● 王春國 宋慧榮 羅亞敏 李伊然 周冉冉 陶曉華

偏痛湯1號是北京中醫(yī)藥大學(xué)陶曉華教授治療偏頭痛的系列方之一，是在幾十年的臨床實踐以及在其協(xié)定處方偏痛湯的實驗和臨床研究[1-2]基礎(chǔ)上加減而成，該方由川芎、蔓荊子、地龍、僵蠶、珍珠母、夏枯草、紅花、雞血藤、細辛、白芍、甘草組成，具有化痰降濁、祛瘀止痛、升清疏散的作用，臨床中對風痰互結(jié)、瘀濁內(nèi)阻，又見清陽失布的偏頭痛具有確切療效?，F(xiàn)代藥理研究表明，偏痛湯1號對偏頭痛模型大鼠具有明確的藥效作用，其機制可能與其調(diào)節(jié)偏頭痛神經(jīng)源炎癥反應(yīng)的神經(jīng)肽CGRP 蛋白表達下調(diào)，抑制CGRP 下游效應(yīng)分子前列腺素E2(Prostaglandin E2，PGE2)、腫瘤壞死因子α(Tumor necrosis factorα，TNF-α)的高表達有關(guān)[3]。方中川芎、蔓荊子為君，善活血行氣、祛風止痛，協(xié)同為用。地龍、僵蠶、珍珠母、夏枯草、紅花、雞血藤共為臣藥，化痰降濁、祛瘀止痛。細辛，入陰經(jīng)，引藥上行；白芍、甘草，取仲景甘酸化陰、緩急止痛之意，共為佐使。其中蔓荊子性清揚升散，引藥上達巔頂，且止痛清熱、利頭目，為治療頭痛之要藥，藥理研究表明其有明顯解熱、鎮(zhèn)痛、降壓作用，其中紫花牡荊素為抗炎的主要活性成分之一[4]。細辛性溫，善祛在里之風邪，除少陰之疼痛，藥理研究表明其揮發(fā)油有顯著的解熱作用，所含成分β-細辛醚能降低血小板的活性，抑制血小板的聚集和黏附[5]。甘草可緩急止痛，治療疼痛病之要藥，藥理研究表明其中的甘草次酸具有抗炎作用[6]。經(jīng)臨床應(yīng)用和拆方研究，發(fā)現(xiàn)這三味藥與偏頭痛的療效存在一定關(guān)系，對其進行復(fù)方中化學(xué)成分的提取和研究分析對今后臨床治療偏頭痛有一定的參考價值。

偏痛湯1號中所含化學(xué)成分復(fù)雜，而對其化學(xué)成分的分析和闡釋能夠為偏痛湯1號的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究、新藥開發(fā)、質(zhì)量控制、體內(nèi)代謝過程等提供數(shù)據(jù)參考，但是目前尚未有對偏痛湯1號化學(xué)成分分析的報道，嚴重阻礙了偏痛湯1號的進一步開發(fā)利用。LTQ-Orbitrap MS是將線性離子阱質(zhì)譜和高分辨質(zhì)譜結(jié)合的雜交型質(zhì)譜儀，同時具有離子阱質(zhì)譜的多級碎裂和Orbitrap的高分辨性能，是復(fù)雜中藥化學(xué)成分定性研究的有力工具。本研究采用UHPLC-LTQ-Orbitrap MS技術(shù)建立偏痛湯1號提取物中化學(xué)成分快速分析和鑒定的方法，鑒定其主要化學(xué)成分，歸屬其可能的質(zhì)譜裂解行為，并對偏痛湯1號中蔓荊子、甘草和細辛三味中藥的特征性成分進行指認和歸屬，以期為偏痛湯1號的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究、質(zhì)量控制和化學(xué)成分的快速鑒定提供參考。

1 試驗材料

LTQ-Oribitrap XL線性離子阱-串聯(lián)靜電場軌道阱質(zhì)譜儀：配有熱噴霧離子源(HESI)、Xcalibur 2.1化學(xué)工作站(美國Thermo Scientific公司)；DionexUtimate 3000 UHPLC Plus Focused超高液相色譜系統(tǒng)：含二元梯度泵，自動進樣器，柱溫箱，DAD檢測器(美國Thermo Scientific公司)；Millipore Synergy UV型超純水機(美國Millipore公司)；Sartorious BT 25S 型萬分之一電子分析天平(北京賽多利斯儀器有限公司)；超聲波清洗器(北京中晟名科技有限公司，100 W)；0.22 μm微孔濾膜(天津市津騰實驗設(shè)備有限公司)；甲酸、甲醇(質(zhì)譜純，F(xiàn)isher 公司)。

