仝亞軍，高玉錄，劉孟龍，翟衡，孫慶華

(山東農業(yè)大學園藝科學與工程學院，山東泰安 271018)

褪黑素(melatonin，MT)是一種廣泛存在于動植物體內的吲哚類小分子物質。研究證明褪黑素在提高植物抗氧化能力、增強抗逆性方面有重要作用，外源褪黑素能緩解鹽脅迫對光合速率的抑制作用，抑制葉綠素的降解，在緩解高溫、臭氧逆境脅迫方面也有明顯效果[1-3]。外源褪黑素可減輕胡蘿卜(Daucus carota)因低溫誘導的細胞凋亡[4]；褪黑素預處理的黃瓜種子在低溫條件下發(fā)芽率明顯提高[5]；褪黑素能提高低溫保存的紅景天(Cryssulaceae Rhodiola crenulata)愈傷組織的存活率。褪黑素在植株葉片或根局部施用不僅在施用部位誘導對低溫脅迫的耐受性，而且還可提高全株的耐寒性[6]。

中國北方屬于大陸性季風氣候，春季升溫快，但氣溫變化波動大，發(fā)芽早的果樹容易受到低溫傷害。春季霜凍造成葡萄嫩梢、葉片、花器官發(fā)生凍害是是導致葡萄產量降低、品質下降甚至樹體死亡的重要因素之一，所以研發(fā)葡萄防霜技術具有重要的生產實踐意義。葉面噴施碧護、天達已被生產證實是預防和救護果樹霜凍害的有效方法[7-9]，本研究以褪黑素、天達、碧護為處理，探討外源褪黑素預防霜凍的作用。

1 材料與方法

1.1 試材

試驗于2018年4月在山東農業(yè)大學園藝學院葡萄試驗基地進行。以5年生籬架栽培的砧木SN15為試材。南北行向，株行距1.2m×2.5m，單干單臂垂直葉幕。

試劑：褪黑素購自Sigma公司；天達2116購自山東天達生物股份有限公司(凈含量20mL)；碧護購自德國阿格福萊農林環(huán)境生物科技有限公司。

1.2 試驗設置

設置4個處理，分別為①CK，自然霜凍條件下不作處理。②褪黑素100nmol/L。③碧護5000倍液。④天達600倍液。每個處理選長勢一致的3株為1個重復，每處理重復3次，共9株。根據天氣預報降溫信息，各處理于4月5日即低溫來臨前1天噴施，于6日上午10時采樣。統一選取新梢上部第1個葉片用液氮速凍后放-80℃冰箱保存。

1.3 測定指標與方法

電導率、丙二醛(MDA)含量的測定，電導率采用FE30型電導率儀測定[10]。硫代巴比妥酸法 (TBA) 進行MDA含量測定[11]。

脯氨酸含量測定，采用磺基水楊酸法。

抗氧化酶活性測定。酶液提取，稱取0.5g植物材料放入研缽中，加5ml pH=7.8的磷酸緩沖液，冰浴研磨，勻漿倒入離心管中，10000轉/分鐘冷凍離心20分鐘，取上清液倒入試管中，置于0～4℃下保存待用(短期)。超氧化物歧化酶(SOD)活性測定，采用氮藍四唑光化還原法；過氧化物酶(POD)活性測定采用愈創(chuàng)木酚法。

2 結果與分析

2.1 霜凍來臨前后溫度變化

圖1為4月2日中午12時至3日12時、5日中午12時至6日中午12時溫度變化情況，4月2日中午溫度最高達到30℃，并且白天溫度維持在25℃以上，3日凌晨最低溫16.6℃。5日17時至6日8時持續(xù)3小時低于0℃，最低溫度達到-1℃。

圖1 低溫前后溫度變化

2.2 不同處理的葡萄葉片受凍情況

低溫發(fā)生時新梢長3～6cm，梢葉幼嫩，含水量較高，易受低溫凍害。此次降溫溫度回升后觀察發(fā)現，部分幼嫩葉片呈暗黑色，其中對照的梢尖葉片受害率達30.0%；噴施碧護的基本無外觀癥狀，噴施褪黑素的葉片受害率5.0%左右，噴施天達的葉片受害率15.0%左右。

