● 李 靜 陳 力 王 丹 陳 燕

舌癌(carcinoma of the tongue)是口腔頜面部中最常見的惡性腫瘤之一[1]，多項研究證實近些年來舌癌的發(fā)病率在全球范圍內(nèi)呈現(xiàn)不斷上升的趨勢[2]。研究顯示，天然中草藥中的有效成分或有效部位，比如具有藥理功能的化合物或者生物堿，已成為目前抗癌研究的熱點。大黃素是一種蒽醌類物質(zhì)，大黃素具有抑制口腔鱗癌細(xì)胞株的增殖、并影響其細(xì)胞周期的作用[3]；蘆薈具有較高的食用和藥用價值，其中蘆薈多糖(Aloe polysaccharide，AP)是蘆薈凝膠中的主要生物活性物質(zhì)，具有免疫調(diào)節(jié)、抗菌、抗病毒、抗腫瘤、抗氧化等多種功效[4]。因此，本文擬通過對蘆薈多糖與大黃素不同配伍比例，考察中藥提取物對SCC15活性的影響；同時，血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)能促進血管的形成，在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用[5]，是腫瘤細(xì)胞發(fā)展過程中重要的生化指標(biāo)。基于此，本文擬通過研究蘆薈多糖與大黃素不同配比體外干預(yù)SCC15的活性，研究對VEGF蛋白表達的影響，初步探討其作用機制，為臨床合理用藥提供參考。

1 材料與方法

1.1試劑無外泌體胎牛血清(上海宇玫博生物科技有限公司：UR50201)；DMEM高糖培養(yǎng)基(美國Gibco公司，批號：904862)；SCC15口腔癌細(xì)胞(購自上海拜力生物有限公司)；免疫印跡抗體：山羊抗小鼠IgG標(biāo)記二抗(Biosharp公司，批號：zs-256)；β-acting(博奧森，批號：160517)；VEGF分裝單克隆抗體(北京中杉，批號：20160717)；四甲基偶氮唑鹽(MTT)(Sigma公司：0931)；二甲基亞砜(DMSO)(Sigma公司，批號：0331)；磷酸鹽緩沖液(PBS)(武漢博士德)；ECL發(fā)光液(碧云天，批號：20160720)；胰酶(Biosharp公司，批號：20170530)；蘆薈多糖(江蘇瑞多生物，批號：20161124，含量70%)；大黃素(CAS：518-82-1，貨號：SF0024，陜西森弗)。

1.2主要儀器倒置顯微鏡(上海巨納科技)；超凈工作臺(蘇州安泰)；CO2培養(yǎng)箱(日本三洋)；S3006L型高壓勻質(zhì)機(Niro Soavi公司)；酶標(biāo)定量測定儀(Thermo Multiskan AsCant公司)；冷凍干燥機(abeonco)；垂直電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀(北京六一)。

1.3細(xì)胞培養(yǎng)(1)細(xì)胞復(fù)蘇：SCC15人舌鱗狀癌細(xì)胞購自上海拜力生物有限公司，將細(xì)胞從液氮灌中取出，迅速投入37℃超純水中解凍，轉(zhuǎn)移至離心管中，加4mL DMEM高糖培養(yǎng)基，離心1500 r/min×2min，棄去上清，加入5mL完全培養(yǎng)基(10%胎牛血清)，用巴士吸管輕輕吹打，將細(xì)胞吹散均呈懸浮狀態(tài)，再將細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)。(2)細(xì)胞培養(yǎng)及傳代：待細(xì)胞長至瓶底80%以上時，加入1mL 0.25%的胰酶消化(約1min)，然后4mL加入含10%血清的培養(yǎng)基終止消化，離心1500 r/min×2min，收集細(xì)胞，再加入適量完全培養(yǎng)基(10%胎牛血清)輕輕吹打至懸浮，分別傳代至2～3個培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO2孵箱中繼續(xù)孵育；傳3代待細(xì)胞生長穩(wěn)定后便可用于下一步實驗。

1.4細(xì)胞鑒定取進入對數(shù)生長期的細(xì)胞進行消化，離心后接種于無菌的蓋玻片上，置于二氧化碳培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞生長鋪滿至玻片的50%～80%時，棄去培養(yǎng)液，PBS清洗1遍后，分別加入丙酮、甲醇各1mL，室溫固定30min，棄上清，以PBS清洗3次，再加入3%H2O2去離子水室溫孵育10min，棄上清，以PBS清洗3次，加入封閉用山羊血清在室溫下繼續(xù)孵育30min，再滴加c-kit一抗(1∶200)適量，將封閉后的玻片置于冰箱冷藏過夜，取出后再滴加山羊抗小鼠IgG標(biāo)記二抗(1∶100)，置二氧化碳培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育30 min后，在避光條件下置于電子顯微鏡下觀察[6]。

