趙云虎，覃曉琳，楊結(jié)儀，陳文韜，廖儀文 綜述,鄭和平△ 審校

(1.安徽醫(yī)科大學(xué)，安徽合肥 230000；2.廣東省皮膚病醫(yī)院檢驗科，廣東廣州 510000)

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，許多疾病的診斷和治療都依賴一定的檢測技術(shù)，無論是分子水平的核酸和蛋白質(zhì)，還是細(xì)胞水平的分析都需要高靈敏度高特異度的技術(shù)來提高檢測的準(zhǔn)確性。目前，臨床常用的檢測手段主要包括核酸擴(kuò)增，免疫熒光，化學(xué)發(fā)光，比色法，免疫層析，酶免疫，直接鏡檢等，其中核酸擴(kuò)增被認(rèn)為是高靈敏高特異的檢測技術(shù)之一[1]?，F(xiàn)在的核酸擴(kuò)增技術(shù)已經(jīng)非常完善，主要分為兩大類：熱循環(huán)擴(kuò)增和等溫擴(kuò)增。熱循環(huán)擴(kuò)增包括聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)，連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(LCR)等；等溫擴(kuò)增包括滾環(huán)擴(kuò)增(RCA)，鏈置換擴(kuò)增(SDA)，雜交鏈反應(yīng)(HCR)等[2-5]。相對于熱循環(huán)擴(kuò)增，等溫擴(kuò)增外部條件要求更簡單，不需要額外的儀器輔助變溫，甚至可以在室溫下反應(yīng)，其中以HCR為基礎(chǔ)的等溫擴(kuò)增得到人們的廣泛關(guān)注[6]。

2004年，DIRKS等[7]首次提出HCR，一種無酶、高敏、簡單、高效能、不依賴儀器的等溫擴(kuò)增技術(shù)。HCR是通過一段核酸引發(fā)物(NI)使兩條發(fā)夾DNA(H1、H2)互相雜交的級聯(lián)反應(yīng)，形成穩(wěn)定的長雙鏈DNA，通常由幾十個甚至上百個重復(fù)單位(H1、H2)互補(bǔ)配對形成，對H1、H2進(jìn)行標(biāo)記可實現(xiàn)檢測信號的增強(qiáng)或放大，如熒光標(biāo)記、電化學(xué)標(biāo)記、納米粒子標(biāo)記等[8-10]。迄今為止，HCR已經(jīng)應(yīng)用于多種靶目標(biāo)的超靈敏檢測，包括核酸、蛋白質(zhì)，甚至在腫瘤細(xì)胞中也有一定的應(yīng)用[11-16]。除了靶目標(biāo)的檢測，HCR還可以聯(lián)合識別分子，實現(xiàn)原位或細(xì)胞內(nèi)成像，應(yīng)用于疾病的診斷和治療[17-18]。本文首先介紹了HCR的基本原理和設(shè)計原理，然后從核酸檢測、蛋白檢測、細(xì)胞檢測及生物成像等方面介紹了HCR的應(yīng)用進(jìn)展。

1 HCR基本原理

2004年，DIRKS等[7]首次提出HCR的基本概念，利用DNA與基質(zhì)的結(jié)合，同時進(jìn)行識別和信號放大作用的創(chuàng)新性技術(shù)。HCR主要是通過一段核酸引發(fā)物(NI)識別并引起發(fā)夾核苷酸(H1、H2)互相雜交，形成長雙鏈DNA的串聯(lián)級聯(lián)反應(yīng)。H1由a、 b、 c、b′構(gòu)成，H2由c′、b、a′、b′構(gòu)成(H1、H2先經(jīng)高溫變性冷卻后形成發(fā)夾結(jié)構(gòu))，NI由b′、a′構(gòu)成。當(dāng)NI不存在時，H1、H2可保持穩(wěn)定；當(dāng)NI存在時，通過互補(bǔ)配對與H1末端結(jié)合，打開H1發(fā)夾，暴露c、b′。暴露部分與H2末端互補(bǔ)，打開H2發(fā)夾暴露a′、b′(與NI序列相同)，從而持續(xù)打開H1和H2進(jìn)行HCR，形成長雙鏈DNA。DIRKS等[7]指出HCR產(chǎn)物的長短與加入NI量成反比。

