陳晨 譚焰

南京醫(yī)科大學(xué)附屬南京醫(yī)院(南京市第一醫(yī)院)呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科210000

第一代測序技術(shù)以Sanger雙脫氧核苷酸鏈終止法為代表，并借此完成了第一個(gè)人類基因組圖譜的繪制，極大地拓展了醫(yī)學(xué)研究的廣度和深度。但由于該法通量低且耗時(shí)耗力，隨著大數(shù)據(jù)信息化大時(shí)代的到來，第二代測序技術(shù)[高通量測序技術(shù)(high-throughput sequencing，nextgeneration sequencing，NGS)]應(yīng)運(yùn)而生。NGS的基本原理即所謂的“邊合成邊測序”，將DNA片段化從而建立DNA文庫進(jìn)行多克隆PCR，對每一步引物雜交及酶延伸反應(yīng)產(chǎn)生的信號(hào)進(jìn)行檢測。無論是面對目前已知或未知的病原體，甚至是對宏基因組學(xué)這個(gè)我們尚未完全了解的神秘的領(lǐng)域，利用NGS都能精確、快速獲得大量數(shù)據(jù)以供研究，獨(dú)特優(yōu)勢使其越來越多地被引入到臨床疾病分子診療之中。為提高對該技術(shù)的認(rèn)識(shí)，現(xiàn)對其在呼吸道感染領(lǐng)域的應(yīng)用進(jìn)行簡要介紹。

1 NGS在呼吸道病毒感染中的應(yīng)用

NGS技術(shù)不僅提高了臨床檢測病毒的能力，同時(shí)可全面了解感染病原體的個(gè)性化特征，對發(fā)現(xiàn)更多種類、更多基因型、耐藥、治療效果、疫苗研發(fā)、檢測有效性及研究宏基因組學(xué)均有不同程度的影響[1]。

1.1 檢測未知病毒 PCR無法應(yīng)用于未知病毒是其最大的限制，而NGS技術(shù)填補(bǔ)了此項(xiàng)空白。2012年荷蘭研究者對1例因急性肺炎轉(zhuǎn)腎衰竭而死亡的患者痰液標(biāo)本進(jìn)行測序從而發(fā)現(xiàn)了中東呼吸綜合征冠狀病毒[2]。2014年美國研究人員發(fā)現(xiàn)的新正黏病毒正是通過對受蜱蟲叮咬而死亡的患者血液標(biāo)本進(jìn)行測序而獲得的，因此在面對未知病毒所導(dǎo)致的疾病爆發(fā)疫情時(shí)，NGS技術(shù)總能及時(shí)協(xié)助研究者鑒定新病毒。

1.2 分析病毒遺傳進(jìn)化 NGS可通過對病毒基因組測序，將相同或近似種屬的病毒進(jìn)行比較，對毒株的來源、進(jìn)化、變異實(shí)現(xiàn)動(dòng)態(tài)監(jiān)測，并對病毒是否能造成人群中流行進(jìn)行預(yù)測。2016年Wang等[3]從1例腺病毒陽性的嚴(yán)重急性呼吸道感染(severe acute respiratory infection，SARI)患兒痰液標(biāo)本中分離出腺病毒重組株(CBJ113)，將Sanger法與NGS聯(lián)合對CBJ113進(jìn)行系統(tǒng)性分析，發(fā)現(xiàn)該毒株與HAd V-C2、HAd V-C6、HAd V-C1、HAd V-C5、HAd VC57同源，且重組株的E4orf1與DNA多聚酶基因分別與HAd V-5和HAd V-6的對應(yīng)基因高度相似，因此將其歸為HAd V-C分支下的一個(gè)新亞型。

1.3 探索病毒與宿主之間相互作用 當(dāng)前對于病毒感染后基因水平免疫調(diào)節(jié)的變化仍然知之甚少，為了探索臨床預(yù)后與免疫調(diào)節(jié)機(jī)制之間的聯(lián)系，Hou等[4]對近期感染H7N9患者的T細(xì)胞及B細(xì)胞進(jìn)行深度測序，結(jié)果表明，T細(xì)胞及B細(xì)胞的所有組成成分均表現(xiàn)出表達(dá)水平高度活躍及獨(dú)特的克隆型改變。在感染過程中，T細(xì)胞β鏈持續(xù)收縮，免疫球蛋白重鏈恢復(fù)結(jié)構(gòu)多樣性，預(yù)后較好的患者T細(xì)胞多樣性下調(diào)而B細(xì)胞多樣性更高，同時(shí)在這些病例中發(fā)現(xiàn)了對血凝素H7親和的已知抗體序列，因此NGS可作為預(yù)測疾病病程及預(yù)后的有效指標(biāo)而應(yīng)用于臨床，也可對病毒轉(zhuǎn)錄組、microRNA進(jìn)行測序，動(dòng)態(tài)檢測病毒的復(fù)制過程及病毒表達(dá)蛋白的差異。