1.5 MTT法測細(xì)胞增殖[7]取進入對數(shù)生長期的細(xì)胞，消化后稀釋并將細(xì)胞密度調(diào)整為2×104個/mL，接種于24孔板中，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，將細(xì)胞分為空白組、陽性組、蘆薈多糖高、中、低劑量組，每組6個復(fù)孔。根據(jù)《藥典》中成人最大劑量/人血漿容積(4000mL)換算蘆薈多糖的最大劑量為0.225μg/mL、大黃素的最大劑量為0.056μg/mL。空白組：SCC15給予不含藥DMEM完全培養(yǎng)液，培養(yǎng)48 h；給藥組：給藥劑量及比例見表1。

表1 不同配伍比例給藥劑量

各給藥組的SCC15口腔癌細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，分別根據(jù)給予含蘆薈多糖與大黃素不同配伍比例的DMEM完全培養(yǎng)液，以上各組藥物干預(yù)后培養(yǎng)24h后，每孔加入20μL 5mg/mL的 MTT溶液，在CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)放置4h后，棄上清，每孔加入150μL的二甲基亞砜(DMSO)，于搖床上振蕩10 min，酶標(biāo)儀中設(shè)定490 nm波長處讀取各組的OD值，計算均值、比較各組細(xì)胞的增殖情況。

1.6 Western-blot檢測VEGF蛋白的表達[8]藥物干預(yù)后收集各組細(xì)胞，分別加入100 uL裂解液(Tris pH=7.5，1 mM EDTA中，50 mM NaCl，0.5%Triton-X-100)，振搖，并將溫度保持為4℃，持續(xù)30min，裂解后再將各組細(xì)胞以5000 r/min×10 min離心，收集上清液，轉(zhuǎn)入預(yù)冷的離心管中，根據(jù)考馬斯亮蘭試劑盒檢測各組細(xì)胞裂解后的蛋白濃度；樣品中加入上樣緩沖液稀釋，并煮沸5min使蛋白變性，備用。SDS-PAGE凝膠上樣量50 μL，在150 V的穩(wěn)壓電場中電泳約90min，電泳后轉(zhuǎn)移蛋白至硝酸纖維素濾膜(電流為380 mA)，最終加入脫脂奶粉封閉，室溫下過夜，剪膜，根據(jù)分子量分開后分別以加1∶500稀釋的一抗(VEGF)及內(nèi)參抗體(β-acting，1∶2000)室溫孵育2 h，HRP標(biāo)記二抗(1∶1000)孵育1 h后，洗膜，ECL發(fā)光液發(fā)光后X光片曝光，掃描記錄結(jié)果，Gel-analyze 分析軟件分析條帶灰度，進行半定量比較分析，以IOD值表示蛋白的表達水平。

2 結(jié)果

2.1 c-kit免疫熒光鑒定和細(xì)胞形態(tài)細(xì)胞貼壁后，逐漸伸展，細(xì)胞密度低時排列疏松，形態(tài)特征明顯，呈長條形或不規(guī)則形態(tài)，生長進入對數(shù)后，細(xì)胞增殖加快，體積變大且排列緊密，呈放射狀(圖1)；免疫染色后，胞體和突起明顯著色，與鄰近細(xì)胞相互連接成網(wǎng)狀(圖2)。圖片均在100倍鏡下觀察并拍照。

圖1 (空白組×100)

圖2 (c-kit免疫染色×100)

2.2 MTT檢測細(xì)胞增殖情況與空白組比較，蘆薈多糖單劑量組、大黃素單劑量組、各配伍組的細(xì)胞活性均顯著降低(P<0.05)，且隨大黃素比例的增加抑制作用而增強，其中以蘆薈多糖與大黃素配伍1∶2組、2∶3、1∶3組最為顯著(P<0.01)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。實驗結(jié)果見表2。

表2 各組對SCC15口腔癌細(xì)胞增殖的影響

注： 與空白組比較：*P<0.05，**P<0.01

2.3 VEGF蛋白表達的變化結(jié)果顯示，空白組VEGF蛋白的表達較高，各給藥組VEGF蛋白表達降低，其中蘆薈多糖配大黃素1∶2、2∶3、1∶3組VEGF蛋白的表達顯著減弱，且當(dāng)比例為1∶3時，VEGF蛋白的表達最低。說明：在本次實驗中，VEGF在SCC15口腔癌細(xì)胞中具有較高表達，大黃素與蘆薈多糖配伍對VEGF蛋白的表達有顯著抑制作用，且以1∶3的比例效果最顯著。結(jié)果如表3、圖3所示。

