李玲 白娟娟 郭梅 王思禹 王曉玥

（天津農(nóng)學(xué)院食品科學(xué)與生物工程學(xué)院，天津 300384）

果實(shí)的成熟過(guò)程在分子水平上是由許多轉(zhuǎn)錄因子單獨(dú)或協(xié)同調(diào)控特定的下游基因來(lái)完成的［1］，其中一類轉(zhuǎn)錄因子就是SBP box 家族。SBP box 轉(zhuǎn)錄因子參與了植物發(fā)育的相轉(zhuǎn)變、花器官建成、果實(shí)成熟，激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和銅的體內(nèi)平衡等［2-10］。CNR 是SBP box 轉(zhuǎn)錄因子家族成員之一，其功能和作用研究甚少。

番茄突變體cnr（Colourless non-ripening）的果實(shí)不能成熟，類胡蘿卜素合成減少，果皮為黃色，不會(huì)變軟，且與成熟相關(guān)酶的相應(yīng)基因的表達(dá)受到影響［11-12］。cnr突變體的多聚半乳糖醛酸酶、果膠酯酶的含量和活性都比同時(shí)期野生型果實(shí)的低［13］。Manning 等［14］利用定點(diǎn)克隆發(fā)現(xiàn) LeSPL-CNR基因位于第2條染色體長(zhǎng)臂上，屬于SPL 基因家族，編碼SQUAMOSA promoter binding protein（SBP box）蛋白。在野生型AC和突變體cnr中LeSPL-CNR核酸序列沒(méi)有差異，只是在突變體cnr中LeSPL-CNR啟動(dòng)子上游有一段286 bp 序列的胞嘧啶甲基化程度特別高，即DNA甲基化的改變，引起cnr突變體番茄果實(shí)不能正常成熟。在野生型果實(shí)中沉默LeSPLCNR，發(fā)現(xiàn)果實(shí)出現(xiàn)類似于cnr突變體的表型，說(shuō)明LeSPL-CNR在番茄果實(shí)成熟過(guò)程中起重要作用。這不僅開(kāi)創(chuàng)了SBP box 轉(zhuǎn)錄因子在果實(shí)成熟過(guò)程中的研究，而且對(duì)農(nóng)業(yè)的發(fā)展有重要意義。

蛋白水平是轉(zhuǎn)錄因子CNR發(fā)揮作用的水平，所以需要在蛋白水平上研究轉(zhuǎn)錄因子CNR，深入認(rèn)識(shí)其功能。轉(zhuǎn)錄因子CNR在蛋白水平上的系統(tǒng)研究還很少，2018年，有研究證明LeSPL-CNR抑制番茄果實(shí)SlNR啟動(dòng)子的活性，與SlNR啟動(dòng)子序列結(jié)合［15］。但是到目前為止，CNR調(diào)控番茄果實(shí)成熟的機(jī)制和路徑尚不清楚。因此，為了在蛋白水平上研究轉(zhuǎn)錄因子CNR，本研究首先構(gòu)建CNR蛋白的原核表達(dá)載體，然后將原核表達(dá)出來(lái)的CNR蛋白進(jìn)行純化，并制備多克隆抗體，最后研究轉(zhuǎn)錄因子CNR在番茄果實(shí)不同成熟時(shí)期的表達(dá)模式，以期為進(jìn)一步深入研究CNR調(diào)控番茄果實(shí)成熟的機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

番 茄（Lycopersicon esculentumMill. cv. Ailsa Craig）種植于天津農(nóng)學(xué)院的大棚，統(tǒng)一精細(xì)管理，花期掛牌，采摘不同時(shí)期的番茄果實(shí)，并選取大小一致，無(wú)病害和蟲(chóng)害、無(wú)機(jī)械損傷的果實(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

大腸桿菌（Escherichia coli）Rosetta和原核表達(dá)載體pET-30a，均購(gòu)自Novagen公司。

1.2 方法

1.2.1 構(gòu)建pET-CNR原核表達(dá)載體 用TRIzol 法提取番茄果實(shí)總RNA［16］，以此為模板進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。根據(jù)番茄CNR基因的mRNA序列（NM_001319308.1）設(shè)計(jì)一對(duì)引物，并且引入EcoRI和XhoI酶切位點(diǎn)（表1）。