2 NGS在呼吸道細(xì)菌感染中的應(yīng)用

2.1 致病菌與定植菌 在人體與外界相通的黏膜表面生存且不引起宿主反應(yīng)的細(xì)菌稱為定植菌。雖然定植不是感染，但可成為院內(nèi)感染的來源及誘因。病原體從定植到致病的進(jìn)化改變目前尚未完全明確，Young等[5]利用高通量測序探究金黃色葡萄球菌從定植進(jìn)展到引起致命血流感染過程中的基因改變，從中發(fā)現(xiàn)了30個(gè)單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphis，SNP)和4個(gè)缺失/插入變異，盡管引起菌血癥的細(xì)菌與原本的無癥狀定植菌僅有8個(gè)突變的不同，但一半的突變可導(dǎo)致蛋白質(zhì)斷裂，其中包括與金黃色葡萄球菌致病性相關(guān)的AraC家族轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子中的一個(gè)提前終止密碼子。分析2例無癥狀攜帶者中的細(xì)菌進(jìn)化過程同樣證實(shí)了蛋白質(zhì)斷裂對感染進(jìn)展的影響。高通量技術(shù)可檢測到其他技術(shù)無法探測到的病原體的少量基因突變，從而深入研究病原菌在宿主體內(nèi)的進(jìn)化動(dòng)力學(xué)，有助于臨床區(qū)分致病菌與定植菌，進(jìn)行更有針對性的抗感染治療。

2.2 耐藥菌 呼吸道耐藥菌群的感染隨著抗生素的廣泛使用而日益增多，感染耐藥菌的患者預(yù)后普遍不如敏感菌感染者，且增加臨床醫(yī)師診療的壓力，造成醫(yī)療資源的浪費(fèi)。目前臨床常見的耐藥菌主要為：肺炎克雷伯桿菌、銅綠假單胞菌、鮑曼不動(dòng)桿菌、金黃色葡萄球菌等。及時(shí)探測捕捉到耐藥菌群的感染對于呼吸道感染尤其是院內(nèi)感染的控制及預(yù)防意義重大。方小龍等[6]利用NGS檢測246株銅綠假單胞菌菌株，其中102株顯示多重耐藥，21株廣泛耐藥株僅對多黏菌素敏感，進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)了該菌的8種耐藥分型，與耐藥相關(guān)基因共21個(gè)，其中17個(gè)位點(diǎn)存在非同義突變，在總的SNP位點(diǎn)中占24.6%。Snyder等[7]利用NGS對某機(jī)構(gòu)6年內(nèi)引起持續(xù)流行的銅綠假單胞菌株進(jìn)行測序，所得數(shù)據(jù)表明最終爆發(fā)是由于單個(gè)堿基的變異累積，導(dǎo)致包括lasR、nrd G、tadZ等多種基因產(chǎn)生SNP，而Bachman等[8]通過建立小鼠肺克KPRR1致肺炎模型，在NGS的幫助下對超過25 000個(gè)轉(zhuǎn)錄子突變體進(jìn)行插入位點(diǎn)測序，從而確定了超過300個(gè)基因影響小鼠感染肺炎的嚴(yán)重程度，其中許多基因來源于世界各地的肺炎克雷伯桿菌菌株，包括耐藥株。2016年Wang等[9]使用NGS對鮑曼不動(dòng)桿菌菌株MDR-SHH02進(jìn)行抗生素耐藥基因的檢測。王娟等[10]對西京醫(yī)院痰液標(biāo)本分離的42株廣泛耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌測序其產(chǎn)生D類碳青霉烯酶基因Ox A-23、Ox A-51的存在情況，發(fā)現(xiàn)產(chǎn)Ox A-23碳青霉烯酶是該院下呼吸道感染的主要耐藥機(jī)制從而為臨床及時(shí)應(yīng)用針對性抗生素提供重要依據(jù)。利用NGS可分析耐藥菌的序列變化從而揭示細(xì)菌的進(jìn)化過程，追蹤原始突變株，及時(shí)鑒別出感染高危耐藥菌的人群從而有效控制感染，并且有助于開發(fā)針對感染相關(guān)基因或耐藥基因的新型抗生素。

3 在非典型菌感染中的應(yīng)用

呼吸道感染中非典型菌同樣占有較高的比例，如肺炎支原體、肺炎衣原體、軍團(tuán)菌等，且與常見病原菌相比，非典型菌引起的肺炎能引起更高的病死率。肺炎支原體根據(jù)P1連接分子分為type1及type 2，Diaz等[11]對來自不同時(shí)期不同地區(qū)引起爆發(fā)流行的107株肺炎支原體菌株進(jìn)行測序，總共發(fā)現(xiàn)了超過3 000個(gè)SNP，包括520個(gè)特異性的SNP，在原有的type 1、type 2下又各自劃分了3個(gè)亞組，對不同地區(qū)時(shí)期的分離株進(jìn)行測序，不僅可以發(fā)現(xiàn)肺炎支原體的傳播過程，更可區(qū)分不同地區(qū)的潛在感染人群，提前預(yù)防感染的全面爆發(fā)，對感染管控大有裨益。

