張國瑞 李曉明 郭雪君

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院呼吸內(nèi)科200092

間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cell,MSC)是目前研究最廣泛的多能干細(xì)胞之一,命名是基于其能夠分化為骨、軟骨及脂肪等中胚層組織的特性。MSC目前并無特異性表型,國際細(xì)胞治療學(xué)會(huì)提出了MSC的鑒定標(biāo)準(zhǔn),包括貼壁生長、間葉組織分化潛能以及一些表面抗原的表達(dá)。除了骨髓,幾乎所有出生后的器官及組織中均存在MSC,包括脂肪、乳牙、外周血、關(guān)節(jié)軟骨、臍帶血等。到目前為止,骨髓、脂肪組織及臍帶血通常被認(rèn)為是各項(xiàng)研究的主要來源。MSC不表達(dá)人類組織相容性抗原MHC-Ⅱ類分子及共刺激分子CD80、CD86且能夠在體外大量擴(kuò)增而不失其免疫調(diào)節(jié)及分化潛能,這些優(yōu)勢均使得MSC能夠在組織工程、再生醫(yī)學(xué)、炎癥及免疫相關(guān)性疾病的治療中發(fā)揮重要作用。

MSC已被證實(shí)在實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎、移植物抗宿主病、支氣管哮喘、COPD、肺纖維化、糖尿病等多種疾病動(dòng)物模型中起到了改善疾病的作用。大量研究證實(shí),MSC通過旁分泌及細(xì)胞間接觸的方式發(fā)揮其改善作用。本文就MSC在炎癥及免疫相關(guān)性疾病中的作用及機(jī)制的研究進(jìn)展作一綜述。

1 MSC在組織損傷中的分化作用

MSC在多種組織中的廣泛存在以及其多向分化能力使得其在多種臨床疾病模型中存在非常廣闊的前景,盡管MSC缺失特異性的標(biāo)志以示蹤追尋其向受損部位遷移的方式,我們有理由推測病理?xiàng)l件下嚴(yán)重的組織損傷可以動(dòng)員并募集MSC至損傷部位進(jìn)行修復(fù)。外源性MSC應(yīng)用時(shí)也可歸巢至損傷部位,向特定細(xì)胞分化并促進(jìn)組織再生。MSC通過向多種基質(zhì)細(xì)胞或受損的組織細(xì)胞分化,并可以在局部微環(huán)境與多種類型的組織細(xì)胞及免疫細(xì)胞比如內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等相互作用,促進(jìn)組織損傷的修復(fù)。有研究在豬胰彈性蛋白酶構(gòu)建的小鼠肺氣腫模型中,體外誘導(dǎo)羊水MSC向肺上皮祖細(xì)胞樣細(xì)胞分化后氣道注射可以減輕氣道炎癥和纖維化效應(yīng),恢復(fù)肺泡再生和減少凋亡[1]。實(shí)際情況下MSC自發(fā)向受損細(xì)胞分化是相對罕見的,更多的是通過分泌一系列的生長因子,比如表皮生長因子、纖維母細(xì)胞生長因子、轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factor-β,TGF-β)、血管內(nèi)皮生長因子等,進(jìn)而影響成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的發(fā)育,最終通過細(xì)胞外基質(zhì)與血管促進(jìn)組織的修復(fù),這可能是MSC促進(jìn)組織修復(fù)的基本機(jī)制。組織損傷涉及到多種免疫細(xì)胞的參與,但過度的免疫細(xì)胞激活則可能反而加重?fù)p傷。MSC的低免疫原性及高免疫抑制能力已被證實(shí),在眾多損傷模型中MSC的修復(fù)可能部分歸功于其免疫抑制功能。

