楊長(zhǎng)青

一、 用反應(yīng)代謝物從化學(xué)結(jié)構(gòu)上預(yù)測(cè)具有肝毒性的藥物

反應(yīng)代謝物(reactive metabolites，RM)的概念首先來(lái)自于威斯康星大學(xué)醫(yī)學(xué)院米勒課題組的研究。他們首先證明了苯胺類偶氮染料的肝毒性和致癌性是由其氧化代謝后形成的RM所引起的。在將這一概念擴(kuò)展到人類DILI的研究中，首先發(fā)現(xiàn)了細(xì)胞色素P450 (CYP)介導(dǎo)的抗炎藥對(duì)乙酰氨基酚的RM是反應(yīng)性醌-亞胺中間體，該中間體能夠耗盡機(jī)體內(nèi)源性抗氧化劑谷胱甘肽(GSH)，并與肝蛋白共價(jià)結(jié)合?；谶@些以及過(guò)去3～4年間的許多其他毒性物質(zhì)的結(jié)構(gòu)學(xué)研究，現(xiàn)在普遍認(rèn)為，RM才是造成某些特異質(zhì)型DILI的病因。通過(guò)與細(xì)胞表面蛋白共價(jià)結(jié)合形成半抗原，RM可導(dǎo)致細(xì)胞的功能障礙或后繼免疫反應(yīng)。在眾多RM形成實(shí)驗(yàn)中，已推導(dǎo)出這些特定的分子結(jié)構(gòu)，因而將這類特定分子結(jié)構(gòu)在已公示的信息中限定為“警示結(jié)構(gòu)”。例如，最近對(duì)68種被召回或與DILI黑框警告(BBW)相關(guān)的藥物進(jìn)行分析表明，其中55種(81%)藥物具有警示結(jié)構(gòu)，而這55種藥物中確有36種(65%)存在RM形成的證據(jù)。因此從結(jié)構(gòu)-活性關(guān)系研究中也可以看出，RM形成是特異質(zhì)型DILI的一個(gè)令人信服的論據(jù)，而RM缺失與后繼藥物的安全性顯著改善又是一致的。該報(bào)告將突出RM概念和結(jié)構(gòu)警報(bào)的證據(jù)，建議利用結(jié)構(gòu)-毒性關(guān)系作為評(píng)估上市前藥物發(fā)生DILI風(fēng)險(xiǎn)的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子。

二、 應(yīng)用微工程化人肝細(xì)胞共培養(yǎng)模型預(yù)測(cè)藥物DILI風(fēng)險(xiǎn)

芝加哥伊利諾斯大學(xué)的Khetani教授認(rèn)為，動(dòng)物模型中的DILI并不總是與人類DILI相關(guān)，部分原因是藥物代謝途徑的物種差異。因此人類肝臟的體外模型現(xiàn)在正越來(lái)越多地應(yīng)用于補(bǔ)充、甚至在某些情況下取代動(dòng)物試驗(yàn)；更重要的是，這樣的模型能夠在整個(gè)化合物開發(fā)過(guò)程中更快、更經(jīng)濟(jì)地測(cè)試藥物和工業(yè)化學(xué)品的肝毒性。用原代人肝細(xì)胞模型評(píng)價(jià)化合物是篩選DILI風(fēng)險(xiǎn)的理想標(biāo)準(zhǔn)。然而在傳統(tǒng)的二維單細(xì)胞培養(yǎng)模式中，這類細(xì)胞還是表現(xiàn)出表型功能的快速下降。他們?cè)谶^(guò)去的10～15年中，運(yùn)用半導(dǎo)體驅(qū)動(dòng)的微加工工具，以及肝細(xì)胞與肝臟或非肝臟來(lái)源的非實(shí)質(zhì)細(xì)胞的共培養(yǎng)技術(shù)，精確調(diào)節(jié)肝細(xì)胞周圍的二維和三維微環(huán)境，以增強(qiáng)和穩(wěn)定細(xì)胞表型功能。將肝臟來(lái)源的非實(shí)質(zhì)細(xì)胞(例如庫(kù)普弗細(xì)胞、肝星狀細(xì)胞和竇狀內(nèi)皮細(xì)胞)置于工程化肝細(xì)胞培養(yǎng)平臺(tái)中，可確定細(xì)胞-細(xì)胞間的相互作用在人類DILI進(jìn)展中的作用途徑。利用患者特異性誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(iPSC)衍生的人肝細(xì)胞和適應(yīng)性免疫攻擊來(lái)闡明特異性DILI的發(fā)生機(jī)制，也是未來(lái)努力的方向。總之，微工程化人肝細(xì)胞共培養(yǎng)模型具有預(yù)測(cè)上市前藥物發(fā)生DILI風(fēng)險(xiǎn)的巨大潛力，并有助于闡明DILI的潛在機(jī)制。