偏痛湯1號顆粒、蔓荊子顆粒、蔓荊子陰性顆粒、炙甘草顆粒、炙甘草陰性顆粒、細辛顆粒、細辛陰性顆粒購于北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院藥房；甘草素(成都普菲德生物技術(shù)有限公司，批號：150511)；葒草苷(中國食品藥品檢定研究院，批號：111777-200801)；甘草次酸(寶雞國康生物科技有限公司，批號 111215)。

2 實驗方法

2.1色譜條件色譜柱AQUITY UPLC C18柱 (2.1 mm×100 mm，1.7 μm)；流動相：0.1% 甲酸水溶液(A)，乙腈溶液(B)；梯度洗脫條件：0 ～ 3 min (5 % ～ 5 % B)，3 ～ 45 min (5% ～ 75% B)， 45 ～ 45.1 min (75% ～ 5 % B)，45.1 ～ 50 min (5 % ～ 5 % B)；流速： 0.3 mL/min；進樣量： 2 μL；柱溫：35℃。

2.2質(zhì)譜條件正離子檢出模式：HESI離子源，離子源溫度350℃，電離源電壓4 KV，毛細管電壓：35V，管透鏡電壓110V，鞘氣和輔助氣均為高純氮氣(純度>99.99%)，鞘氣流速40 arb，輔助氣流速20 arb；負離子檢出模式：HESI離子源，離子源溫度350℃，電離源電壓3 KV，毛細管電壓35V，管透鏡電壓110V，鞘氣和輔助氣均為高純氮氣(純度>99.99%)，鞘氣流速30 arb，輔助氣流速10 arb。

正負離子數(shù)據(jù)采集均使用傅里葉變換高分辨全掃方式(TF，F(xiàn)ull scan，Resolution 30000)數(shù)據(jù)依賴性(data-dependent acquisistion)ddMS3，運用CID碎解方式。

2.3供試品溶液的制備(1)偏痛湯1號供試品溶液制備：取偏痛湯1號顆粒劑約2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇20 mL，稱定重量，超聲處理40 min，再稱定重量，用50% 補足減失的重量，搖勻，濾過，過0.45 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液，即得。(2)蔓荊子供試品溶液的制備：取蔓荊子顆粒約2 g，按上述同法制備。(3)蔓荊子陰性供試品溶液的制備：取除去蔓荊子的偏痛湯1號顆粒約2 g，按上述同法制備。(4)炙甘草供試品溶液的制備：取炙甘草顆粒約2 g，按上述同法制備。(5)炙甘草陰性樣品的制備：取除去炙甘草的偏痛湯1號顆粒約2 g，按上述同法制備。(6)細辛供試品溶液的制備：取細辛顆粒約2 g，按上述同法制備。(7)細辛陰性供試品溶液的制備：取除去細辛的偏痛湯1號顆粒約2 g，按上述同法制備。

2.4對照品溶液的制備精確稱取甘草素、葒草苷、甘草次酸適量，用甲醇溶解，配置濃度為1mg/mL的標準品溶液，過0.45 μm微孔濾膜，備用。

3 結(jié)果與討論

按照上述方法分析偏痛湯1號提取物，得到其在正、負離子模式下的總離子流圖(見圖1 A)。根據(jù)LC-MS檢測得到的各化學(xué)成分保留時間、高分辨精確分子量、MSn多級碎片信息，并結(jié)合提取離子流圖與標準品信息、Scifinder數(shù)據(jù)庫及相關(guān)文獻對其進行成分確認，共鑒定了126個成分，其中在正離子模式下所鑒定的數(shù)目為61種，負離子模式下所鑒定的數(shù)目為112種，47種化合物為正、負離子所共同鑒定的化合物(見圖1B)。所鑒定得到的126種化學(xué)成分，包含57種黃酮類成分，14種三萜類萜類成分，14種酚酸類成分，10種單萜類成分，3種二萜類成分，8種香豆素類成分，4種木脂素，4種生物堿類成分和12種其它類成分(見圖1C)。其中，通過對照品比對鑒定的化學(xué)成分有：甘草素、葒草苷、甘草次酸。

圖1 LTQ-Orbitrap MS對偏痛湯1號主要化學(xué)成分的鑒定結(jié)果

注：A 偏痛湯1號在正離子和負離子模式下的總離子流圖；B 正離子模式和負離子模式下鑒定偏痛湯1號化學(xué)成分的數(shù)目；C LTQ-Orbitrap MS鑒定偏痛湯1號中主要成分的類型