表1 擴(kuò)增CNR基因的引物

以反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，建立25 μL反應(yīng)體系，進(jìn)行目的基因的PCR擴(kuò)增。在冰上依次加入 17.5 μL 雙蒸水，2.5 μL 10×Buffer，1 μL 超純dNTPs，各 1 μL 正向和反向引物（10 μmol/L），1 μLTaqDNA Polymerase（2 U/μL），1 μL cDNA 模板。瞬時(shí)離心混勻，進(jìn)行PCR反應(yīng)。反應(yīng)程序?yàn)?5℃預(yù)變性5 min，95℃變性30 s，57℃退火45 s，72℃延伸60 s，72℃最后延伸 10 min，共進(jìn)行35次循環(huán)。將擴(kuò)增出的CNR基因進(jìn)行純化，并與pET-30a都用EcoR I和XhoI切成雙粘性末端，16℃連接4 h，然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rosetta。通過(guò)Kan抗性培養(yǎng)基篩選，挑取單個(gè)陽(yáng)性菌落培養(yǎng)并提取質(zhì)粒，最后通過(guò)雙酶切鑒定CNR基因的插入情況，同時(shí)進(jìn)行測(cè)序。

1.2.2 CNR蛋白的原核表達(dá) 挑含有重組質(zhì)粒pETCNR的Rosetta單菌落，接種至LB液體培養(yǎng)基（含有100 μg/mL Kan）中過(guò)夜培養(yǎng)，具體按照王賀等［17］的方法進(jìn)行操作。第2天按1%的接種量進(jìn)行擴(kuò)培，直到OD600在0.5-0.7之間，加入終濃度分別為0.1、0.4、0.8和1.0 mmol/L 的IPTG，37℃培養(yǎng)3 h。4℃，10 000 g離心10 min，收集菌體。每克菌體加4 mL細(xì)胞裂解液（含1 mg/mL溶菌酶），重懸細(xì)胞。混勻后置于冰上，搖20 min。保持在冰上，超聲波破碎（功率400 W，每次工作9 s，間隔9 s，共25 次），4℃10 000 g 離心10 min，分開(kāi)上清與沉淀，并進(jìn)行蛋白電泳檢測(cè)［18］。

1.2.3 CNR蛋白的純化

1.2.3.1 純化前準(zhǔn)備 配置結(jié)合緩沖液（含20 mmol/L磷酸鈉，20 mmol/L咪唑，500 mmol/L NaCl），漂洗緩沖液（含50 mmol/L咪唑，磷酸鈉和NaCl的濃度不變），洗脫緩沖液I-Ⅴ（分別含100、200、300、400和500 mmol/L咪唑，磷酸鈉和NaCl的濃度不變）。將所有緩沖液的pH 調(diào)為7.4，且全部用0.22 μm濾膜過(guò)濾。取經(jīng)過(guò)超聲波破碎、離心后的菌體上清溶液，經(jīng)0.22 μm濾膜過(guò)濾后，作為蛋白粗品備用。排盡蛋白純化儀內(nèi)的氣泡，并進(jìn)行泵清洗。

1.2.3.2 純化過(guò)程 將親和層析柱Ni Sepharose 6 Fast Flow接入蛋白純化儀，按照程序清洗柱子。將流速調(diào)至0.5 mL/min，設(shè)置收集體積為0，load狀態(tài)，將待純化的蛋白粗品吸入注射器，并通過(guò)上樣環(huán)上樣。等樣品全部進(jìn)入親和層析柱后拆下柱子，放入4℃冰箱，豎立靜置1 h，以保證蛋白粗品與柱子充分結(jié)合。然后將柱子重新接回純化儀，用漂洗緩沖液進(jìn)行漂洗，流速1 mL/min，直至洗回基線。依次用洗脫緩沖液I-V進(jìn)行洗脫，流速0.5 mL/min，收集體積設(shè)置為200 μL/管，直至洗脫峰出現(xiàn)，待洗脫峰洗平后繼續(xù)收集2個(gè)柱體積，完成純化。

