麻金金 葛蓓孛 施李鳴 劉炳花 韋秋合 張克誠(chéng)

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所 農(nóng)業(yè)部作物有害生物綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193）

植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑是人們根據(jù)植物激素的結(jié)構(gòu)、功能或作用原理通過(guò)化學(xué)合成或從生物中提取得到的一大類物質(zhì)［1］。在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上主要有提高產(chǎn)量、改善品質(zhì)、增強(qiáng)抗逆性以及延長(zhǎng)儲(chǔ)藏期和水果保鮮等作用。目前國(guó)內(nèi)登記的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑品種有40多種，產(chǎn)品多達(dá)960個(gè)（中國(guó)農(nóng)藥信息網(wǎng)，2017年12月）。植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的合理使用在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中發(fā)揮了重要的作用。徐長(zhǎng)寶［2］在進(jìn)行柿種子發(fā)芽實(shí)驗(yàn)時(shí)使用500 mg/L的赤霉素溶液處理種子，其發(fā)芽率提高了34.7%，發(fā)芽勢(shì)提高了27.8%，發(fā)芽期也提前了8 d；宋文［3］將葡萄砧木的基部放在適當(dāng)?shù)腘AA溶液中浸泡后進(jìn)行嫁接，使其成活率提高了10%-20%。然而Mao等［4］在植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的毒性實(shí)驗(yàn)中已經(jīng)證明2，4-D、NAA和BNOA等有機(jī)化合物具有一定毒性，這些化學(xué)物質(zhì)長(zhǎng)期積累在食物和環(huán)境中可能會(huì)造成急性或慢性中毒。據(jù)農(nóng)業(yè)部統(tǒng)計(jì)全國(guó)每年植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑使用量約3 000 t，其中在水果生產(chǎn)中使用廣泛，且用量較大［5］。但目前市場(chǎng)上絕大多數(shù)植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑是化學(xué)合成的，生物源的僅占2%-3%［6］，因此生物源植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的開(kāi)發(fā)對(duì)綠色、安全的生態(tài)農(nóng)業(yè)的發(fā)展十分重要。

鏈霉菌屬是一類重要的生防菌［7］，其次級(jí)代謝不僅能產(chǎn)生各種抗生素，而且能夠產(chǎn)生植物激素類物質(zhì)如生長(zhǎng)素、赤霉素等［8］，有研究報(bào)道大多數(shù)細(xì)菌在次級(jí)代謝過(guò)程中都能產(chǎn)生如生長(zhǎng)素、赤霉素、嗜鐵素等物質(zhì)來(lái)促進(jìn)植物的生長(zhǎng)［9］。本實(shí)驗(yàn)中的玫瑰黃鏈霉菌NKZ-259（Streptomyces roseoflavusstrain NKZ-259）是由實(shí)驗(yàn)室前期分離獲得，研究發(fā)現(xiàn)該菌株次級(jí)代謝能產(chǎn)生吲哚乙酸（Indole-3-acetic acid，IAA），其發(fā)酵液對(duì)辣椒、番茄和小麥等的生長(zhǎng)具有明顯的促進(jìn)作用［10］。IAA屬于植物生長(zhǎng)素類物質(zhì)，是植物生長(zhǎng)過(guò)程中分泌的調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)的信號(hào)物質(zhì)，能夠促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)、種子發(fā)芽和作物生根等［11］。尤桂春等［12］以500 mg/L的IAA溶液處理檸檬枝條，扦插50 d后其生根率達(dá)到90.8%，與對(duì)照相比增加了33.9%；王非等［13］使用20 mg/L的IAA處理齒葉鐵線蓮種子使其發(fā)芽率達(dá)到了93.4%，平均發(fā)芽時(shí)間縮短了3 d。Aminullah等［14］在研究IAA對(duì)大豆產(chǎn)量及品質(zhì)的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)：在大豆出苗后15 d施用10 mg/L 的IAA，豆子的產(chǎn)量比未噴施IAA增加了20%，豆子的品質(zhì)也達(dá)到最優(yōu)水平，此外IAA在誘導(dǎo)番茄單性結(jié)實(shí)、提高坐果率等方面也發(fā)揮了重要的作用。