三、 評(píng)估藥物研發(fā)中DILI風(fēng)險(xiǎn)的新策略

臨床前的動(dòng)物模型對(duì)檢測(cè)大多數(shù)人類的DILI普遍不敏感。因此，在藥物研發(fā)過(guò)程中需要對(duì)其DILI風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行廣泛的評(píng)估。來(lái)自舊金山Genentech公司的Proctor博士采用了一組體外模型，并特別考慮了理化特性、警示結(jié)構(gòu)和預(yù)測(cè)劑量/暴露，以研究潛在的DILI風(fēng)險(xiǎn)。當(dāng)然，在缺乏臨床前體內(nèi)肝毒性信息的情況下，很難利用體外數(shù)據(jù)來(lái)決定化合物的取舍。造成這一挑戰(zhàn)的因素之一是不確定哪些參數(shù)能夠真正預(yù)測(cè)DILI。這在一定程度上也是由于該領(lǐng)域的文獻(xiàn)中有許多相互矛盾的報(bào)道，這些報(bào)道使用了不同的測(cè)試系統(tǒng)、分類標(biāo)準(zhǔn)、統(tǒng)計(jì)方法和實(shí)驗(yàn)條件，使得交叉研究比較困難。為了解決這個(gè)問(wèn)題，他們開始評(píng)估藥物大量的生理化學(xué)特性，通過(guò)計(jì)算機(jī)模擬酶學(xué)和體外測(cè)定的整體預(yù)測(cè)性，使用一致的驗(yàn)證系統(tǒng)，運(yùn)用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法單獨(dú)或組合地識(shí)別預(yù)測(cè)各參數(shù)的性能。在使用不同的測(cè)試系統(tǒng)對(duì)173種上市前化合物進(jìn)行分析后，發(fā)現(xiàn)與臨床DILI相關(guān)的占47%。對(duì)于以IC50值為終點(diǎn)的參數(shù)，他們還通過(guò)校正每個(gè)化合物有效暴露時(shí)的最大血漿濃度來(lái)估計(jì)體外安全邊際(MOS)。

四、 計(jì)算機(jī)模擬和體外實(shí)驗(yàn)?zāi)M，預(yù)測(cè)特異質(zhì)型DILI

在肝臟的適應(yīng)或“耐受”壓力方面，人與人之間存在著差異性，這也是特異質(zhì)型DILI發(fā)生的因素之一。來(lái)自哈姆納藥物安全研究所Howell博士重點(diǎn)討論了這一因素。肝細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)的改變影響著胞內(nèi)線粒體的生物形成能力，描述這一動(dòng)態(tài)過(guò)程的數(shù)學(xué)模型已被納入到DILI評(píng)估系統(tǒng)：DILIsym。DILIsym是一項(xiàng)在歷時(shí)9年努力后，得到了19家最大的制藥公司、FDA和學(xué)術(shù)界共同支持所產(chǎn)生的一個(gè)DILI評(píng)估系統(tǒng)。它采用了“中間”定量系統(tǒng)毒理學(xué)(QST)的方法，并運(yùn)用微分方程來(lái)概括藥物可能導(dǎo)致肝損傷的關(guān)鍵過(guò)程，通過(guò)改變參數(shù)來(lái)創(chuàng)建模擬的患者群體(SimPops)，以反映遺傳和非遺傳性變異。該評(píng)估系統(tǒng)已經(jīng)完成了軟件制作(DILIsym，DILIsym Services Inc.，Simulations Plus公司)，將會(huì)越來(lái)越多地應(yīng)用于制藥公司的開發(fā)決策。DILIsym已經(jīng)在多組上市前的藥物中進(jìn)行了測(cè)試，其在80%以上的預(yù)測(cè)病例中都是準(zhǔn)確的。