2 HCR設(shè)計原理

常規(guī)的NI設(shè)計，可根據(jù)靶核酸序列選擇其某段特異性單鏈序列，一般為24 bp(前18 bp為b′，后6 bp為a′)；H1一般為48 bp，根據(jù)NI互補(bǔ)序列獲得a、b、b′序列，其環(huán)結(jié)構(gòu)c需額外設(shè)計；H2與H1一樣長，可通過H1互補(bǔ)序列和NI獲得c′、b、a′、b′[19]。MITI等[20]在常規(guī)的HCR設(shè)計原理的基礎(chǔ)上，描述了另一種自組裝反應(yīng)觸發(fā)特定核酸靶標(biāo)，用于檢測不同核酸溶液中的靶目標(biāo)，極大的提高了靈敏度。設(shè)計過程中需要遵守一些原則[21]：(1)末端(a、c′)的GC比例應(yīng)在30%～40%以下；(2)末端長度應(yīng)在12 bp以下，否則會影響發(fā)夾結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性；(3)莖長度(b、b′)應(yīng)大于末端長度以保持發(fā)夾結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性；(4)發(fā)夾序列(H1、H2)總體的GC比例應(yīng)大于60%。

3 HCR的應(yīng)用

與傳統(tǒng)的PCR相比，HCR是一種等溫的、無酶的擴(kuò)增技術(shù)。HCR和PCR主要不同點在于，HCR是一種引物擴(kuò)增而PCR是一種產(chǎn)物擴(kuò)增技術(shù)[22]。因此，HCR可以有效地減少非特異性擴(kuò)增，減少假陽性結(jié)果，降低交叉污染，提高檢測靈敏度。

3.1核酸檢測 核酸是疾病早期診斷中特異的標(biāo)志物，高敏高特異檢測核酸對臨床的診斷和治療具有極大的意義。SONG等[8]利用β-CD對芘的熒光增強(qiáng)及靶DNA引發(fā)HCR，實現(xiàn)了靶DNA無酶高靈敏檢測。其中，芘標(biāo)記H2為信號源，由于β-CD與帶負(fù)電荷的H2存在很強(qiáng)的靜電作用，芘較容易進(jìn)入β-CD腔，因此熒光信號明顯增強(qiáng)。而當(dāng)靶DNA存在時，H2參與HCR形成長雙鏈DNA，由于空間位阻作用使芘難以進(jìn)去β-CD腔，因此熒光信號弱，其檢測限可達(dá)0.1 nmol/L。LU 等[23]通過HCR觸發(fā)的酶級聯(lián)反應(yīng)建立了一種超靈敏比色法，H1和H2上分別標(biāo)記葡萄糖氧化酶(GOx)和辣根過氧化物酶(HRP),經(jīng)HCR提高了GOx/HRP的催化作用，實現(xiàn)了對靶DNA最低檢測限達(dá)5.2 fmol/L。MA等[11]利用DNA修飾膠體金作為捕獲探針，通過與靶DNA互補(bǔ)結(jié)合，暴露末端引發(fā)H1/H2級聯(lián)反應(yīng)。此時膠體金表面的長雙鏈DNA可以抵抗鹽離子誘導(dǎo)膠體金的聚集作用，使得溶液呈紅色。反之，若不存在靶DNA，HCR不能發(fā)生，鹽離子誘導(dǎo)使膠體金聚集呈藍(lán)色。此方法具有超高靈敏度和特異度，檢測限可達(dá)0.5 nmol/L。