2 MSC在細(xì)胞間接觸時(shí)的修復(fù)及免疫調(diào)節(jié)作用

早期研究表明支氣管哮喘發(fā)病過程存在上皮細(xì)胞線粒體功能障礙,而新證據(jù)表明,MSC可以通過細(xì)胞間連接比如隧道納米管將線粒體轉(zhuǎn)移至受損的上皮細(xì)胞使其恢復(fù)正常功能。研究發(fā)現(xiàn),線粒體Rho-GTP酶Miro1參與調(diào)控MSC線粒體至上皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)移[2]。該研究通過過表達(dá)MSC中的Miro1增強(qiáng)了線粒體的轉(zhuǎn)移及對上皮損傷的修復(fù)能力,而Miro1的敲減則引起相反的結(jié)果。在魚藤酮構(gòu)建的動(dòng)物氣道炎癥及哮喘模型中,相對普通MSC,過表達(dá)Miro1的MSC增強(qiáng)了對氣道炎癥的改善作用,同時(shí)逆轉(zhuǎn)了氣道高反應(yīng)性及氣道重塑。而在另一體外實(shí)驗(yàn)中,過表達(dá)Miro1并沒有改變一氧化氮(nitric oxide,NO)、TGF-β、IL-10以及前列腺素E2(prostaglandin E2,PGE2)的表達(dá),即未對MSC分泌特性產(chǎn)生影響,但降低了炎癥因子刺激的支氣管上皮細(xì)胞分泌的TSLP、IL-25以及IL-33的表達(dá)?？偟膩碚f,過表達(dá)Miro1的MSC通過隧道納米管轉(zhuǎn)移線粒體改善了上皮細(xì)胞的損傷,避免了免疫反應(yīng)的放大,最終增強(qiáng)了MSC在哮喘模型中的治療效能。

研究顯示,多能干細(xì)胞來源的MSC與人氣道平滑肌細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)可降低煙熏提取物刺激引發(fā)的平滑肌細(xì)胞線粒體活性氧水平,緩解線粒體膜電位下降以及細(xì)胞凋亡。在體則可緩解臭氧暴露構(gòu)建的COPD模型中線粒體功能障礙,降低氣道高反應(yīng)性以及減輕氣道炎癥。這些效應(yīng)至少部分依賴于細(xì)胞間接觸的線粒體轉(zhuǎn)移以及旁分泌調(diào)節(jié)[3]。

很多研究證實(shí),在MSC介導(dǎo)的免疫調(diào)節(jié)過程中,促炎細(xì)胞因子具有重要作用,MSC在炎癥因子的刺激下產(chǎn)生多種趨化因子及黏附因子,使MSC與免疫細(xì)胞密切接觸,在這種條件下MSC可通過分泌多種因子等方式發(fā)揮最大的抑制效應(yīng)。

3 MSC分泌多種因子在免疫調(diào)節(jié)中的作用

在多項(xiàng)研究中,IL-10、TGF-β、NO、吲哚胺2，3-雙加氧酶(indoleamine 2，3-dioxygenase,IDO)、腫瘤壞死因子誘導(dǎo)蛋白6(tumor necrosis factor-stimulated gene 6,TSG-6)以及PGE2分別被認(rèn)為參與介導(dǎo)MSC的免疫抑制作用。有研究通過分離猴、豬、小鼠、大鼠、倉鼠、人、兔的骨髓MSC,體外實(shí)驗(yàn)均驗(yàn)證了其可發(fā)揮免疫抑制作用,通過誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)及IDO抑制劑發(fā)現(xiàn)骨髓MSC發(fā)揮免疫抑制作用的因子依賴于物種。人、猴、豬來源的骨髓MSC利用IDO進(jìn)行免疫抑制,而小鼠、大鼠、倉鼠、兔來源的骨髓MSC則依賴iNOS表達(dá)[4]。

