倍體形成增多[4]，其仍是最難的低溫保存細胞類型。

2 CCs在玻璃化冷凍中的作用

在正常卵泡發(fā)育過程中，CCs和卵母細胞聯(lián)系緊密，其能幫助轉(zhuǎn)運卵母細胞發(fā)育和成熟過程中必須的營養(yǎng)物質(zhì)、信號分子以及代謝產(chǎn)物。研究認為CCs對卵母細胞尤其未成熟卵母細胞冷凍保存有顯著的保護作用，相比裸卵母細胞（denuded oocyte，DO）冷凍保存，COCs的冷凍保存更有優(yōu)勢。CCs可以使得冷凍保護劑逐步滲透并且在解凍過程中防止?jié)B透壓劇烈變化對卵母細胞的損傷，因此卵母細胞存活率和受精率較裸卵母細胞顯著增加[5]。陳雅等[6]研究表明，玻璃化冷凍對有完整CCs的卵母細胞能減少對其細胞骨架的損傷，并可改善卵子復蘇及GⅤ期卵母細胞凍融后胚胎發(fā)育結局。而Kokotsaki等[7]研究表明，玻璃化冷凍后腫瘤壞死因子α（TNF-α）表達量增加，而其他凋亡基因[脂肪酸合成酶（FAS），B-細胞淋巴瘤因子2（BCL-2），Bcl-2相關X蛋白（Bax）]或溫度相關基因[熱休克蛋白27（HSP27），HSP47，HSP70，RBM3-RNA結合序列蛋白3]不受影響，玻璃化冷凍影響人顆粒細胞的生存能力。

3 玻璃化冷凍卵母細胞分子及基因方面的研究

目前關于冷凍對卵母細胞影響的研究主要集中在卵母細胞顯微結構和染色質(zhì)的變化，而在分子和基因?qū)用嫔系难芯枯^少。隨著玻璃化冷凍技術逐漸發(fā)展與成熟，從分子及基因?qū)用嫣骄坎ＡЩ鋬鰧τ诼涯讣毎母淖円殉蔀檠芯繜狳c。有研究表明，玻璃化冷凍牛卵母細胞后有102個基因表達水平差異顯著，其中12個主要參與細胞周期、受精和糖代謝的基因上調(diào)，90個主要參與線粒體、核糖體蛋白、細胞骨架、跨膜蛋白、細胞周期和鈣離子的基因下調(diào)[8]。在卵母細胞成熟過程中，基因的及時表達對胚胎的進一步發(fā)育具有重要意義，冷凍保存可能會對其造成不同程度的損害。研究表明，在人卵母細胞玻璃化冷凍、蛋白質(zhì)泛素化降解機制相關基因及生長激素信號通路相關基因[如胰島素生長因子1受體（IGF1R）、胰島素受體底物1（IRS1）]均表達下調(diào)，其中影響最大的分子和細胞功能是細胞周期，包括在玻璃化冷凍MⅡ卵母細胞庫中特異性下調(diào)的mRNA多聚腺苷酸化基因[如蘇氨酸和酪氨酸激酶（TTK）、細胞周期蛋白A1（CCNA1）、微染色體維持10（MCM10）][9]。在人卵母細胞中，慢速冷凍和玻璃化冷凍均可誘導不同細胞器重塑和膜再循環(huán)以及減數(shù)分裂紡錘體重組[10]。

3.1 卵母細胞骨架的改變 細胞骨架由微絲、微管和中間絲三個纖維系統(tǒng)組成。其不僅是一個介導功能分化的結構系統(tǒng)，而且還有助于許多細胞過程，如運輸、有絲分裂、分泌、細胞擴張的形成、細胞間通信和凋亡等?？p隙連接（gap junctions，GJs）由連接素（connexins，CXs）形成，其連接相鄰細胞的細胞質(zhì)和半通道（hemichannels，HCs）。有研究分別對牦牛GⅤ期和體外成熟后MⅡ期卵母細胞分別進行玻璃化冷凍[11]，發(fā)現(xiàn)與影響細胞骨架[如細胞角蛋白8（CK8），β肌動蛋白（ACTB）]和縫隙連接（如GJA1）相關的基因在冷凍MⅡ期表達更高，這種差異可能導致體外成熟至MⅡ期卵母細胞后進行玻璃化冷凍存活率更高。Morató等[12]通過對牛成熟卵母細胞進行玻璃化冷凍，發(fā)現(xiàn)在沒有添加細胞骨架穩(wěn)定劑（紫杉醇）的卵母細胞中，紡錘體結構異?；蛉旧w分散或解離的比例明顯增高。研究表明，在對大鼠未成熟卵母細胞進行玻璃化后，對于細胞周期階段、染色質(zhì)和細胞骨架完整性的損害可能在受精后才會顯現(xiàn)出來[13]。另有學者研究發(fā)現(xiàn)，使用液氦玻璃化冷凍未成熟卵母細胞降低了低溫損傷對細胞骨架結構的影響，提高了牛未成熟卵母細胞的存活能力[14]。