HCR同樣可應(yīng)用于固相支持物表面，如電極，玻片，納米粒子，微孔，微流體等，將分析物同復(fù)雜的樣品體系分開。 YING等[12]用FAM標(biāo)記捕獲探針，靶DNA引發(fā)生物素化H1/H2(Bio-H1,Bio-H2)級聯(lián)反應(yīng)，HCR產(chǎn)物與樣品墊上的親和素化膠體金(AuNP-SA)結(jié)合，層析時被檢測線上包被的FAM抗體捕獲，可直接觀察陽性結(jié)果。檢測限低至1.76 pmol/L，比沒有HCR擴(kuò)增的層析低約2個數(shù)量級。CHEN等[9]把自催化鏈置換擴(kuò)增(ASDA)與HCR巧妙的結(jié)合，可進(jìn)行無標(biāo)記和多重放大檢測核酸。ASDA期間，利用DNA聚合酶和內(nèi)切酶對固定發(fā)夾探針和輔助DNA鏈的連續(xù)聚合、切開，回收大量中間DNA序列，從而催化鏈置換擴(kuò)增。同時，ASDA產(chǎn)物與H1/H2進(jìn)行HCR，形成富含胞嘧啶環(huán)的長雙鏈DNA，從而增多銀納米的聚集，增強(qiáng)電化學(xué)信號，其檢測限可達(dá)0.16 fmol/L。

3.2蛋白質(zhì)檢測 蛋白質(zhì)同樣也是疾病診斷中重要的標(biāo)志物，然而在臨床樣本中許多靶蛋白的豐度偏低，因此高敏高特異檢測靶蛋白同樣也是人們關(guān)注的重點。CHOI等[24]以熒光標(biāo)記H1/H2，通過與抗體偶聯(lián)的NI進(jìn)行HCR，檢測單核細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子和趨化因子。相對于無HCR的免疫熒光，免疫-HCR的檢測限和靈敏度提高近200倍。HOU等[13]將抗體和NI同時包被于納米金上形成Ab-AuNP-NI復(fù)合物，具有多個NI引發(fā)部位，可引發(fā)多個HCR產(chǎn)物包被于同一個納米金上，通過電化學(xué)信號檢測癌胚抗原(CEA)，線性范圍為1.0 pg/mL～20.0 ng/mL，檢測限可達(dá)0.42 pg/mL。XU等[14]將納米碳標(biāo)記H1/H2，與檢測抗體偶聯(lián)的NI引發(fā)HCR，通過HCR放大效應(yīng)及金屬增強(qiáng)熒光(MEF)構(gòu)建了一個雙擴(kuò)增熒光傳感器檢測甲胎蛋白(AFP)，線性范圍為0.000 5～5 ng/mL，檢測限可達(dá)94.3 fg/mL。

除了抗體外，適配體也能夠高親和高特異識別靶蛋白。適配體是一種短鏈單鏈DNA或RNA，因此可作為NI參與HCR，用于檢測蛋白質(zhì)。 WANG等[25]利用氧化石墨烯(GO)對ssDNA和dsDNA的親和性不同，分離H1/H2和HCR產(chǎn)物，從而提高檢測靈敏度。當(dāng)靶蛋白存在時，適配體識別靶蛋白并改變自身構(gòu)象，引發(fā)H1和H2級聯(lián)反應(yīng)形成長雙鏈DNA。而GO分離作用純化了HCR產(chǎn)物，通過熒光染料SYBR Green結(jié)合雙鏈DNA小溝，達(dá)到提高靈敏度的效果，該方法的檢測限可達(dá)1.25 pmol/L。 NIE等[26]通過適配體識別被磁珠抗體捕獲的卵巢癌標(biāo)志物CA125抗原，適配體引發(fā)納米金標(biāo)記H1和游離H2形成樹枝狀的長鏈，再利用鉬酸根與DNA磷酸酯基團(tuán)的氧化還原反應(yīng)，大量的磷酸集團(tuán)增加了電化學(xué)信號，使得檢測靈敏度顯著增強(qiáng)，檢測限可達(dá)50 μU/mL。

3.3腫瘤細(xì)胞檢測 腫瘤細(xì)胞的某些分子標(biāo)志物的表達(dá)水平與正常細(xì)胞有很大的不同，通過檢測這些差異性表達(dá)的標(biāo)志物有利于臨床早期診斷和治療癌癥。LI等[15]針對胃癌患者血清中microRNA-21設(shè)計H1/H2，當(dāng)microRNA-21存在時引發(fā)HCR，并通過SYBR GreenⅠ染料插入HCR產(chǎn)物作為信號，建立了無標(biāo)記熒光檢測模型，具有強(qiáng)熒光密度。其線性范圍為1～105fmol/L，miRNA檢測限可達(dá)0.255 4 fmol/L。YANG等[27]利用Au-S鍵將捕獲探針固定在金電極表面，探針、靶DNA和(NI)雜交形成“三明治”結(jié)構(gòu)，然后NI引發(fā)HCR形成長雙鏈DNA，最后通過RuHex與長雙鏈DNA的靜電吸附作用產(chǎn)生電化學(xué)信號的改變。這種以HCR為基礎(chǔ)的電化學(xué)物傳感器可以精準(zhǔn)的檢測I型乳腺癌基因，檢測靈敏度低至1 amol/L。