目前關(guān)于玫瑰黃鏈霉菌的報(bào)道大多是農(nóng)用抗生素的挖掘及其防病機(jī)制研究［15］，也有關(guān)于芽孢桿菌等細(xì)菌產(chǎn)生促生類物質(zhì)如細(xì)胞分裂素、生長(zhǎng)素的報(bào)道，但大多是通過(guò)研制活菌制劑發(fā)揮微生物對(duì)作物生長(zhǎng)的作用，然而大田中活菌制劑的使用常易受活菌數(shù)及氣候環(huán)境等的影響，效果不穩(wěn)定。微生物源植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑是通過(guò)篩選某些在其次級(jí)代謝過(guò)程中能夠產(chǎn)生促生類物質(zhì)的微生物，通過(guò)發(fā)酵技術(shù)、分離純化技術(shù)等最終獲得較為純凈的物質(zhì)開(kāi)發(fā)成制劑用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，而目前對(duì)于微生物源植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑開(kāi)發(fā)的報(bào)道較為少見(jiàn)，因此我們期望通過(guò)分離提取該菌株代謝產(chǎn)生的IAA來(lái)開(kāi)發(fā)微生物源植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑。微生物次級(jí)代謝產(chǎn)物成分復(fù)雜且含量極低，因此開(kāi)發(fā)微生物源的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，次級(jí)代謝產(chǎn)物的含量的提高是關(guān)鍵的一步。本研究將通過(guò)對(duì)菌株的發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，進(jìn)一步提高菌株次級(jí)代謝產(chǎn)生IAA的含量，從而為后期IAA的分離純化及制劑開(kāi)發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 玫瑰黃鏈霉菌NKZ-259（Streptomyces roseoflavusstrain NKZ-259），由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所農(nóng)用抗生素組保存。

1.1.2 供試培養(yǎng)基 菌種培養(yǎng)采用MS培養(yǎng)基，配方參考葛蓓孛等［16］；種子培養(yǎng)基配方參考侯曉平等［17］；原始發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖10 g，蛋白胨4 g，酵母膏2 g，硫酸鎂0.5 g，磷酸二氫鉀2 g，無(wú)菌水定容至1 L。

1.2 方法

1.2.1 菌株發(fā)酵液制備 將保存的玫瑰黃鏈霉菌NKZ-259接種在MS培養(yǎng)基上于28℃、黑暗條件下培養(yǎng)7 d，用無(wú)菌牙簽劃下1 cm2大小的菌塊接種于種子培養(yǎng)基，28℃，200 r/min搖床震蕩培養(yǎng)48 h。取1%種子液接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，28℃，220 r/min搖床震蕩培養(yǎng)96 h，濾紙過(guò)濾后即得發(fā)酵液。

1.2.2 IAA的定性檢測(cè) 取1.2.1 制備的發(fā)酵液按體積比1∶1與salkowski比色液（50 mL 35%HCL+1 mL 0.5 mol/L）混合進(jìn)行顯色反應(yīng)，同時(shí)以50 g/mL IAA標(biāo)準(zhǔn)溶液做對(duì)照，放置于25℃、黑暗條件下靜置30 min，觀察顏色變化，顏色變?yōu)榉奂t色表示有IAA 產(chǎn)生［18-19］。

1.2.3 IAA的定量檢測(cè) IAA標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作參考吳翔等的方法［20］。取1.2.1 制備的發(fā)酵液2 mL與等體積salkowski比色液混合，以未接菌的發(fā)酵培養(yǎng)基與salkowski比色液等體積混合作為對(duì)照，室溫避光放置30 min，測(cè)定其OD530。通過(guò)IAA標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算發(fā)酵液中IAA的濃度。

1.2.4 IAA發(fā)酵培養(yǎng)基的單因子試驗(yàn) IAA發(fā)酵培養(yǎng)基最適碳源的篩選：分別以2% 葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、玉米粉和可溶性淀粉作為單一碳源代替礎(chǔ)培養(yǎng)基中的碳源；以2%葡萄糖作為速效碳源，分別添加2%蔗糖、麥芽糖、乳糖、玉米粉和1%可溶性淀粉作為復(fù)合碳源，搖床28℃、200 r/min發(fā)酵96 h后測(cè)定各發(fā)酵液中IAA濃度。

IAA發(fā)酵培養(yǎng)基最適氮源的篩選：由于原始培養(yǎng)基中有蛋白胨和酵母膏兩種有機(jī)氮源，缺少無(wú)機(jī)氮源，因此分別以2%黃豆面、牛肉膏、玉米粉代替基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的蛋白胨，再以0.4%的硫酸銨、氯化銨和硝酸鉀代替基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的酵母膏作為無(wú)機(jī)氮源，發(fā)酵條件及IAA測(cè)定方法同上。