3.1標準品的質(zhì)譜裂解行為黃酮類化合物：標準品甘草素在HESI負離子模式下，顯示準分子離子峰為m/z255.06589 [M+H]-，元素組成為C15H12O5(質(zhì)量誤差-0.92ppm)。在MS/MS中產(chǎn)生m/z211.08、149.02、135.01、119.05等碎片離子(見圖2 A)，其中碎片離子m/z135.01、119.05，是黃酮類化合物RDA1，3A-裂解產(chǎn)生的互補離子；選擇豐度最高的m/z135.01進一步進行CID裂解，在MS3中產(chǎn)生的碎片離子主要為m/z90.87，為碎片m/z135.01母核丟失一分子CO2所形成，其具體的質(zhì)譜裂解行為見圖2 B。標準品葒草苷在HESI負離子模式下，其準分子離子峰為m/z447.09302 [M+H]-，元素組成為C21H20O11(質(zhì)量誤差-0.5815 ppm)，LTQ-Orbitrap多級質(zhì)譜分析，MS2中呈現(xiàn)m/z327.05081，357.06116、429.08286等碎片離子(見圖2C)。其中m/z429為準分子離子丟失一分子H2O所形成，m/z327.05081和357.06116是有黃酮碳苷鍵中葡萄糖不同的跨環(huán)裂解所形成的碎片離子，選擇豐度最高的m/z327.05081進一步進行CID裂解，在MS3中產(chǎn)生的碎片離子主要為m/z299、255等，為黃酮母核中性丟失CO和CO2所形成，其具體的質(zhì)譜裂解行為見圖2 D。

三萜類化合物：標準品甘草次酸在HESI負離子模式下，顯示準分子離子峰為m/z469.33133 [M+H]-，元素組成為C30H46O4(質(zhì)量誤差-2.13ppm)。在MS/MS中產(chǎn)生m/z451、425.34、409.31，355.26等碎片離子(見圖2E)，其中碎片離子m/z451是準分子離子丟失一分子H2O所形成，碎片離子m/z425是甘草次酸C30位羧酸斷裂丟失一分子CO2所形成，進一步丟失甲基(CH4)形成m/z409.31的碎片。選擇豐度最高的m/z425.34進一步進行CID裂解，在MS3中產(chǎn)生的碎片離子主要為m/z355，為甘草次酸E環(huán)跨環(huán)碎裂丟C5H10所形成，其具體的質(zhì)譜裂解行為見圖2 F。

圖2 標準品的MSn圖和質(zhì)譜裂解行為

注：A甘草素的MS2-3質(zhì)譜圖；B甘草素的質(zhì)譜裂解行為圖；C 葒草苷的MS2-3質(zhì)譜圖；D 葒草苷的質(zhì)譜裂解行為圖；E甘草次酸的MS2-3質(zhì)譜圖；F甘草次酸的質(zhì)譜裂解行為圖

3.2黃酮類化合物鑒定峰2和3的保留時間為13.05和18.54 min，其準分子離子峰均為m/z417.11859 [M+H]-，推測其元素組成為C21H22O9(質(zhì)量誤差-1.23 ppm)。在MS/MS中產(chǎn)生m/z255、135、119等二氫黃酮類化合物的典型碎片離子(見圖3)，峰2和3的準分子離子峰與標準品甘草素相差162Da，推測為甘草素的單葡萄糖苷，通過文獻比對，鑒定該化合物為甘草苷(Liquiritin)和新甘草苷( Neoliquiritin)[7]。峰4、5、7、8、9和10保留時間分別為18.22、13.84、21.76、19.84、19.73和10.84 min，其準分子離子峰分別為m/z549.16077、579.17092、692.19847、725.20764、695.19678、711.21307[M+H]-，推測元素組成分別為C26H30O13(質(zhì)量誤差-1.07 ppm)、C27H32O14(質(zhì)量誤差-1.72ppm)、C35H35NO14(質(zhì)量誤差-0.01 ppm)、C36H38O16(質(zhì)量誤差-1.47 ppm)、C35H36O15(質(zhì)量誤差-1.96ppm)、C32H40O18(質(zhì)量誤差-1.57 ppm)。這些峰在MS/MS中均出現(xiàn)m/z255二氫黃酮苷元的碎片離子峰，由此推測這些峰為甘草素(m/z255.06589 [M+H]-)連接不同糖苷鍵或相關(guān)官能團的同系組分，峰4與甘草苷相差132 Da，與甘草素相差294 Da(一分子葡萄糖和一分子呋喃糖)，結(jié)合文獻鑒定為Liquiritigenin 7-apiofuranoside-4'-glucoside[8]；峰5與甘草苷相差162 Da，與甘草素相差324 Da(兩分子葡萄糖)，結(jié)合文獻鑒定為Liquiritigenin 7，4'-diglucoside[9]；峰7與Liquiritigenin 7-apiofuranoside-4'-glucoside相差143 Da，且峰7準分子離子峰為偶數(shù)，根據(jù)氮規(guī)則，推測其含有一個N元素，并結(jié)合文獻鑒定其為Licorice glycoside E[10]；峰8與Liquiritigenin 7-apiofuranoside-4'-glucoside相差146 Da，推測碎片為苯乙烯酸結(jié)構(gòu)，結(jié)合文獻鑒定為Licorice glycoside D1[10]；峰9與Liquiritigenin 7-apiofuranoside-4'-glucoside相差176 Da(苯乙烯酸衍生物)，結(jié)合文獻鑒定為Licorice glycoside C1[10]；峰10與Liquiritigenin 7-apiofuranoside-4'-glucoside相差162 Da(一分子葡萄糖)，結(jié)合文獻鑒定為Liquiritigenin 7-glucoside-4'-apiosyl-(1->2)-glucoside[11]。