3.1NO NO是一種不穩(wěn)定的、具有生物活性的、快速擴(kuò)散的氣體小分子。NO及其衍生的活性氮可以影響多種酶、離子通道和受體。在炎癥因子的刺激下小鼠MSC可上調(diào)iNOS的表達(dá),進(jìn)而調(diào)控NO的生成,同時(shí)MSC表達(dá)CXCL9、CXCL10及CXCL11等多種趨化因子,引起淋巴細(xì)胞向MSC的趨化,使NO可以在局部環(huán)境抑制淋巴細(xì)胞的增殖。NO的不穩(wěn)定使得其只能在MSC周邊很小的范圍內(nèi)產(chǎn)生生理作用。因此,在體外MSC與淋巴細(xì)胞transwell共培養(yǎng)體系中,NO擴(kuò)散受限,免疫抑制作用不如細(xì)胞直接接觸共培養(yǎng)效應(yīng)明顯。NO促進(jìn)T淋巴細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子5(signal transducers and activators of transcription 5,STAT5)的磷酸化,進(jìn)而抑制淋巴細(xì)胞的增殖,并促進(jìn)細(xì)胞的凋亡。研究發(fā)現(xiàn),T細(xì)胞來源的NO抑制CD4+T細(xì)胞向Th17分化,NO可以引起Th17特異性轉(zhuǎn)錄因子RORγ酪氨酸殘基的硝基化,抑制RORγ與IL-17基因啟動(dòng)子的結(jié)合,抑制Th17的分化[5]。iNOS抑制劑或者iNOS基因敲除都能很大程度上逆轉(zhuǎn)MSC在小鼠移植物抗宿主病模型及遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)中的治療效應(yīng)[6]。

在大鼠胃潰瘍模型中,MSC、NO或者M(jìn)SC與NO聯(lián)合均可通過抗炎、血管生成和抗凋亡的作用對胃潰瘍黏膜病變產(chǎn)生治療作用。在分枝桿菌構(gòu)建的小鼠膿腫模型中,靜脈注射MSC不僅提高了小鼠的存活率,而且增強(qiáng)了小鼠肺及脾臟的細(xì)菌清除。此外,MSC通過增強(qiáng)NO及PGE2的表達(dá)以及促進(jìn)CD4+/CD8+T細(xì)胞、高表達(dá)CD11b的巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞向感染的肺臟募集進(jìn)而治療分枝桿菌感染。

3.2IDO IDO在MSC發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用中的地位得到越來越多研究的證實(shí),包括抑制T淋巴細(xì)胞及自然殺傷細(xì)胞的增殖等。IDO是必需氨基酸色氨酸代謝的限速酶,由此導(dǎo)致的局部色氨酸的消耗以及產(chǎn)生的具有免疫調(diào)節(jié)作用的色氨酸代謝產(chǎn)物被認(rèn)為有助于IDO表達(dá)細(xì)胞,包括MSC發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。其中犬尿氨酸與犬尿酸(KYNA)是人MSC產(chǎn)生最多的色氨酸代謝產(chǎn)物。研究發(fā)現(xiàn),KYNA可以通過調(diào)節(jié)炎癥相關(guān)基因比如IL-6的表達(dá)發(fā)揮免疫抑制作用。KYNA可以與MSC芳香烴受體結(jié)合后入核,促進(jìn)靶基因TSG-6的表達(dá),緩解了急性肺損傷模型中性粒細(xì)胞浸潤[7]。有研究發(fā)現(xiàn)人MSC可劑量依賴性抑制病毒特異性T細(xì)胞的增殖。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn),病毒特異性T細(xì)胞產(chǎn)生的干擾素γ(interferon-γ,IFN-γ)刺激了人MSC的IDO活性,進(jìn)而抑制了混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)中淋巴細(xì)胞的增殖,該抑制作用可被IDO抑制劑1-MT部分逆轉(zhuǎn)[8]。在異位氣管移植模型中,人脂肪來源的MSC可以通過減少上皮細(xì)胞損傷、凋亡及管腔阻塞從而改善閉塞性細(xì)支氣管炎,該效應(yīng)至少部分是通過提高IDO表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)Treg并抑制T細(xì)胞浸潤而起作用[9]。