表3 VEGF/內(nèi)參(IOD比值)的情況

注： 與空白組比較：*P<0.05，**P<0.01

圖3 各組VEGF蛋白的表達

(A代表空白組；B表示蘆薈多糖單劑量組；C表示大黃素單劑量組；D表示蘆薈多糖配伍大黃素1∶2組；E表示配伍2∶3組；F表示配伍1∶3組)

3 討論

舌癌多數(shù)為鱗癌，惡性程度高，生長快，浸潤性強，此外舌體還具有豐富的淋巴及血運循環(huán)，加之其頻繁的機械運動，使得舌癌極易在發(fā)病的早期出現(xiàn)頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，預(yù)后較差[9]。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為舌癌歸屬于中醫(yī)“舌疳”與“舌菌”范疇，發(fā)病病因主要是外感六淫，內(nèi)傷七情，入里化火，火性炎上，舌上便生潰瘍，加之吸煙，火毒熏烤，或陰虛火自內(nèi)生，迫使火毒淤結(jié)，從而致生舌癌[10]。目前舌癌治療中醫(yī)治療方法初期主要清熱解毒，清瀉心火，行氣化癖，除濕化濁，后期主扶正祛邪，攻補兼施，治宜補益心脾，清熱解毒之法[11]。而西醫(yī)方法主導(dǎo)的是以手術(shù)為主的綜合序列治療，雖然近些年來舌癌的手術(shù)切除率已明顯提高，手術(shù)患者的病死率明顯下降，但其局部、區(qū)域性復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移率仍然較高[12]，因此，尋找出毒副作用低且對腫瘤增殖及侵襲轉(zhuǎn)移有抑制作用的藥物具有重要的現(xiàn)實意義。蘆薈多糖(Aloe polysaccharide，AP)是蘆薈凝膠部分除去水分以外的主要成分，AP作為藥用品種蘆薈的主要活性物質(zhì)之一，其抗腫瘤作用備受關(guān)注[13]。有研究顯示，蘆薈多糖對S180、H22荷瘤小鼠具有明顯的抗腫瘤作用，延長小鼠生存期[14]。大黃素是一種蒽醌類物質(zhì)，最新研究顯示，大黃素能夠抑制小鼠肝癌、乳腺癌、艾氏腹水癌、淋巴肉瘤、黑色素瘤以及大鼠瓦克瘤，抑制率大于30%[15]。此外大黃素具有抑制口腔鱗癌細(xì)胞株的增殖并影響其細(xì)胞周期的作用。因此，本文擬通過體外培養(yǎng)SCC15細(xì)胞，觀察蘆薈多糖與大黃素不同配伍比例對其是否具有抑制作用及部分作用機制。

VEGF通過血管內(nèi)皮細(xì)胞表面VEGFR2受體激活下游信號，可誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞的生長、遷移和管狀形成，促進新生血管形成、提高血管通透性，滿足腫瘤細(xì)胞對氧和營養(yǎng)的需求，因此，阻斷VEGF-VEGFR2信號通路抑制血管異常增生是腫瘤靶向治療的重要策略[12]。本研究中，通過MTT法檢測細(xì)胞活性，發(fā)現(xiàn)蘆薈多糖、大黃素單劑量組及其不同比例的配伍組對體外培養(yǎng)的SCC15細(xì)胞具有顯著的抑制作用，且細(xì)胞活性隨隨大黃素比例的增加而逐漸降低。根據(jù)細(xì)胞活性中的結(jié)果，將空白組、蘆薈多糖與大黃素單劑量組、蘆薈多糖配大黃素1∶2、2∶3組通過免疫印跡法檢測VEGF蛋白的表達的檢測，結(jié)果顯示：腫瘤細(xì)胞SCC15中對VEGF具有高表達，給予藥物干預(yù)后，各單劑量組及配伍組均能抑制VEGF的表達，其中以蘆薈多糖配大黃素1∶3組尤為顯著，說明蘆薈多糖與大黃素配伍可能通過下調(diào)VEGF蛋白的高表達從而抑制SCC15細(xì)胞的增殖能力，在體外蘆薈多糖與大黃素以1∶3的比例干預(yù)，具有較好的抗腫瘤作用。

綜上所述，蘆薈多糖與大黃素配伍能降低SCC15細(xì)胞VEGF蛋白的高表達，從而達到抗瘤作用，但本研究僅研究了部分機制且為體外研究，下一步可選擇觀察含藥血清對SCC15細(xì)胞的抑制作用或口服湯劑對在體荷瘤小鼠的治療作用，其作用通路及相關(guān)基因蛋白還有待進一步研究。