在HESI負離子模式下，峰16、17、18、19、20和21保留時間分別為15.2、11.50、11.84、12.80、12.90和14.62 min，其準分子離子峰分別為m/z473.10893、593.15002、579.13464、579.13464、563.13977、 577.15521 [M+H]-，推測元素組成分別為C23H22O11(質(zhì)量誤差-0.01 ppm)、C27H30O15(質(zhì)量誤差-1.97 ppm)、C26H28O15(質(zhì)量誤差-1.56 ppm)、C26H28O15(質(zhì)量誤差-1.56 ppm)、C26H28O14(質(zhì)量誤差-1.52ppm)、C27H30O14(質(zhì)量誤差-1.85 ppm)。這些峰在MS/MS中均出現(xiàn)一個或多個[M-120]-和[M-90]-的碎片離子峰，推測這些峰為黃酮碳苷類化合物。結(jié)合文獻鑒定這些峰分別為：Vitexin 2''-acetate，Vicenin 2，Lucenin 1，Lucenin 3，Vicenin 1，Violanthin[12-14]。綜上，基于標準品的裂解規(guī)律、高分辨質(zhì)譜提供的精確分子量、MSn多級碎片信息等，在正離子和負離子模式下共有56種黃酮類化合物在偏痛湯1號中得以被鑒定和表征。

圖3 黃酮類主要成分的MS/MS圖

3.3三萜萜類化合物鑒定在HESI負離子模式下，峰59、60、61、62、63、64、65、66、67、68和69保留時間分別為35.15、 30.68、32.70、26.89、28.84、30.51、25.78、27.72、32.06 、31.58和35.48 min，其準分子離子峰分別為m/z805.40039、821.39514、821.39569、837.39044、837.39032、837.39014、983.44781、819.38085、807.41583、807.41595和807.41614 [M+H]-，推測元素組成分別為C42H62O15(質(zhì)量誤差-1.49 ppm)、C42H62O16(質(zhì)量誤差-1.66 ppm)、C42H62O16(質(zhì)量誤差-0.99 ppm)、C42H62O17(質(zhì)量誤差-1.17 ppm)、C42H62O17(質(zhì)量誤差-1.31 ppm)、C42H64O15(質(zhì)量誤差-1.53 ppm)、C42H62O17(質(zhì)量誤差-1.54 ppm)、C48H72O21(質(zhì)量誤差-1.54 ppm)、C42H60O16(質(zhì)量誤差-0.01 ppm)、C42H64O15(質(zhì)量誤差-1.75 ppm)和C42H64O15(質(zhì)量誤差-1.36 ppm)。這些峰在MS/MS中均出現(xiàn)一個或多個[M-176]-和[M-162]-的碎片離子峰，推測這些峰為含有1個多個葡萄糖醛酸和葡萄糖苷鍵的化合物，且MS/MS中出現(xiàn)m/z469、453、485等甘草次酸類五環(huán)三萜母核的碎片離子，如峰60、65在MS/MS均出現(xiàn)m/z469(甘草次酸)的診斷離子(見圖4)，而碎片離子m/z645(峰60)為準分子離子丟失一分子葡萄糖醛酸所形成，碎片離子m/z821、645、469(峰65)為準分子連續(xù)離子丟失一分子葡萄糖和2分子葡萄糖醛酸所形成，結(jié)合文獻分別鑒定峰60、65為甘草酸(Glycyrrhizic acid)和Licoricesaponin A3[15-16]。同理，基于標準品的裂解規(guī)律、高分辨質(zhì)譜提供的精確分子量、MSn多級碎片信息等，在正離子和負離子模式下共有14種三萜皂苷類化合物在偏痛湯1號中得以被鑒定。