Gonzalo-Gil等[10]在小鼠關(guān)節(jié)炎模型中給予人MSC后通過上調(diào)淋巴結(jié)中Treg及Th1細(xì)胞比例以及IDO的表達(dá)從而緩解了炎癥反應(yīng)。此外,人MSC可通過上調(diào)IDO以及人類白細(xì)胞抗原G抑制克羅恩病腸黏膜T淋巴細(xì)胞引起的過度的炎癥反應(yīng)。人MSC同樣可通過分泌大量的IDO抑制系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者T淋巴細(xì)胞增殖,其中CD8+T細(xì)胞分泌的IFN-γ通過IFNGR1/Jak2/STAT信號通路增強(qiáng)了IDO的活性[11]。通過對IFN-γ刺激過的MSC進(jìn)行流式染色,研究人員發(fā)現(xiàn)IDO與PD-L1的表達(dá)與MSC對淋巴細(xì)胞增殖的抑制功能呈正相關(guān)[12]。這些都說明了IDO在人MSC免疫調(diào)節(jié)功能中的重要作用。

3.3PGE2PGE2是MSC在炎癥因子刺激后產(chǎn)生的另一種免疫抑制分子。已有報(bào)道PGE2參與MSC介導(dǎo)的對T淋巴細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞以及巨噬細(xì)胞的抑制。在小鼠炎癥性腸病模型中,腹腔注射貓脂肪MSC可以通過分泌PGE2進(jìn)而增加Foxp3+Treg的比例來減輕炎癥反應(yīng)[13]。MSC可抑制na?ve CD4+細(xì)胞及記憶性T細(xì)胞向Th17分化,同時(shí)也能抑制單側(cè)輸尿管梗阻模型炎癥部位Th17分泌IL-17A,該效應(yīng)通過細(xì)胞接觸后誘導(dǎo)MSC環(huán)氧合酶2的生成,進(jìn)而分泌PGE2并和前列腺素受體EP4結(jié)合而完成[14]。研究發(fā)現(xiàn),促炎型M1巨噬細(xì)胞可通過MSC環(huán)氧合酶2-PGE2途徑促進(jìn)成骨分化,這可能為非甾體類抗炎藥對骨折愈合的不良影響提供一種可能的解釋[15]。在小鼠急性肝衰竭模型中,MSC可通過分泌PGE2抑制肝細(xì)胞凋亡,還可通過活化YAP使其相關(guān)基因表達(dá)增加并激活哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白,協(xié)同刺激肝細(xì)胞的增殖,最終促進(jìn)急性肝衰竭的恢復(fù)[16]。PGE2是炎癥微環(huán)境重要組成部分,其在MSC介導(dǎo)的免疫調(diào)節(jié)作用中的角色需要進(jìn)一步研究。在脂多糖誘導(dǎo)的急性肺損傷小鼠模型中氣道給予臍帶血來源的MSC可以顯著提高生存率并減輕肺部炎癥。蛋白質(zhì)芯片及生物信息學(xué)分析顯示MSC主要通過旁分泌尤其是PGE2的分泌發(fā)揮治療作用[17]。