將收集的蛋白溶液進(jìn)行SDS-PAGE，選取含有單一條帶的蛋白用BCA試劑盒測(cè)定濃度，將濃度≥1.0 μg/μL的蛋白溶液進(jìn)行混合，用于抗體的制備。

1.2.4 CNR蛋白多克隆抗體的制備 取純化后的100 μg CNR蛋白作為抗原免疫小鼠，制備多克隆抗體［16］。免疫間隔期為14 d，在最后一次免疫后第10天采集小鼠血清。4℃下靜置過(guò)夜，5 000g 離心10 min，取上清液待測(cè)。

1.2.5 CNR蛋白多克隆抗體的純化、效價(jià)及特異性的測(cè)定 參考李玲［16］的方法對(duì)CNR蛋白多克隆抗體進(jìn)行純化，用ELISA法檢測(cè)抗體效價(jià)，并用蛋白印跡的方法測(cè)定抗體的特異性［18］。

1.2.6 番茄轉(zhuǎn)錄因子CNR的表達(dá)模式 參考朱鴻亮［19］的方法提取番茄果實(shí)不同成熟時(shí)期的總蛋白，用蛋白印跡的方法研究CNR的表達(dá)模式。

2 結(jié)果

2.1 pET-CNR原核表達(dá)載體的構(gòu)建

采用TRIzol法提取番茄果實(shí)總RNA。由圖1可以看出，提取的番茄總RNA完整性特別好，沒(méi)有降解，也未受到DNA的污染，能夠作為下一步理想的反轉(zhuǎn)錄模板。通過(guò)反轉(zhuǎn)錄PCR得到CNR基因片段（圖2），此片段的大小與實(shí)驗(yàn)預(yù)期結(jié)果大小相符。將CNR基因片段與pET-30a進(jìn)行雙酶切，經(jīng)連接酶作用，構(gòu)建原核表達(dá)載體pET-CNR，最后轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細(xì)胞Rosetta中。

圖1 番茄果實(shí)總RNA的電泳圖

圖2 CNR基因的PCR擴(kuò)增

2.2 pET-CNR原核表達(dá)載體的鑒定

提取重組質(zhì)粒pET-CNR，進(jìn)行雙酶切鑒定，得到大小420 bp的片段（圖3），該條帶的大小與CNR基因大小相符。同時(shí)進(jìn)行測(cè)序分析，結(jié)果（圖4）顯示重組載體pET-CNR具有正確的讀碼框，沒(méi)有錯(cuò)配且序列與已發(fā)表序列完全一致，證明pET-CNR重組載體構(gòu)建成功。

圖3 pET-CNR原核表達(dá)載體的酶切驗(yàn)證

2.3 CNR蛋白的小量表達(dá)

挑陽(yáng)性單克隆轉(zhuǎn)至LB液體培養(yǎng)基中過(guò)夜培養(yǎng)，第2天進(jìn)行擴(kuò)培。當(dāng)OD600為0.5-0.7時(shí)，加入IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，離心去上清，沉淀（菌體）用冰浴超聲波破碎，之后對(duì)蛋白進(jìn)行定量，用15%的SDSPAGE分析結(jié)果。如圖5所示，沒(méi)有加IPTG誘導(dǎo)劑的菌液在27 kD處沒(méi)有蛋白表達(dá)，而加入IPTG誘導(dǎo)劑的菌液在27 kD處有蛋白表達(dá)，且分子量與實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)表達(dá)的CNR蛋白分子量相符。說(shuō)明pET-CNR重組載體能夠表達(dá)CNR蛋白。

圖4 pET-CNR重組質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果序列對(duì)比

2.4 IPTG誘導(dǎo)濃度的優(yōu)化和CNR蛋白的大量表達(dá)

加入不同濃度的IPTG 誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，37℃、3 h后分別收集菌體，超聲波裂解后，保留上清和沉淀。如圖6所示，菌體裂解液的上清中分子量為27 kD 的蛋白有明顯的表達(dá)，而在沉淀中無(wú)此蛋白表達(dá)，說(shuō)明CNR蛋白在菌體裂解液的上清中表達(dá)。當(dāng)加入1.0 mmol/L IPTG誘導(dǎo)劑時(shí)，CNR蛋白的表達(dá)量最大（圖6，泳道4），表明誘導(dǎo)劑IPTG的最適宜濃度為1.0 mmol/L。