3.2 影響卵母細胞成熟的基因改變 臨床上常會出現(xiàn)卵母細胞不完全成熟或全部不成熟的患者，玻璃化冷凍也可影響與卵母細胞成熟有關的基因改變。轉(zhuǎn)化生長因子β（TGF-β）超家族有超過35個成員，其對卵巢功能作用顯著，骨形態(tài)發(fā)生蛋白15（BMP15）和生長分化因子9（GD F9）基因是TGF-β超家族的相關成員，其中GDF9廣泛表達于各器官組織，但在卵巢組織中高表達，而BMP15只在卵巢表達，它們是影響卵泡生長發(fā)育和卵巢功能較為重要的卵母細胞分泌因子（OSFs）。Dong等[15]首次于小鼠體內(nèi)證明GDF9影響卵泡發(fā)育。近年研究表明COCs中一些基因（如GDF9和BMP15）的表達可影響卵母細胞的成熟。Liu等[16]通過對牛卵母細胞的研究表明，BMP15和GDF9具有協(xié)同作用，可以通過作用于miR-375進而影響Ⅰ型受體活化蛋白受體樣激酶4（ALK4）和Ⅱ型受體骨形態(tài)發(fā)生蛋白受體2（BMPR2）的表達水平和Smad信號通路的激活，影響卵丘細胞增殖、擴張和凋亡。另有研究表明，GDF9和BMP15的基因表達可抑制卵丘細胞凋亡[17-18]。那么玻璃化冷凍未成熟卵母細胞是否影響基因的改變呢，Azari等[19]分別對牛的未成熟卵母細胞進行玻璃化冷凍，發(fā)現(xiàn)玻璃化冷凍后的COCs中GDF9和BMP15表達水平相對較低，且可降低核成熟率和卵裂率，說明玻璃化冷凍可使影響卵母細胞成熟的基因（如GDF9和BMP15）表達下降，進而降低卵母細胞成熟率。另有學者在綿羊COCs玻璃化冷凍后，發(fā)現(xiàn)成熟基因（GDF9、BMP15）等表達受阻[3]。

目前探討基因轉(zhuǎn)錄水平與卵母細胞成熟的關系成為研究熱點，微小RNA（miRNA）是一類小的（19～25 bp）非編碼RNA，通過控制mRNA穩(wěn)定性或翻譯來多樣地調(diào)節(jié)基因表達[20]。這些非編碼RNA的功能仍然相對未知，其是影響生長、發(fā)育、分化和凋亡的重要細胞調(diào)節(jié)因子。有研究發(fā)現(xiàn)在豬卵母細胞成熟過程中，miR-378的過表達抑制了卵母細胞從GⅤ到MⅡ期的進展[21]。CCs中miR-378的過表達抑制了與卵母細胞成熟相關基因的表達，在CCs中miR-378的過表達抑制了CYP19A1基因[由卵巢卵泡膜細胞產(chǎn)生的雄激素通過細胞色素P450芳香酶（由CYP19A1基因編碼）轉(zhuǎn)化為雌二醇（E2）]的表達，導致E2含量顯著下降，并發(fā)現(xiàn)在早期成熟培養(yǎng)基中補充E2可以逆轉(zhuǎn)miR-378對減數(shù)分裂進程的影響，提示通過靶向芳香酶抑制E2的產(chǎn)生可能是miR-378調(diào)控COCs成熟的機制之一[21-22]。有研究表明，在小鼠體內(nèi)進行miR-378過表達，發(fā)現(xiàn)其改變了CCs中的基因表達，并可能通過抑制卵母細胞-CCs相互作用或誘導細胞凋亡間接影響卵母細胞成熟能力[23]。