IAA發(fā)酵培養(yǎng)基最適無(wú)機(jī)鹽的篩選：在原始培養(yǎng)基中分別添加0.04%氯化鈉、磷酸氫二鉀、氯化鎂和硫酸鋅作為無(wú)機(jī)鹽，發(fā)酵條件及IAA的測(cè)定方法同上。

1.2.5 培養(yǎng)基優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì) Plackett-Burman法篩選顯著影響因子 使用Minitab17軟件，選用n = 6的Plackett-Burman法對(duì)單因子試驗(yàn)確定的6個(gè)成分設(shè)計(jì)12次試驗(yàn)進(jìn)行考察，以X1、X2、X3、X4、X5、X6分別代表葡萄糖、淀粉、蛋白胨、硝酸鉀、磷酸氫二鉀和L-色氨酸，每個(gè)因素取高低兩個(gè)水平，分別以1和-1表示（表1），每組試驗(yàn)設(shè)計(jì)三組平行試驗(yàn)。

表1 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)中2因子水平列表

中心組合設(shè)計(jì)（Central composite design，CCD）優(yōu)化關(guān)鍵影響因子 對(duì)Plackett-Burman法設(shè)計(jì)篩選出的3個(gè)顯著影響因子，應(yīng)用Design-expert 7.0.6軟件設(shè)計(jì)3因素5水平，20次的試驗(yàn)（表2），每組實(shí)驗(yàn)3次重復(fù)，并進(jìn)行響應(yīng)面分析。

表2 中心組合設(shè)計(jì)各因子水平列表

2 結(jié)果

2.1 發(fā)酵液中IAA的檢測(cè)

通過(guò)salkowski比色實(shí)驗(yàn)，明確了玫瑰黃鏈霉菌NKZ-259次級(jí)代謝過(guò)程能夠產(chǎn)生IAA，以O(shè)D530為橫坐標(biāo)（x），IAA濃度為縱坐標(biāo)（y）制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性回歸方程y=38.971x+2.282 3，r=0.988 1，在所測(cè)濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中IAA的含量是11.64 g/mL。

2.2 IAA發(fā)酵培養(yǎng)基的單因子試驗(yàn)

試驗(yàn)分別以葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、玉米粉和可溶性淀粉作為單一碳源，發(fā)現(xiàn)NKZ-259菌株對(duì)可溶性淀粉的利用率最高，發(fā)酵產(chǎn)生IAA含量最高（圖1），以可溶性淀粉和葡萄糖組成復(fù)合碳源時(shí)，比單一碳源發(fā)酵產(chǎn)生的IAA含量更高（圖2），因此選用葡萄糖和可溶性淀粉作為培養(yǎng)基中的最佳碳源；氮源一般分為無(wú)機(jī)氮源和有機(jī)氮源，選用黃豆面、牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、玉米粉作為無(wú)機(jī)氮源，硫酸銨、氯化銨和硝酸鉀作為有機(jī)氮源進(jìn)行試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)當(dāng)NKZ-259菌株以蛋白胨為有機(jī)氮源、硝酸鉀為無(wú)機(jī)氮源時(shí)IAA的產(chǎn)量明顯增高（圖3），因此采用蛋白胨和硝酸鉀作為培養(yǎng)基中的最適氮源；無(wú)機(jī)鹽也是微生物生長(zhǎng)所不可缺少的成分，分別選用氯化鈉、磷酸氫二鉀、氯化鎂和硫酸鋅進(jìn)行試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：當(dāng)加入磷酸氫二鉀時(shí)，IAA的產(chǎn)量最高（圖4），最終選擇磷酸氫二鉀作為發(fā)酵培養(yǎng)基中的最適無(wú)機(jī)鹽。

