安愛虎，周文策，張輝

（1.蘭州大學 第一臨床醫(yī)學院，甘肅 蘭州 730099；2.蘭州大學第一醫(yī)院 普外二科，甘肅 蘭州 730099）

膽石癥是全世界的主要公共衛(wèi)生問題之一，是常見病和多發(fā)病[1-3]。在西方國家，膽石病患病率男性為7.9%，女性為16.6%，但很少報道有膽總管結(jié)石[4]。相比之下，我國膽石病檢出率為4.2%～12.1%[5]，其中膽總管結(jié)石約占10%～20%[3，5]。膽總管結(jié)石屬于膽石病范疇，依據(jù)結(jié)石來源可分為原發(fā)性膽總管結(jié)石和繼發(fā)性膽總管結(jié)石。原發(fā)性膽總管結(jié)石初始于膽總管，絕大多數(shù)為棕色色素結(jié)石；而繼發(fā)性膽總管結(jié)石是指原發(fā)于膽囊，經(jīng)膽囊管遷移至膽總管的結(jié)石，多為膽固醇類或黑色素結(jié)石[6-7]。值得注意的是，兩類膽總管結(jié)石的發(fā)病機制不同，故本文中若無特殊說明，“膽總管結(jié)石”皆指原發(fā)性膽總管結(jié)石。

膽總管結(jié)石在我國是一種常見且危害嚴重的疾病，由于其殘石率、復發(fā)率及再手術(shù)率高，使其臨床療效尚不令人滿意。因此，研究其病因及發(fā)病機制對于有效預防和治療本病具有重要意義。近年來分子生物學技術(shù)的發(fā)展和應用，為膽道微生物群落與膽總管結(jié)石形成關(guān)系的研究提供了一個新的契機，使得結(jié)石形成機制的研究進入了新階段。本文將針對膽道微生態(tài)與膽總管結(jié)石形成關(guān)系的研究進展進行綜述。

1 膽道微生態(tài)與膽總管結(jié)石的關(guān)系研究

膽總管結(jié)石發(fā)病機制復雜，目前尚未完全清楚。隨著研究的不斷深入，許多證據(jù)表明膽道微生態(tài)與膽總管結(jié)石的形成密切相關(guān)[8]。

早在20世紀初期就有學者發(fā)現(xiàn)膽石病患者的膽汁中有病原菌存在，并鑒定出了大腸埃希菌、鏈球菌及葡萄球菌等多種細菌，推測膽道細菌感染可能是結(jié)石形成的重要原因之一[9]。直到1966年，日本學者Maki[10]提出了經(jīng)典的膽紅素鈣結(jié)石成因假說：感染膽汁中的細菌，尤其是大腸埃希菌，可產(chǎn)生大量外源性β-葡萄糖醛酸苷酶（β-G），將水溶性的結(jié)合膽紅素水解為不溶于水的游離膽紅素和葡萄糖醛酸，前者再與膽汁中的鈣離子結(jié)合形成膽紅素鈣沉淀析出。Higashijima等[11]和Leung等[12]采用體外實驗的方法證實了這一結(jié)論。我國學者蔡紅嬌等[13]對膽紅素鈣結(jié)石的形成機制做了進一步的探索，發(fā)現(xiàn)膽道細菌感染對肝臟的損害以及細菌酶的作用，改變了膽汁的理化性質(zhì)，破壞了膽汁膠體的平衡狀態(tài)，形成成石膽汁，其中去氧膽酸等疏水性物質(zhì)在酸性促發(fā)物的作用下凝集成核，進而促進結(jié)石形成。

為了進一步研究細菌在結(jié)石形成過程中的作用，Stewart等[14]應用掃描電子顯微鏡（SEM）對棕色色素結(jié)石進行觀察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)無論是新鮮結(jié)石，還是風干結(jié)石，其核心和外周各層均有細菌存在。深入的分析表明不僅細菌的某些代謝產(chǎn)物參與結(jié)石的形成，細菌體本身也是結(jié)石重要的構(gòu)成成分[14-15]。Leung等[16]采用同樣的方法證實了這一研究成果，此外，還用透射電子顯微鏡（TEM）觀察到細菌被釕紅染色的膜狀物質(zhì)所覆蓋，推測其可能是細菌生物膜。這種由多糖、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等物質(zhì)組成的生物膜充當了細菌的保護層，允許其在膽道惡劣的環(huán)境中生存、繁殖[17]。電鏡在膽道微生態(tài)研究方面的應用能夠敏感地發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)陰性的細菌，再次證實了細菌參與棕色色素結(jié)石的成核及生長，然而卻無法明確其作用機制。

