張紅剛，郭明慧，郭 尚，張 程，郭霄飛，張 勇，劉 晶

（山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所，山西太原030031）

白靈菇（Pleurotus nebrodensis）是白靈側(cè)耳的商品名稱，又名白阿魏側(cè)耳、白阿魏蘑、白靈芝菇等，屬擔(dān)子菌門（Basidiomycota）傘菌綱（Agaricomycetes） 傘菌目 （Agaricales）側(cè)耳科（Pleurotaceae）側(cè)耳屬（Pleurotus）[1]。它主要野生于我國(guó)新疆一帶傘形科大型草本植物刺芹、阿魏等植株上[2]。其菇肉質(zhì)細(xì)嫩，味美可口，被譽(yù)為“草原上的牛肝菌”，同時(shí)該菇具有很高的藥用價(jià)值，可以調(diào)節(jié)人體生理平衡，增強(qiáng)人體免疫功能。白靈菇屬于珍稀食用菌，是我國(guó)具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的少數(shù)菇種之一，經(jīng)濟(jì)價(jià)值較高。

目前白靈菇在栽培過程中存在諸多問題：現(xiàn)蕾不均勻、現(xiàn)蕾率低，具體表現(xiàn)在生產(chǎn)中菌棒要么現(xiàn)蕾多但成活率低，要么現(xiàn)蕾極少，不出菇，不易控制；與其他菇種相比，其菌絲長(zhǎng)滿菌袋后仍需60 d以上的后熟期，且必須低溫3～8℃催蕾，生產(chǎn)中經(jīng)常因技術(shù)水平要求太高而導(dǎo)致失敗，從而制約了它的產(chǎn)業(yè)化發(fā)展。研究解決白靈菇生產(chǎn)中存在的這些問題，對(duì)于白靈菇產(chǎn)業(yè)來說迫在眉睫。

生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑在很多農(nóng)作物上得到應(yīng)用。研究表明，其能夠有效改善作物品質(zhì)，使產(chǎn)量提高，并且有改善收獲和貯存條件等作用，使用后可取得顯著的經(jīng)濟(jì)效益[3]。近年來，關(guān)于生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)在食用菌上的應(yīng)用逐漸增多，特別是國(guó)外已經(jīng)將生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)的使用作為食用菌產(chǎn)量及品質(zhì)提升的關(guān)鍵因素，并且已經(jīng)商業(yè)化，但關(guān)于生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)對(duì)白靈菇生長(zhǎng)發(fā)育及酶活性的影響研究較少。白靈菇生長(zhǎng)發(fā)育主要依靠自身不斷分泌各種胞外酶來分解、吸收培養(yǎng)基中的碳氮營(yíng)養(yǎng)[4]。胞外酶的活性同培養(yǎng)基質(zhì)中纖維素的降解速度和食用菌子實(shí)體產(chǎn)量有關(guān)[5]。葉敘豐等[6]研究發(fā)現(xiàn)，在香菇栽培出菇階段噴施三十烷醇，可適當(dāng)增產(chǎn)并提高子實(shí)體內(nèi)總氨基酸態(tài)氮的含量。尹紅芳[7]研究表明，赤霉素、三十烷醇對(duì)毛木耳的菌絲生長(zhǎng)具有一定的促進(jìn)作用。張慧鋒[8]研究發(fā)現(xiàn)，在蛹蟲草培養(yǎng)基中適量添加植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)，能夠提高蛹蟲草的多糖含量，促進(jìn)子實(shí)體生長(zhǎng)。這些研究均表明，生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)應(yīng)用于食用菌生產(chǎn)，能夠誘導(dǎo)細(xì)胞的分裂和伸長(zhǎng)，激活并提高多種酶的活性，加快機(jī)體的代謝活動(dòng)，同時(shí)增強(qiáng)菌絲生長(zhǎng)過程中對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收和利用，從而加速菌絲的生長(zhǎng)，促進(jìn)菌絲體扭結(jié)現(xiàn)蕾，進(jìn)而使子實(shí)體快速生長(zhǎng)，并且使用后子實(shí)體具有個(gè)頭大、品質(zhì)優(yōu)且外觀商品性好等特點(diǎn)[9-13]。而生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)的這些功效，正是解決白靈菇生產(chǎn)中存在的上述問題的關(guān)鍵所在。

本試驗(yàn)通過研究多種生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)對(duì)白靈菇生長(zhǎng)發(fā)育及胞外酶活性的影響，進(jìn)而為下一步解決白靈菇現(xiàn)蕾不均勻、現(xiàn)蕾率低、后熟期太長(zhǎng)、需要低溫促熟等生產(chǎn)實(shí)際問題提供解決途徑。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 菌株 供試菌株編號(hào)為BL-2，由山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所保藏。