已有研究表明，可通過直接檢測腫瘤細(xì)胞膜表面分子標(biāo)志物來診斷癌癥，有效的避免了裂解細(xì)胞和提取靶目標(biāo)以檢測核酸和蛋白，提高了檢測的效率。ZHANG等[28]先將適配體序列(DNAa)和信號DNA(DNAb)部分互補(bǔ)雜交，當(dāng)靶細(xì)胞存在時，適配體特異性識別腫瘤細(xì)胞表面分子，構(gòu)象改變使DNAb游離。DNAb可引發(fā)H1/H2級聯(lián)反應(yīng)，形成長雙鏈DNA可作為強(qiáng)熒光效應(yīng)的銅粒子(CuNPs)的載體，從而實現(xiàn)了無酶定量檢測腫瘤細(xì)胞，其檢測限達(dá)50個細(xì)胞。ZHOU等[16]先將捕獲探針修飾到金電極表面，適配體通過部分互補(bǔ)的(NI)進(jìn)行HCR，HCR中的H1和H2經(jīng)特殊設(shè)計，形成的長雙鏈DNA含有許多分支序列，該分支序列與捕獲探針完全互補(bǔ)，因此提供了大量的捕獲位點。當(dāng)腫瘤細(xì)胞存在時，經(jīng)適配體的特異性識別及分支序列和捕獲探針互補(bǔ)雜交作用，可超靈敏捕獲腫瘤細(xì)胞，檢測乳腺癌MCF-7細(xì)胞的檢測限可達(dá)4個細(xì)胞。

3.4生物成像 熒光原位雜交(FISH)是通過識別細(xì)胞或組織內(nèi)的靶RNA，直接觀察RNA的表達(dá)量和分布，以闡明相關(guān)病理過程和臨床診斷。然而單個熒光標(biāo)記探針的熒光強(qiáng)度較弱,CHOI等[29]通過熒光標(biāo)記H1/H2進(jìn)行HCR-FISH，HCR產(chǎn)物能提供大量的熒光信號，HCR-FISH比FISH的熒光強(qiáng)度增強(qiáng)近200倍。YAMAGUCHI等[30]比較HCR-FISH與CARD-FISH和標(biāo)準(zhǔn)FISH檢測環(huán)境中的微生物，認(rèn)為HCR-FISH不但具有高特異性的強(qiáng)熒光信號，其檢出率也優(yōu)于其他的FISH，可用于單個微生物細(xì)胞檢測。 HUANG等[31]利用熒光共振轉(zhuǎn)移(FRET)結(jié)合HCR-FISH的方法，避免了FISH中反復(fù)沖洗的過程，消除了探針積累或退化引起的假陽性信號。主要通過3個發(fā)夾結(jié)構(gòu)(H1、H2、H3)的相互作用產(chǎn)生FRET信號，其中H2/H3兩端均標(biāo)記TAMRA和FAM，H1識別靶mRNA后暴露末端引發(fā)H2/H3介導(dǎo)的HCR，從而增強(qiáng)FRET信號，操作簡單易行，節(jié)約時間。