3.3 影響卵母細胞凋亡的基因改變 在哺乳動物生育細胞體系中，正常程序化死亡占99.9%，其最終可導致不孕和卵巢功能衰竭。目前，卵母細胞的存活仍是未成熟卵母細胞玻璃化冷凍/解凍后所面臨的主要難題，Men等[24]研究表明，玻璃化冷凍可使牛卵母細胞在隨后培養(yǎng)過程中通過細胞凋亡而退化。BCL2是抗凋亡基因，其促進細胞存活；BAX是促凋亡基因，其促進細胞死亡；P53是抑癌基因，其維持基因組的完整，修復缺陷基因。有研究表明，在對山羊未成熟卵母細胞進行玻璃化冷凍后，發(fā)現(xiàn)BAX/BCL2比值增加，并表明在玻璃化GⅤ期卵母細胞后凋亡基因（Fas、FasL、Bax和Bcl-2）的上調(diào)可能是玻璃化后發(fā)育能力下降的早期指標[25]。Dai等[26]發(fā)現(xiàn)在豬的卵母細胞玻璃化過程中，線粒體的功能和形態(tài)遭到很大的破壞，而且在凍融后可出現(xiàn)早期凋亡，表明內(nèi)源性線粒體通路也可能參與卵母細胞玻璃化后的凋亡。

3.4 影響卵母細胞發(fā)育能力的基因改變 研究已證明玻璃化冷凍會降低哺乳動物卵母細胞的發(fā)育能力，這與玻璃化卵母細胞的異常mRNA表達密切相關，Shirazi等[27]發(fā)現(xiàn)在卵母細胞玻璃化過程中，有8個基因參與了卵母細胞表觀遺傳修飾[DNA甲基轉(zhuǎn)移酶3β（DNMT3B），組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶1（HAT1），組蛋白去乙酰化酶1（HDAC1），DNMT1]、染色體重塑[肌動蛋白依賴的染色質(zhì)調(diào)節(jié)因子1（SMARCAL1）]和轉(zhuǎn)錄[信號轉(zhuǎn)導和轉(zhuǎn)錄激活因子3（STAT3）]，在卵母細胞進行玻璃化后HDAC1表達減少，而STAT3、SMARCAL1和DNMT3B表達增加，基因組不同程度的激活可能是影響玻璃化冷凍后卵母細胞發(fā)育能力的原因。

3.5 玻璃化冷凍對于脂質(zhì)代謝的影響 脂質(zhì)作為細胞的一種能量物質(zhì)和細胞組成成分在卵母細胞中大量存在，已有假設認為細胞脂質(zhì)和細胞骨架充分之間的聯(lián)系非常緊密，冷凍時脂質(zhì)變硬，可導致骨架結構的變形和瓦解，有些可致永久性損傷。Schwarz等[28]通過對牛COC和胚胎的研究表明，環(huán)磷酸鳥苷依賴的蛋白激酶（cGMP-PKG）途徑參與控制卵母細胞的脂解作用，cGMP水平與脂質(zhì)間呈負相關，在體外成熟（in vitro maturation，IVM）和體外培養(yǎng)（in vitro culture，IVC），cGMP可能通過影響脂解相關基因的表達來調(diào)控CCs的脂質(zhì)含量，在胚胎中可能通過抑制cGMP水解降低脂質(zhì)含量，但其不改善胚胎冷凍耐受性。

4 結語

卵母細胞冷凍技術是保存女性生育力的主要途徑，但冷凍保存易對卵母細胞造成不可逆的損傷。目前的研究主要集中在動物（如牛、羊和豬等），還未有任何研究從分子層面全面分析玻璃化冷凍對人卵母細胞尤其未成熟卵母細胞的損傷以及CCs在未成熟卵母細胞冷凍保存中對基因表達的影響，進而為完善未成熟卵母細胞冷凍技術提供有力的證據(jù)。雖然人全基因組表達芯片技術在人卵母細胞甚至單個卵母細胞上成功應用，但是該技術還未用于研究卵母細胞凍存過程中的基因表達變化，這仍有待探討。隨著輔助生殖技術（ART）的廣泛應用，給不孕患者帶來了福音，卵母細胞冷凍不可或缺，尤其適用于那些激素不敏感型、卵巢過度刺激綜合征（OHSS）及多囊卵巢綜合征（PCOS）患者，也可適用于激素敏感型患者在應用促排卵藥前保留生育力。