隨著分子生物學技術(shù)的發(fā)展和應用，非培養(yǎng)依賴的微生物鑒別方法逐漸應用到膽道微生態(tài)研究領(lǐng)域。1995年，Swidsinski等[18]首次運用PCR技術(shù)和16S rRNA序列分析法在膽結(jié)石中發(fā)現(xiàn)了細菌DNA，并得到Kawai等[19]的進一步證實。劉敏等[20]運用PCR-DGGE技術(shù)對棕色色素結(jié)石患者的膽汁和結(jié)石標本進行分析，鑒定出了包括埃希氏菌屬在內(nèi)的9個屬的細菌，其中，大腸埃希菌在兩種標本中的檢出率都是最高的；此外，在膽汁與結(jié)石的DGGE指紋圖譜相似性分析中，菌落結(jié)構(gòu)的最高相似性系數(shù)僅為32.3%，這說明膽汁和結(jié)石中的細菌群落并不完全相同。

近年來，基于下一代高通量測序技術(shù)的宏基因組學逐漸應用到人類微生物組的研究，使人們對人體微生態(tài)有了更加全面、深入的認識[21]。吳韜等[22]首次采用16S rRNA擴增子測序（簡稱16S測序）技術(shù)對膽囊結(jié)石患者進行研究，結(jié)果顯示細菌DNA檢出率為100%，并鑒定出膽道核心細菌106種，然而僅有33.96%能匹配到已知的菌種；此外，還發(fā)現(xiàn)膽囊結(jié)石患者存在明顯的腸道菌群失調(diào)。Shen等[23]對膽總管結(jié)石患者的膽總管膽汁樣本進行全宏基因組鳥槍法（whole-metagenome shotgun，簡稱WMS）測序和16S測序分析，共鑒定出了173種菌種，主要類聚為兩大類，其一以來自腸道、口腔和呼吸道的細菌為主，其二以來自口腔和呼吸道的細菌為主。然而，來自口腔和呼吸道的細菌要比腸道細菌更為普遍，因此，除了腸道細菌之外，口腔和呼吸道細菌也可能是膽道細菌的重要來源。同時，基于WMS測序該研究還鑒定出了可能與結(jié)石形成和膽汁耐受有關(guān)的細菌基因，如uidA基因（編碼β-G）和pldA基因（編碼磷脂酶A1）。為了進一步探索膽道細菌來源，該研究團隊接著對膽總管膽汁、十二指腸液、胃液和唾液標本進行16S測序分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)膽道菌群與十二指腸菌群更為相似，這在一定程度上說明膽道細菌可能來源于腸道細菌的逆行感染[24]，與梁廷波等[25]的研究結(jié)果一致?；谥暗难芯砍晒?，Kose等[26]通過WMS測序還發(fā)現(xiàn)了與膽汁應激反應和生物膜形成相關(guān)的細菌功能基因。

2 膽道細菌的來源

傳統(tǒng)觀點認為，在正常情況下膽道系統(tǒng)是一個無菌的環(huán)境[27]。然而，法醫(yī)學尸檢研究發(fā)現(xiàn)，無膽道疾病的病例其膽道中也有細菌存在[28]。這一發(fā)現(xiàn)引起了人們探索膽道微環(huán)境的興趣：膽道中是否也像腸道一樣存在一個微生態(tài)系統(tǒng)？需要注意的是，膽總管膽汁取樣困難，且為有創(chuàng)操作，由于倫理問題不能取得無膽道疾病人群的膽汁樣本，使得研究進展非常緩慢。為此，Jiménez等[29]對健康豬的膽道系統(tǒng)進行了研究，令人意外的是，其膽道中均發(fā)現(xiàn)有細菌存在。這一發(fā)現(xiàn)與傳統(tǒng)觀點相反，使人們對膽道微環(huán)境又有了一個新的認識。有研究報道，人體微生物組的某個微生態(tài)并不是孤立的，而是相互影響、緊密聯(lián)系的一個整體[30]。因此，有理由認為人體膽道與腸道微生態(tài)之間也有關(guān)聯(lián)。筆者提出這樣一個假設：膽道系統(tǒng)中存在一個特殊的微生態(tài)系統(tǒng)，這個微生態(tài)受到某些因素的干擾而失衡，而這種失衡過程可能與膽道疾病的發(fā)生有關(guān)。盡管已有很多研究表明細菌可能通過腸膽反流、門靜脈系統(tǒng)、膽管周圍淋巴系統(tǒng)或多種途徑并存而進入膽道[23-25，31]，但至今仍無定論，尚需進一步研究。