3.4TSG-6 TSG-6是一種廣泛表達(dá)的抗炎因子,參與多種炎癥及免疫相關(guān)性疾病進(jìn)程。如前所述,色氨酸代謝產(chǎn)物KYNA促進(jìn)靶基因TSG-6的表達(dá),緩解了急性肺損傷模型中性粒細(xì)胞浸潤。研究發(fā)現(xiàn),在高氧誘導(dǎo)的新生小鼠支氣管肺發(fā)育不良模型中,腹腔注射MSC條件培養(yǎng)基及外泌體均可顯著改善肺、心和腦病理,進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)外泌體中存在的TSG-6可減輕支氣管肺發(fā)育不良及相關(guān)疾病,給予相應(yīng)抗體或者siRNA敲除均逆轉(zhuǎn)了MSC外泌體的治療作用,這都提示TSG-6在支氣管肺發(fā)育不良的治療中發(fā)揮重要作用[18]。在小鼠原位肺移植構(gòu)建的缺血再灌注模型中,靜脈給予MSC提高動(dòng)脈血的氧合能力,減少肺部炎癥細(xì)胞浸潤,降低Toll樣受體4表達(dá),促進(jìn)TSG-6的生成,使移植肺免受缺血再灌注及細(xì)胞凋亡的影響[19]。小鼠炎癥性腸病模型中,MSC通過釋放TSG-6誘導(dǎo)小鼠巨噬細(xì)胞表型向抗炎型M2巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化,減輕了硫酸右旋糖酐鈉誘導(dǎo)的結(jié)腸炎[20]。同樣有研究發(fā)現(xiàn)在小鼠糖尿病模型中,結(jié)膜下注射MSC可通過分泌TSG-6激活角膜上皮干細(xì)胞/祖細(xì)胞,促進(jìn)M2巨噬細(xì)胞極化,促進(jìn)了糖尿病小鼠角膜上皮的愈合[21]。在脂多糖誘導(dǎo)的小鼠重癥急性胰腺炎模型中,腹腔注射MSC分泌的TSG-6顯著抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及炎癥反應(yīng)中的核轉(zhuǎn)錄因子κB活性,進(jìn)而改善重癥急性胰腺炎[22]。

3.5IL-10 盡管IL-10被認(rèn)為參與了MSC介導(dǎo)的免疫調(diào)節(jié)作用,MSC是否直接分泌IL-10仍需要更多的證據(jù)來證明。IL-10轉(zhuǎn)染的MSC對小鼠實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎模型CD4+T淋巴細(xì)胞的增殖具有更明顯的抑制作用,在體則可明顯改善髓鞘化,減少脊髓白質(zhì)中淋巴細(xì)胞浸潤[23]。有報(bào)道在IFN-γ和腫瘤壞死因子α刺激下,MSC中糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)亮氨酸拉鏈蛋白轉(zhuǎn)移入核,促進(jìn)激活素A的表達(dá),最終通過激活Smad3/2及增強(qiáng)T淋巴細(xì)胞IL-10的生成抑制Th17的分化[24]。體外研究發(fā)現(xiàn)MSC可通過IL-10抑制Th17的分化,IL-10抗體或siRNA均可逆轉(zhuǎn)該現(xiàn)象,其機(jī)制可能涉及STAT5的磷酸化以及STAT3與Th17特異性轉(zhuǎn)錄因子RORγ啟動(dòng)子結(jié)合的減弱[25]。在雞卵清白蛋白構(gòu)建的小鼠哮喘模型中,尾靜脈給予脂肪MSC上調(diào)了肺組織中IL-10水平,促進(jìn)了Treg的分化,抑制了氣道炎癥及高反應(yīng)性[26]。

3.6其他因子 除了上述因子,半乳凝素TGF-β、PD-L1、血紅素加氧酶1等因子均被報(bào)道參與介導(dǎo)MSC的免疫調(diào)節(jié)作用,它們在免疫調(diào)節(jié)作用中的地位以及與其他因子之間的相互關(guān)聯(lián)仍需要更多的研究。

4 展望

總的來說,在各種動(dòng)物模型及體外實(shí)驗(yàn)中,多種因子被認(rèn)為參與了MSC介導(dǎo)的免疫調(diào)節(jié)作用,這可能取決于MSC來源與具體的作用微環(huán)境。而且多種因素可能在其中發(fā)揮協(xié)同作用。進(jìn)一步在特定的微環(huán)境中明確MSC發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用的分子機(jī)制及各個(gè)因子的地位,必將為MSC的臨床應(yīng)用提供更多的參考。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突