除了應(yīng)用于FISH成像，HCR還可以運(yùn)用于活細(xì)胞成像。WU等[32]將FAM和TMR分別標(biāo)記在H1/H2上，再包被于肽化納米金形成復(fù)合體，復(fù)合體可通過胞吞作用進(jìn)入胞內(nèi)。由于TMR的熒光吸收使胞內(nèi)僅有很弱的熒光信號，當(dāng)靶mRNA存在時，引發(fā)HCR使H1/H2與納米金分離，恢復(fù)FRET信號并增強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)成像。OU等[17]利用MnO2載體吸附H1/H2并送入活細(xì)胞內(nèi)，MnO2被胞內(nèi)谷胱甘肽降解，釋放H1/H2。然后通過胞內(nèi)miRNA觸發(fā)HCR，HCR產(chǎn)物上每兩個FAM和一個TAMRA靠近產(chǎn)生顯著增強(qiáng)的DD-A FRET信號，檢測限高達(dá)9.8 pmol/L。LIU等[18]報道了一種分枝HCR用于活細(xì)胞內(nèi)mRNA的高效信號放大成像，分枝HCR能夠通過單個NI引發(fā)的分枝產(chǎn)物定位活細(xì)胞中單個靶分子，結(jié)果顯示強(qiáng)烈的熒光斑點，其檢測限可達(dá)500 fmol/L。ZHANG等[33]把端粒酶引物序列和HCR引發(fā)物組成復(fù)合體，并轉(zhuǎn)染到細(xì)胞質(zhì)中。當(dāng)端粒酶存在時，復(fù)合物被識別，產(chǎn)生大量的NI，然后與H1/H2形成具有大量側(cè)鏈的長雙鏈DNA，可被復(fù)合物Q識別，產(chǎn)生增強(qiáng)信號，用于檢測細(xì)胞裂解物中的端粒酶活性，檢測限可達(dá)578個細(xì)胞/100μL。HUANG等[34]利用鏈霉親和素結(jié)合生物素化的H1/H2，分別形成發(fā)夾DNA四聯(lián)體，其中H1攜帶Cy3，H2攜帶Cy5。兩個四聯(lián)體均可高效的進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，并形成交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)狀結(jié)構(gòu)，可特異性識別靶miRNA，極大地提高了靈敏度和空間分辨率，同時利用FRET的雙發(fā)射比率成像，有效降低假信號的干擾。

4 小 結(jié)

通過以上綜述可以看出，無酶等溫擴(kuò)增的HCR已廣泛地應(yīng)用于檢測、成像和生物醫(yī)學(xué)，但HCR的應(yīng)用仍面臨許多挑戰(zhàn)。合適的H1/H2是HCR中的關(guān)鍵因素，H1/H2設(shè)計不完善可能會導(dǎo)致HCR失敗，而目前仍缺乏公認(rèn)的系統(tǒng)性發(fā)夾結(jié)構(gòu)設(shè)計指南。由于以核酸形式存在的適配體能夠識別蛋白質(zhì)、小分子及細(xì)胞，極大地促進(jìn)了HCR的發(fā)展，然而可供選擇的適配體不多，極大地限制了適配體-HCR體系。對于在固相支持物表面采用HCR，如何控制核酸探針的密度和方向是目前需解決的難題之一，否則易導(dǎo)致非特異性吸附和集群效應(yīng)，限制HCR的效能。在生物成像和生物醫(yī)學(xué)方面，由于核酸的大小和電荷作用，攜帶成像試劑或治療藥物的HCR產(chǎn)物難以進(jìn)入胞內(nèi)，僅有少量的適配體可通過胞吞進(jìn)入胞內(nèi)，極大的限制了胞內(nèi)成像和靶向治療。另外，高分子量的HCR產(chǎn)物對正常細(xì)胞有一定的非特異性吸附，可能會造成假陽性信號或殺死正常細(xì)胞和組織，而且胞內(nèi)對靶向藥物缺乏有效和精準(zhǔn)的釋放機(jī)制，以至于降低治療效果?，F(xiàn)如今，以HCR為基礎(chǔ)的應(yīng)用多停留在實驗室階段，其實際應(yīng)用仍然是個挑戰(zhàn)，進(jìn)一步研究HCR需建立在臨床應(yīng)用的基礎(chǔ)上，簡單而靈敏的POCT可作為未來研究HCR的方向之一。

盡管面臨許多挑戰(zhàn)，但無酶等溫擴(kuò)增的HCR體系能夠綜合各種各樣的納米材料、復(fù)合物和分析技術(shù)，促進(jìn)DNA納米技術(shù)的發(fā)展，加強(qiáng)這些方法在臨床診斷、治療、防控等方面的實際應(yīng)用。