3 膽總管結(jié)石形成的細菌學機制

3.1 β-葡萄糖醛酸苷酶

如前文所述，自從經(jīng)典的Maki假說[10]描述了細菌在膽紅素鈣結(jié)石發(fā)生機制中的作用之后的很長一段時間內(nèi)，細菌源性的β-G一直被認為是棕色色素結(jié)石形成的重要原因[12，32]。在以犬為模型的動物實驗中，同樣證實了這一結(jié)論[33]。研究者通過結(jié)扎以縮小膽囊管，觀察到膽囊中有棕色色素結(jié)石形成，進一步分析發(fā)現(xiàn)膽囊、膽汁以及肝臟中都有能產(chǎn)生β-G的細菌存在；另外，將大腸埃希菌注入動物模型的脾臟，結(jié)果發(fā)現(xiàn)脾臟中也有結(jié)石形成。

3.2 磷脂酶

有研究報道，棕色色素結(jié)石中所含的棕櫚酸鈣（約占結(jié)石干重的15%）與膽道感染細菌所產(chǎn)生的磷脂酶有關(guān)[34]。感染膽汁中的磷脂酶水解磷脂生成的棕櫚酸與膽汁中的鈣離子結(jié)合形成不溶于水的棕櫚酸鈣沉淀，參與棕色色素結(jié)石的形成[35]。Stewart等[32]的研究發(fā)現(xiàn)感染膽汁中游離脂肪酸濃度和磷脂酶活性均顯著增高。Shen等[23]采用WMS測序技術(shù)在膽總管結(jié)石患者感染的多種細菌中鑒定出了pldA基因，再次從基因水平證明細菌源性磷脂酶參與棕色色素結(jié)石的形成。

3.3 黏液和黏蛋白

Maki[10]在研究中發(fā)現(xiàn)，向膽紅素鈣沉淀中加入海藻酸鈉可使其凝聚而形成結(jié)石。海藻酸鈉的化學性質(zhì)與細菌黏液相似，而黏液的主要成分是黏蛋白，其化學本質(zhì)是高分子量陰離子糖蛋白，相互凝集構(gòu)成的網(wǎng)狀支架可將膽汁中的膽紅素鈣、棕櫚酸鈣沉淀甚至細菌微菌落聚集在一起而形成結(jié)石[32，36-37]。Stewart等[36]研究發(fā)現(xiàn)，62%的棕色色素結(jié)石患者膽道內(nèi)能檢測到細菌源性β-G，但對于細菌黏液而言，這個數(shù)字為100%，這表明細菌產(chǎn)生的黏液可能比β-G在結(jié)石的形成中具有更重要的作用。

3.4 細菌的自我保護機制

膽道環(huán)境中的各種極端因素，如膽汁酸、營養(yǎng)限制、pH及滲透壓的變化等構(gòu)成了細菌生長、繁殖的潛在障礙。然而，有些種類的細菌，例如大腸埃希菌、克雷伯氏菌、腸球菌及產(chǎn)氣莢膜梭菌等為了能在膽道系統(tǒng)中存活，在膽汁酸的作下可迅速形成細胞壁缺陷型變體，即L型細菌[38-39]。由于L型細菌致病力不強，抗原性減弱，可逃避機體免疫系統(tǒng)的攻擊，同時又因其對細菌細胞壁特異性抗生素的敏感性不同于細菌型[39-40]，故可在膽道系統(tǒng)內(nèi)長期留存，成為膽道感染的“潛在菌群”，使膽道持續(xù)處于慢性炎癥狀態(tài)而有利于結(jié)石形成。