圖1 不同單一碳源對(duì)發(fā)酵液中IAA含量的影響

圖2 不同復(fù)合碳源對(duì)發(fā)酵液中IAA含量的影響

圖3 不同氮源對(duì)發(fā)酵液中IAA含量的影響

圖4 不同無(wú)機(jī)鹽對(duì)發(fā)酵液中IAA含量的影響

圖5 標(biāo)準(zhǔn)化效應(yīng)Pareto圖（響應(yīng)為IAA含量，α＜0.05）

2.3 Plackett-Burman法篩選顯著影響因子

根據(jù)Plackett-Burman法設(shè)計(jì)六因素、兩水平表并配制培養(yǎng)基進(jìn)行試驗(yàn)，每組試驗(yàn)做3次重復(fù)，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析使用Mintab17軟件。以菌株發(fā)酵液中IAA的含量作為響 應(yīng)值，建立一次回歸方程：IAA含量 = 15.487+2.080X1-0.063X2-0.069X3+0.184X4+1.830 X5+5.839X6。

模型回歸決定系數(shù)R=98.83%，校正系數(shù)R（調(diào)整）=97.43%，表明真實(shí)值與預(yù)測(cè)值相關(guān)性極高，且回歸模型P=0.000＜0.05，差異達(dá)到極顯著水平，因此，該數(shù)學(xué)模型可用于評(píng)價(jià)本試驗(yàn)各因子對(duì)響應(yīng)值影響的顯著性［21］。表4中L-色氨酸、葡萄糖和磷酸氫二鉀（P＜0.05）均對(duì)預(yù)測(cè)響應(yīng)值均達(dá)到顯著水平（表3-4、圖5），且其對(duì)IAA含量均具有顯著正效應(yīng)，因此選用上述三個(gè)因素繼續(xù)優(yōu)化得到最大響應(yīng)值。

2.4 響應(yīng)面法優(yōu)化關(guān)鍵影響因素

應(yīng)用Design-expert7.0.6軟件對(duì)Plackett-Burman篩選出的3個(gè)重要影響因子，采用Central composite design設(shè)計(jì) 3因素，5水平（-1.682，-1，0，1，1.682），試驗(yàn)次數(shù)為20的試驗(yàn)（表5）。

運(yùn)用 Design-Expert 7.0.0 軟件對(duì) 20 組試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，得到擬合回歸方程：IAA =45.47+3.88 X6+1.71 X1+0.52 X5-0.32 X6X1-0.21 X6X5+0.092 X1X5-7.88 X62-5.82 X12-4.83 X52；經(jīng)方差分析該模型極顯著（P＜0.0001），模型回歸決定系數(shù)R-sq=99.82%，R-sq（Adj）=99.66%，說(shuō)明模型與實(shí)際擬合良好；模型失擬項(xiàng)P為 0.0694＞0.05，表明模型失擬項(xiàng)不顯著，因此模型選擇合適。表6中一次項(xiàng)（L-色氨酸、葡萄糖、磷酸氫二鉀）、二次項(xiàng)（X62、X12、X52）都極為顯著，三因子的交互項(xiàng)均不顯著，表明各因子對(duì)響應(yīng)值的影響不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系，而是二次關(guān)系［22］。由此表明該回歸方程可以用來(lái)解釋各因素和響應(yīng)值之間的真實(shí)關(guān)系，因此該模型可用來(lái)對(duì)菌株 NKZ-259產(chǎn)IAA的發(fā)酵培養(yǎng)基成分進(jìn)行分析預(yù)測(cè)。

為了進(jìn)一步了解這3個(gè)因素之間的交互作用，通過(guò)Design-Expert 7.0.0 軟件繪制響應(yīng)面圖和等高線圖，等高線的形狀可反映出兩因素之間交互作用的大小，橢圓形表示兩因素的交互作用明顯，圓形表示兩因素之間的交互作用不顯著［23］。由圖6-8進(jìn)一步看出：L-色氨酸、葡萄糖和磷酸氫二鉀這三個(gè)因素，兩兩之間交互作用均不明顯。根據(jù)響應(yīng)面模型預(yù)測(cè)的發(fā)酵培養(yǎng)基中主要成分含量為：L-色氨酸2.24 g/L，葡萄糖20.7 g/L，磷酸氫二鉀0.5 g/L，模型預(yù)測(cè)的IAA含量為46.060 7 μg/mL。