圖5 CNR蛋白的小量誘導(dǎo)表達(dá)

圖6 不同濃度IPTG誘導(dǎo)CNR蛋白表達(dá)的結(jié)果

2.5 CNR蛋白的純化

經(jīng)1.0 mmol/L 的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后收集的菌體用PBS溶液（含溶菌酶）進(jìn)行重懸，超聲波裂解菌體，將上清液加入親和層析柱中進(jìn)行純化，結(jié)果如圖7所示。上清上柱后，蛋白全部與親和柱結(jié)合，在流出液中沒(méi)有27 kD 的蛋白，說(shuō)明CNR蛋白與Ni柱結(jié)合牢靠（圖7，泳道2）。當(dāng)加入漂洗緩沖液和洗脫緩沖液Ⅰ-Ⅳ 時(shí)，蛋白仍然沒(méi)有被洗脫下來(lái)（圖7，泳道 3-7）。

再用咪唑濃度為500 mmol/L的洗脫緩沖液Ⅴ對(duì)樣品進(jìn)行洗脫并收集洗脫液，每管收集200 μL。此時(shí)蛋白開(kāi)始被洗脫下來(lái)，并且隨著洗脫的進(jìn)行，雜蛋白含量開(kāi)始逐漸減少（圖8-A）。大量的雜蛋白已經(jīng)被洗去，CNR蛋白條帶開(kāi)始變得單一（圖8-B）。繼續(xù)洗脫，雜蛋白被完全洗脫掉，最后收集到純度很高的CNR蛋白（圖8-C）。選取只含有CNR蛋白單一條帶的收集液，通過(guò)BCA法測(cè)定蛋白含量，將蛋白含量≥1.0 μg/μL的收集液合并，作為制備多克隆抗體的抗原。

圖7 帶有His標(biāo)簽的CNR蛋白的親和純化（一）

圖8 帶有His標(biāo)簽的CNR蛋白的親和純化（二）

2.6 CNR蛋白多克隆抗體的純化

第4次CNR蛋白免疫后第10天，取小鼠全血大約1 mL，全血置4℃冰箱過(guò)夜。用DEAESepharose FF 離子交換柱對(duì)血清進(jìn)行純化。從圖9可知，管號(hào)為4-12的管中抗體含量較高，所以合并4-12管中的洗脫液，為純化后的抗體。

圖9 CNR蛋白抗體的純化洗脫過(guò)程

2.7 抗體效價(jià)及特異性的測(cè)定

用ELISA法檢測(cè)抗體效價(jià)，從圖10-A中可以看出，在抗原是100 ng的條件下，OD450為0.5時(shí)，CNR抗體的稀釋倍數(shù)為320 000，所以本實(shí)驗(yàn)制得的CNR蛋白多克隆抗體的效價(jià)為320 000。純化的CNR蛋白與免疫小鼠獲得的抗體在分子量27 kD附近發(fā)生特異性反應(yīng)（圖10-B），表明制得的CNR多克隆抗體具有良好的特異性。

2.8 番茄CNR蛋白的表達(dá)模式

分別提取未熟期、綠熟期、破色期、粉紅期、紅熟期番茄果實(shí)總蛋白，在上樣量均為20 μg的情況下進(jìn)行CNR蛋白免疫印跡分析。從圖11中可以看出，在分子量27 kD附近出現(xiàn)條帶單一的印跡，這與CNR蛋白的分子量相符。CNR蛋白在番茄果實(shí)的破色期表達(dá)量最高，而在紅熟期幾乎沒(méi)有表達(dá)。這說(shuō)明CNR蛋白的積累與番茄果實(shí)的發(fā)育和成熟關(guān)系密切。