除了細菌L型之外，生物膜的形成也是細菌自我保護的一種極其重要的方式，同時在膽道的慢性感染中也有著重要的意義[17]。細菌生物膜的特征在于粘附于介質(zhì)表面并形成保護性細胞外基質(zhì)以及包裹于其中的微生物群落，其中，基質(zhì)約占生物膜干重的90%，通常是由細胞外聚合物，如黏液、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、多糖和核酸等組成的復雜的聚集體[41]。與浮游生活方式不同的是，嵌入生物膜內(nèi)的細菌對宿主的免疫清除、抗生素以及機械應力都具有高度抗性[17，42]。正因為如此，固定于生物膜中的細菌才具有很高的存活率和持久的潛在的感染力，并在小鼠動物實驗中得到了證實[43]。

3.5 腸道菌群

人類腸道內(nèi)生活著數(shù)目龐大、結(jié)構(gòu)復雜的微生物群落，因其與人體健康和疾病有著密切的關(guān)系，故有學者稱其為“被遺忘的器官”[44]。腸道微生態(tài)與宿主一同進化，并參與機體代謝、營養(yǎng)及免疫等諸多生理活動[45-46]。正常情況下，腸黏膜屏障可保護機體免遭腸道細菌侵害，然而，當其功能異?；蚰c道菌群失調(diào)時，可引起腸道細菌易位、內(nèi)毒素血癥、炎性介質(zhì)釋放和激活等病理生理過程，從而引起各種疾病的發(fā)生[47]。于浩等[48]在以豚鼠為動物模型的研究中發(fā)現(xiàn)，破壞其腸黏膜屏障，膽色素結(jié)石的發(fā)病率明顯增高，而與之相比，給予谷氨酰胺改善腸黏膜屏障功能可降低結(jié)石形成率。

既往研究發(fā)現(xiàn)，腸膽反流是導致膽道感染的主要原因之一[25]。膽總管末端的Oddi括約肌是控制膽汁排放和防止腸內(nèi)容物反流的唯一門戶，其功能狀態(tài)與膽總管結(jié)石的形成密切相關(guān)。Oddi括約肌松弛或關(guān)閉不全等功能異常時，腸內(nèi)容物很容易反流進入膽道，致使膽道微環(huán)境污染，甚至是膽道感染，進而促使結(jié)石形成[49]。

3.6 細菌引起膽總管結(jié)石形成的其他機制

膽道慢性炎癥是膽總管結(jié)石形成的潛在危險因素[43]。如前文3.4所述，細菌的多種自我保護機制使得其能夠在膽道系統(tǒng)中長期定植而引起膽道慢性炎癥。慢性細菌感染可持續(xù)激活膽管上皮細胞的免疫應答反應，分泌大量的炎性細胞因子，如IL-6、IL-10、IL-12（p70）和IL-13等[50]，以及免疫球蛋白，如sIgA、IgM和IgG等[51]，這些物質(zhì)可以促使細菌聚集而參與結(jié)石的形成。此外，持續(xù)的局部炎癥也會引起膽管上皮損傷，造成膽管壁水腫、增厚，甚至膽管狹窄，而有利于結(jié)石形成。

據(jù)報道，自由基和內(nèi)毒素與膽總管結(jié)石的形成密切相關(guān)，而細菌感染又是人體內(nèi)自由基和內(nèi)毒素的重要來源[52-53]。細菌毒素可引起膽管壁炎性反應以及肝細胞損傷，致使肝臟功能異常、代謝紊亂、膽汁成分及理化性質(zhì)改變而有利于膽總管結(jié)石的形成。同時，自由基還是膽紅素鈣結(jié)石形成的觸發(fā)因子[54]。

4 小結(jié)

越來越多的證據(jù)表明膽道微生態(tài)在膽總管結(jié)石的形成過程中發(fā)揮著極其重要的作用，但其作用機制至今尚未完全明了。與傳統(tǒng)的微生物研究方法相比，基于下一代高通量測序技術(shù)的宏基因組學從極大的深度和廣度上為人類認識人體微生態(tài)和疾病的關(guān)系開辟了新的途徑。因此，聯(lián)合運用宏基因組測序技術(shù)和傳統(tǒng)微生物鑒別方法，對于膽總管結(jié)石的發(fā)病機制研究、預防和治療都將具有著重要的意義。