表3 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

表4 Plackett-Burman試驗(yàn)結(jié)果分析

3 討論

利用微生物生產(chǎn)各種有用代謝物的一個(gè)重要方法就是微生物發(fā)酵，因此發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化尤為重要［24］。響應(yīng)面法（Response surface methodology，RSM）是近年來(lái)菌株培養(yǎng)基優(yōu)化的最優(yōu)方法之一，它通過(guò)采用多元二次回歸方程來(lái)擬合各因素與響應(yīng)值間的函數(shù)關(guān)系，并最終尋求最優(yōu)的工藝參數(shù)［25］。與正交實(shí)驗(yàn)相比，響應(yīng)面法是通過(guò)建立曲面模型來(lái)檢驗(yàn)各因素及其交互作用對(duì)響應(yīng)值的影響，可連續(xù)的對(duì)試驗(yàn)各個(gè)水平進(jìn)行分析，而且可顯著減少實(shí)驗(yàn)次數(shù)、縮短試驗(yàn)周期，目前已廣泛應(yīng)用于化學(xué)、生物工程、食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域。Li等［26］運(yùn)用響應(yīng)面法對(duì)乳酸乳球菌ATCC 11454發(fā)酵產(chǎn)細(xì)菌素的培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，使該菌株發(fā)酵產(chǎn)生的細(xì)菌素產(chǎn)量增加了一倍；韓興［27］通過(guò)PB設(shè)計(jì)及響應(yīng)面分析優(yōu)化玫瑰黃鏈霉菌Men-myco-93-63發(fā)酵培養(yǎng)基使抗生素產(chǎn)量提高了1.63倍。

IAA作為一種信號(hào)分子通過(guò)調(diào)控植物細(xì)胞分裂、器官發(fā)育及相關(guān)基因的表達(dá)來(lái)調(diào)控植物的生長(zhǎng)，對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育十分重要［28］，然而植物組織中產(chǎn)生激素類物質(zhì)的含量十分有限。雖然目前已經(jīng)能夠通過(guò)化學(xué)方法合成并大量生產(chǎn)激素類物質(zhì)如IAA等，但化學(xué)合成的物質(zhì)對(duì)環(huán)境和人類健康有著巨大的威脅。從微生物次級(jí)代謝物中分離提取的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)類物質(zhì)來(lái)源于自然環(huán)境，能顯著降低環(huán)境中的農(nóng)藥殘留及化學(xué)物質(zhì)對(duì)人類健康帶來(lái)的威脅，因此微生物源植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的開(kāi)發(fā)研究十分重要。目前已報(bào)道劉偉等［29］通過(guò)對(duì)地衣芽孢桿菌發(fā)酵培養(yǎng)條件的優(yōu)化來(lái)提高細(xì)胞分裂素的產(chǎn)量，并對(duì)其分離純化條件進(jìn)行了研究。本研究后期將在IAA含量提高的基礎(chǔ)上對(duì)其進(jìn)行分離純化，致力于以NKZ-259為出發(fā)菌株，探索微生物源植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的生產(chǎn)工藝，并最終開(kāi)發(fā)出綠色、高效的微生物源植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑。

表5 中心組合設(shè)計(jì)及試驗(yàn)結(jié)果

圖6 L-色氨酸和葡萄糖兩因素的響應(yīng)面圖和等高線圖

表6 中心組合設(shè)計(jì)回歸分析結(jié)果

圖7 L-色氨酸和磷酸氫二鉀兩因素的響應(yīng)面圖和等高線圖 圖8 葡萄糖和磷酸氫二鉀兩因素的響應(yīng)面圖和等高線圖

4 結(jié)論

本研究通過(guò)單因子試驗(yàn)明確了菌株NKZ-259發(fā)酵培養(yǎng)基中的最適碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽；應(yīng)用Plackett-Burman法篩選出了培養(yǎng)基中對(duì)菌株發(fā)酵產(chǎn)生IAA的顯著影響因子，然后通過(guò)中心組合設(shè)計(jì)（Central composite design）對(duì)Plackett-Burman篩選出的三個(gè)影響因子進(jìn)行優(yōu)化并通過(guò)響應(yīng)面法進(jìn)行分析，最終得到菌株發(fā)酵產(chǎn)生IAA的最優(yōu)培養(yǎng)基為：L-色氨酸2.24 g/L，葡萄糖20.7 g/L，磷酸氫二鉀0.5 g/L，可溶性淀粉10 g/L，蛋白胨3 g/L，硝酸鉀4.5 g/L。使用優(yōu)化后的培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵，3次發(fā)酵產(chǎn)生IAA的含量分別為45.656 0、45.023 1和45.453 2 μg/mL，平均值為45.377 4 μg/mL，與原始發(fā)酵培養(yǎng)基相比菌株產(chǎn)生IAA的含量提高了3倍。