1.1.2 試劑與儀器 三十烷醇、蕓苔素內(nèi)酯、3-吲哚乙酸、6-芐氨基嘌呤、赤霉素、萘乙酸，購(gòu)自廣州林國(guó)化肥有限公司；3，5-二硝基水楊酸（DNS），購(gòu)自上海生工生物技術(shù)有限公司。水浴鍋（恒溫）（50±1）℃，電熱干燥箱（80±1）℃，TU-1810PC 型紫外可見分光光度儀，均購(gòu)自北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。

1.1.3 培養(yǎng)基配方 培養(yǎng)基配方：蛋白胨2 g，葡萄糖 20 g，MgSO40.5 g，KH2PO41 g，酵母浸膏 4 g，瓊脂15 g，VB110 mg，水 1 000 mL，pH 值自然。

栽培袋配方：木屑55%，棉籽皮20%，玉米芯10%，麩皮10%，玉米粉3%，石灰1%，石膏1%。料∶水＝1∶（1.1～1.2）。

在高溫（121℃）、高壓（110 kPa）下滅菌。

1.2 菌袋制作管理及不同生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)處理方法

1.2.1 栽培管理 菌袋每袋裝干料250 g，含水量調(diào)至65%，攪拌均勻后，裝至17 cm×33 cm×0.05 cm聚丙烯塑料袋內(nèi)，碼入滅菌鍋，溫度調(diào)至121℃，高壓滅菌2.5 h，冷卻至室溫，超凈工作臺(tái)無(wú)菌操作接種。接種完成后，將栽培袋置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，溫度設(shè)置為（25±1）℃。栽培袋菌絲長(zhǎng)滿時(shí)移入培養(yǎng)室，在（22±1）℃條件下進(jìn)行后熟管理。

后熟培養(yǎng)30 d，進(jìn)行搔菌，隨后繼續(xù)培養(yǎng)5 d，再移入可控溫出菇房，按照試驗(yàn)設(shè)計(jì)，部分進(jìn)行溫差刺激催蕾，溫度控制在4～15℃，空氣相對(duì)濕度90%～95%。出菇期溫度控制在（14±2）℃，CO2濃度≤1 000 mg/L，空氣相對(duì)濕度90%～95%。在催蕾和出菇期間，晝夜光照交替[14]。

1.2.2 生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)配制及噴施方法 其配制方法列于表1。在滅好菌的培養(yǎng)袋接種口處噴施不同濃度的已滅菌（用針筒式微孔濾膜過濾器）生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)1 mL，然后接種，接種等量的原種，設(shè)5個(gè)重復(fù)，然后常規(guī)栽培培養(yǎng)，觀察各生長(zhǎng)階段情況，隨后在催蕾期往接種面上噴施1 mL不同種類的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)，進(jìn)行現(xiàn)蕾期觀察。

表1 生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)配制

1.2.3 取樣方法 接種后第 10，20，35，45，55，65，70，75，85，95，105，115 天進(jìn)行取樣，基本為每隔 10 d取樣一次，取樣部位為菌袋的接種點(diǎn)向下2 cm處、中部和距底部2 cm處，每個(gè)部位3次重復(fù)，每次取樣將單個(gè)重復(fù)的3個(gè)部位的樣品混勻待用。

1.3 測(cè)定項(xiàng)目及方法

1.3.1 生理特性的測(cè)定 每個(gè)處理隨機(jī)抽取5個(gè)菌袋，接種10 d后，在菌袋外側(cè)劃線，之后每隔5 d劃線1次，劃第3次后計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)，并計(jì)算菌絲的平均生長(zhǎng)速度[15]。

現(xiàn)蕾天數(shù)按噴施不同生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)后出現(xiàn)第一個(gè)菇蕾的時(shí)間記錄。

1.3.2 粗酶液制備和酶活性的測(cè)定 從每個(gè)處理中隨機(jī)抽取3個(gè)菌袋，將取出的培養(yǎng)料混勻，加5倍蒸餾水，室溫下浸提1 h，過濾去渣，上清液即為酶提取液，測(cè)定羧甲基纖維素酶活性和半纖維素酶活性。

1.3.2.1 纖維素酶（CMC）活性測(cè)定 取3支15 mL刻度試管分別加入0.2mL酶液，再分別吸取1.8 mL CMC溶液，50℃水浴保溫30 min，空白樣用0.2 mL酶液，加入1.8 mL醋酸緩沖液，同樣50℃水浴30 min，再吸取DNS 2 mL搖勻后，具塞，沸水浴反應(yīng)10 min，冷卻后，補(bǔ)加水至15 mL，輕輕上下?lián)u勻，用空白調(diào)零點(diǎn)，于550 nm下測(cè)OD值[16-19]。