2.3 不同處理對葡萄葉片相對電導率和丙二醛MDA含量的影響

在溫度逆境脅迫下活性物質會大量積累，細胞膜的結構遭到破壞導致葉片的相對電導率升高。如圖2所示，對照葉片的相對電導率14.85%，噴碧護的比對照低26.0%，噴褪黑素的低20.9%，噴天達的低18.6%，均與對照差異顯著，但三者之間沒有顯著差異。噴施3種化學制劑有利于減輕細胞膜結構的破壞程度。

圖2 霜凍對葡萄葉片相對電導率的影響

MDA是膜脂過氧化的最終產物之一，其含量的多少可以反映細胞膜脂過氧化程度的高低。葡萄遭受低溫后MDA含量升高(圖3)，以對照葉片中的MDA含量最高，達到0.023μmol/g FW，噴碧護和天達的分別比其低84.4%、45.7%，噴褪黑素MT的低20.9%。

圖3霜凍對葡萄葉片丙二醛(MDA)含量的影響

2.4 不同處理對葡萄葉片脯氨酸含量的影響

葡萄植株遭受低溫脅迫后葉片的脯氨酸含量升高，如圖4所示，對照脯氨酸含量最高，為2.41μg/g FW；噴施天達的與對照無顯著性差異，噴褪黑素的為對照的92.5%，噴碧護的為對照的91.0%，且與其他兩個處理差異顯著，說明輕微霜凍條件下噴碧護對葉片的脯氨酸含量有明顯穩(wěn)定作用。

圖4 低溫對葡萄葉片脯氨酸含量的影響

2.5 不同處理對葡萄葉片SOD、POD活性的影響

植物體內有完善的清除活性氧的防衛(wèi)體系，能保證體內活性氧處于動態(tài)平衡的狀態(tài)。植株遭受逆境脅迫時體內活性氧會積累。POD和SOD是植物抗氧化酶體系中重要的防御酶，可以有效清除積累的活性氧，減輕細胞遭受的損傷。如圖5，圖6可見，對照的SOD、POD活性分別為199.93U/min·g FW、3.17U/min·g FW，3個處理葉片的SOD、POD活性上升幅度均小于對照，其中SOD活性噴碧護為對照的65.8%，噴褪黑素為對照的69.3%，噴天達為對照的76.8%。3個處理對POD活性的影響有明顯差異，其中噴天達的是對照的81.2%，噴碧護的是對照的54.6%，而噴褪黑素的POD活性增加幅度最小，僅為對照的41.9%。說明POD活性對褪黑素更加敏感。

圖5 葡萄遭受霜凍過后葉片SOD含量的變化

圖6 葡萄遭受霜凍過后葉片POD含量的變化

3 討論與結論

逆境溫度會使細胞內活性氧積累，從而導致細胞膜脂過氧化，最終對植物造成傷害甚至死亡[12-16]。本試驗結果表明，在輕度低溫脅迫后葡萄幼葉的MDA含量明顯上升，相對電導率升高，噴布褪黑素、碧護、天達處理的MDA含量和相對電導率均顯著低于對照，說明經處理過后，減輕了葡萄葉片細胞膜脂質過氧化，保護了膜的完整性，減小電解質的外滲，以碧護處理效果最明顯。

SOD是清除活性氧的主要酶類[17,18]，也是植物細胞防御系統中一個極為重要的保護酶類。POD可以使組織中所含有某種碳水化合物轉化成木質素，增加抵抗寒冷的能力[19]。受到低溫傷害后未進行任何處理的葡萄幼葉SOD和POD活性顯著高于3個處理，3種防霜物質都明顯抑制這些指標的上升。

有研究發(fā)現植物遭受逆境脅迫時其體內的脯氨酸含量增加，有助于細胞或者組織保持一定的水分，從而使植物細胞的滲透勢下降，以提高抗低溫脅迫的能力[20]。發(fā)生低溫脅迫后對照的脯氨酸增加幅度明顯高于3個處理，褪黑素與碧護的反應水平類似。

綜上所述，在-1℃低溫脅迫造成了葡萄幼葉的表觀傷害和膜脂過氧化，也調動了各種抗氧化抗寒物質的響應[21]，導致脯氨酸含量、SOD、POD活性上升，而3種防霜物質都明顯抑制了這些指標的上升，說明在輕度低溫脅迫下噴布這3種物質使葡萄葉片受凍程度減輕，噴布外源褪黑素與生產上推薦使用的天達及碧護有類似效果，因此褪黑素作為一種強抗氧化劑對生態(tài)逆境的緩解作用值得進一步研究探索。