3 討論

圖10 CNR蛋白抗體效價(jià)和免疫特異性分析

圖11 番茄果實(shí)成熟過(guò)程中CNR蛋白的表達(dá)模式

為了在蛋白水平上研究CNR轉(zhuǎn)錄因子，必需獲得純度高的CNR蛋白和特異性好的CNR蛋白抗體，所以本研究構(gòu)建了pET-CNR原核表達(dá)載體。其中IPTG誘導(dǎo)劑的終濃度是原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)外源蛋白的重要影響因素［20-21］。因此，對(duì)誘導(dǎo)劑IPTG的濃度進(jìn)行優(yōu)化，得出加入1.0 mmol/L IPTG，CNR蛋白的表達(dá)量最高。有研究發(fā)現(xiàn)如果抗原中存在雜蛋白會(huì)激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生其他抗體，所以要制備效價(jià)高、特異性好的多克隆抗體，必需得到純度很高的免疫原［22］。而純化是獲得高純度蛋白免疫原的關(guān)鍵步驟，一般將目的蛋白的純化分為包涵體蛋白的純化和可溶性蛋白的純化［22-23］，可通過(guò)親和層析法對(duì)可溶性蛋白進(jìn)行純化［24-25］。本研究的CNR蛋白在菌體上清液中表達(dá)，是可溶性蛋白，所以用Ni Sepharose 6 Fast Flow采用親和層析法進(jìn)行純化，純化結(jié)果很好。

CNR 是SBP box 轉(zhuǎn)錄因子家族中成員之一，SBP box轉(zhuǎn)錄因子參與了植物發(fā)育的許多方面，包括相轉(zhuǎn)變、花器官的建成、果實(shí)成熟，植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和銅的體內(nèi)平衡等［26］，但是目前關(guān)于轉(zhuǎn)錄因子CNR的研究較少。有研究發(fā)現(xiàn)SlymiR157靶向作用于LeSPL-CNR可能影響轉(zhuǎn)錄因子LeMADS-RIN、LeHB1等基因的表達(dá)［27］。轉(zhuǎn)錄因子RIN靶位點(diǎn)的作用依賴于轉(zhuǎn)錄因子CNR基因位點(diǎn)上一個(gè)正常功能的等位基因，但是二者的關(guān)系不明確［28］。全基因組甲基化測(cè)序（Whole geonme bisulfite sequencing，WGBS）與病毒誘導(dǎo)基因沉默（Virus-induced gene silencing，VIGS）技術(shù)結(jié)合可以用來(lái)識(shí)別導(dǎo)致cnr突變體果實(shí)無(wú)色和未成熟表型的基因［29］。本實(shí)驗(yàn)在蛋白水平上研究了轉(zhuǎn)錄因子CNR在番茄果實(shí)發(fā)育和成熟過(guò)程中的表達(dá)模式。CNR蛋白在番茄果實(shí)的破色期表達(dá)量最高，說(shuō)明轉(zhuǎn)錄因子CNR在番茄果實(shí)的破色期發(fā)揮了重要作用。但是，CNR蛋白在番茄果實(shí)的未熟期也有表達(dá)，表明轉(zhuǎn)錄因子CNR在番茄果實(shí)的未熟期也有一定的作用。查閱大量資料未發(fā)現(xiàn)其他研究者對(duì)此現(xiàn)象的分析，所以CNR蛋白與番茄果實(shí)發(fā)育和成熟之間的關(guān)系還有待于進(jìn)一步的研究，這也是下一步工作的重點(diǎn)。

4 結(jié)論

本研究首次成功構(gòu)建了pET-CNR原核表達(dá)載體，確定IPTG的最佳誘導(dǎo)濃度為1.0 mmol/L，并純化出純度很高的CNR蛋白，制得了CNR蛋白的多克隆抗體，該抗體效價(jià)高、特異性好。CNR蛋白在番茄果實(shí)發(fā)育的破色期表達(dá)量最高，說(shuō)明轉(zhuǎn)錄因子CNR在此時(shí)發(fā)揮了重要作用，但是其調(diào)控番茄果實(shí)發(fā)育和成熟的具體作用機(jī)制還有待于深入研究。