4 在分枝桿菌感染中的應(yīng)用

一般而言，治療藥物的優(yōu)化和免疫干預(yù)的發(fā)展取決于病原體的適應(yīng)性及遺傳變異，但有趣的是，結(jié)核分枝桿菌盡管基因組變異較少，卻依然表現(xiàn)出耐藥特性，Copin等[12]利用NGS比較導(dǎo)致小鼠感染肺結(jié)核的結(jié)核分枝桿菌的遺傳多樣性發(fā)現(xiàn)，新的基因突變雖然可在體外培養(yǎng)過程中逐漸累積，但這些累積的突變一旦進(jìn)入體內(nèi)即被宿主選擇凈化，優(yōu)勢基因型依然得到保留，另外對T細(xì)胞缺陷及免疫正常的小鼠進(jìn)行接種并傳代結(jié)核分枝桿菌，NGS分析發(fā)現(xiàn)，T細(xì)胞能增加結(jié)核分枝桿菌遺傳多樣性。測序技術(shù)作為輔助手段，面對日益增多的耐藥結(jié)核分支桿菌的感染有助于更深入地研究潛在耐藥機(jī)制。Cui等[13]對178例空洞型及非空洞型肺結(jié)核患者(1∶1)、95名健康對照者的血漿樣本采用NGS分析血漿樣本中的miRNA表達(dá)水平，在空洞型肺結(jié)核和非空洞型肺結(jié)核患者血漿樣品中共發(fā)現(xiàn)29種miRNA與健康對照組表達(dá)水平有差異，進(jìn)一步定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(quantificational real-time polymerase chain reaction，q RT-PCR)分析證實(shí)miR-769-5p、miR-320a和miR-22-3p在結(jié)核患者和健康對照組中表達(dá)顯著不同，因此可將這3類miRNA作為結(jié)核感染的潛在血漿標(biāo)志物來檢測可能的患者從而減少臨床漏診。

5 在呼吸道真菌感染中的應(yīng)用

隨著人均壽命延長，臨床醫(yī)師開始面對越來越復(fù)雜的的呼吸道感染情況如使用免疫抑制劑、器官移植、化療等，侵襲性真菌感染(invasive fungal infection，IFI)的病例在近年來悄然上升，由于真菌診斷較為困難，且此類患者常合并基礎(chǔ)疾病，因而IFI病死率較高，嚴(yán)重威脅著患者的健康。目前PCR是分子診斷中應(yīng)用最為廣泛的技術(shù)，但僅適用于已知真菌，無法鑒別未知真菌，且當(dāng)前真菌的分類和命名更新?lián)Q代十分迅速，因此NGS開始應(yīng)用于病原真菌的鑒定。通過將所得數(shù)據(jù)進(jìn)行科學(xué)分析，對真菌進(jìn)化機(jī)制及生物學(xué)特征有更全面而客觀的了解。2018年Xiao等[14]收集了2009年8月1日至2014年7月31日來自65家三甲醫(yī)院的8 829例念珠菌菌株進(jìn)行測序，共檢出32種念珠菌，白色念珠菌最多(44.9%)，在這以后依次排列為近平滑念珠菌(20.0%)、熱帶念珠菌(17.2%)、光滑念珠菌(10.8%)，同時(shí)藥敏試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)白色念珠菌與近平滑念珠菌對氟康唑和伏立康唑敏感(＜6%的耐藥率)，而熱帶念珠菌對氟康唑和唑類的交叉耐藥性率較高(分別為13.3%和12.9%)。侵襲性肺煙曲霉病的發(fā)病率隨著免疫抑制劑的應(yīng)用逐年升高。通過NGS鑒定高表達(dá)的煙曲霉菌基因，并利用序列相似性和基因表達(dá)研究煙曲霉基因所分泌的蛋白質(zhì)組學(xué)[12]從而有助于研究煙曲霉菌感染與宿主之間的相互作用機(jī)制。

6 結(jié)語

NGS對呼吸道感染的診斷、鑒別、預(yù)防控制、治療及研究病原體的進(jìn)化過程均有極大的參考價(jià)值，通過測序技術(shù)還可發(fā)現(xiàn)新的代謝途徑及耐藥靶點(diǎn)，為新藥的開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。雖然前景可觀，然而由于尚未完善菌株/毒株數(shù)據(jù)庫信息，缺乏統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)參考序列，面對大量的數(shù)據(jù)需要專門的生物信息學(xué)研究人員進(jìn)行分析整合[15]，更高效地利用NGS輔助感染治療，評估治療效果及預(yù)后，同時(shí)需要進(jìn)一步降低運(yùn)行成本使之成為臨床上可廣泛引用的技術(shù)手段，因此NGS仍有較廣闊的發(fā)展空間，依然期待更高質(zhì)高量的創(chuàng)新[16]。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突