圖4 三萜皂苷類主要成分的MS/MS圖

3.4酚酸類化合物鑒定在HESI負離子模式下，峰72、73、74、75、76、77、78、79、80和81保留時間分別為24.98、7.86、3.33、5.40、10.51、7.29、6.29、3.11、8.50和23.08 min，其準分子離子峰分別為m/z119.05051、151.04002、153.01935、137.02455、165.0921、179.03498、165.05565、167.03482、167.03485和193.05043 [M+H]-，推測元素組成分別為C8H8O(質(zhì)量誤差2.28 ppm)、C8H8O3(質(zhì)量誤差-0.31 ppm)、C7H6O4(質(zhì)量誤差0.11 ppm)、C7H6O3(質(zhì)量誤差0.96 ppm)、C10H14O2(質(zhì)量誤差-0.19 ppm)、C9H8O4(質(zhì)量誤差-0.11ppm)、C9H10O3(質(zhì)量誤差-0.41 ppm)、C8H8O4(質(zhì)量誤差-0.96 ppm)、C8H8O4(質(zhì)量誤差-0.79 ppm)和C10H10O4(質(zhì)量誤差-1.04 ppm)。對這些峰的MSn多級碎片信息進行歸屬，在正離子和負離子模式下共有14種酚酸類化合物在偏痛湯1號中得以被鑒定。

3.5其它類化合物鑒定在HESI正離子和負離子模式下，共有10種單萜類化合物和3種二萜類化合物在偏痛湯1號中得以被鑒定和表征，如峰89的保留時間為17.56 min，其準分子離子峰均為m/z479.155612[M+H]-，推測其元素組成為C23H28O11(質(zhì)量誤差-0.56 ppm)。在MS/MS中產(chǎn)生m/z435、357.11844、327.10791、283.08182等碎片離子(見圖5)，其中m/z435是芍藥內(nèi)酯苷結(jié)構(gòu)中內(nèi)酯環(huán)中酰氧基兩側(cè)斷裂，丟失一分子CO2產(chǎn)生的碎片離子，m/z357.11是準分子離子丟失一分子苯甲酸所產(chǎn)生的碎片離子，而m/z327碎片離子則是丟失準分子離子丟失一分子葡萄糖形成的，通過文獻比對，鑒定峰89為芍藥苷[17]。

另外，在HESI正離子和負離子模式下，共有8種香豆素類化合物、4種木脂素類化合物、4種生物堿類化合物和12種其它類化合物在偏痛湯1號中得以被鑒定。

圖5 峰89(芍藥苷)的MS/MS圖

3.6蔓荊子、炙甘草和細辛中特征成分的指認和歸屬

按照上述方法分析蔓荊子單味藥提取物、偏痛湯1號提取物以及偏痛湯1號除去蔓荊子提取物，得到其在正、負離子模式下的總離子流圖(見圖6A)?；谏鲜鲅芯揩@得的126種化學(xué)成分，對蔓荊子中特征成分進行指認和歸屬，共鑒定到17種化學(xué)成分為蔓荊子特有成分。同理，對炙甘草中特征成分進行指認和歸屬，共鑒定到60種化學(xué)成分為炙甘草所特有(見圖6B)；對細辛中特征成分進行指認和歸屬，共鑒定到5種化學(xué)成分為細辛所特有(見圖6 C)。

圖6 偏痛湯1號、主要單味藥及其陰性樣品的總離子流圖

4 結(jié)論

本研究采用UHPLC-LTQ OrbitrapMS方法對偏痛湯1號提取物中主要化學(xué)成分進行了系統(tǒng)研究，并對偏痛湯1號中蔓荊子、甘草和細辛三味中藥的特征性成分進行了指認和歸屬。該方法能夠?qū)崿F(xiàn)偏痛湯1號中126種化學(xué)成分的快速鑒別，可為偏痛湯1號的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究、質(zhì)量控制和化學(xué)成分的快速鑒定提供數(shù)據(jù)參考，亦可為復(fù)雜中藥成分的快速定性分析提供借鑒。