1.3.2.2 半纖維素酶（HC）活性測(cè)定 15 mL刻度試管中加入酶液0.2 mL，再各吸取1.8 mL1%的木聚糖溶液，搖勻，50℃水溶60 min，取出后，再吸取2 mLDNS試劑搖勻，具塞，立即沸水浴反應(yīng)10 min，冷卻后，補(bǔ)加水定容到15 mL，輕輕上下?lián)u勻，空白用0.2 mL酶液、1.8 mL醋酸緩沖液，不加木聚糖溶液，同樣依上述步驟，用空白調(diào)零點(diǎn)，于550 nm下測(cè) OD 值[16-19]。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 22.0對(duì)不同處理的菌絲生長(zhǎng)速度、出菇率、酶活性等指標(biāo)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)對(duì)白靈菇生理特性的影響

由表2可知，7種生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)對(duì)白靈菇菌生理特性均產(chǎn)生影響。在菌絲生長(zhǎng)速度方面，7種生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)均能加速菌絲生長(zhǎng)，其中，三十烷醇和6-芐氨基嘌呤處理后菌絲生長(zhǎng)速度較快，分別為6.84，6.62 mm/d，與CK之間差異達(dá)極顯著水平，其次為赤霉素、蕓苔素內(nèi)酯和3-吲哚乙酸，分別為5.74，5.66，5.44 mm/d，與 CK 間差異達(dá)顯著水平，萘乙酸對(duì)菌絲生長(zhǎng)速度影響較小，僅為4.49 mm/d。

噴施三十烷醇和蕓苔素內(nèi)酯的培養(yǎng)袋菌絲長(zhǎng)勢(shì)最旺盛，3-吲哚乙酸和赤霉素處理后的長(zhǎng)勢(shì)次之，萘乙酸處理后與CK對(duì)比差異不顯著，而6-芐氨基嘌呤處理后菌絲長(zhǎng)勢(shì)較弱。

表2 不同生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)對(duì)白靈菇生理特性的影響

不同生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)對(duì)出菇率影響較小，噴施蕓苔素內(nèi)酯后出菇率最高，可達(dá)98.76%，三十烷醇次之，達(dá)98.49%，二者之間差異不顯著。噴施3-吲哚乙酸、6-芐氨基嘌呤和萘乙酸與CK之間差異未達(dá)顯著水平，僅有赤霉素噴施后表現(xiàn)出出菇率降低的趨勢(shì)，但與CK之間差異不顯著。

噴施這7種生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)后，生物學(xué)效率與平均產(chǎn)量變化趨勢(shì)一致，蕓苔素內(nèi)酯和三十烷醇處理后的生物學(xué)效率和產(chǎn)量均較高，分別為62.79%，61.32%和251.16，245.28 g/袋。3-吲哚乙酸和赤霉素處理后生物學(xué)效率與產(chǎn)量與CK之間差異顯著。6-芐氨基嘌呤和萘乙酸處理后，與CK之間差異未達(dá)顯著水平。

噴施蕓苔素內(nèi)酯后現(xiàn)蕾天數(shù)最短，為（108±2）d。三十烷醇處理后比CK現(xiàn)蕾天數(shù)提前6 d，3-吲哚乙酸和6-芐氨基嘌呤處理后現(xiàn)蕾天數(shù)相近，比CK現(xiàn)蕾天數(shù)均提前2 d，赤霉素和萘乙酸處理后現(xiàn)蕾天數(shù)與CK表現(xiàn)一致。

2.2 不同生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)對(duì)白靈菇酶活性的影響

2.2.1 不同生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)對(duì)白靈菇不同生長(zhǎng)階段纖維素酶活性的影響 從圖1可以看出，噴施不同生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)后，對(duì)白靈菇不同生長(zhǎng)發(fā)育階段羧甲基纖維素酶活性影響不同，但總體變化趨勢(shì)與CK保持一致，即現(xiàn)蕾前較低，現(xiàn)蕾后迅速升高。蕓苔素內(nèi)酯對(duì)羧甲基纖維素酶影響最大，噴施之后在各個(gè)階段均能顯著提高其活性，與CK之間差異顯著。第105天時(shí)達(dá)最大值（20.2 U），隨后急劇降至14.5 U。三十烷醇影響次之，與CK之間差異也達(dá)顯著水平，其在第70天時(shí)，酶活性最低，為1.6 U，隨后快速上升，在第105天時(shí)達(dá)最大值，為19.3 U。6-芐氨基嘌呤、赤霉素和萘乙酸對(duì)白靈菇各生長(zhǎng)階段的羧甲基纖維素酶活性雖能提高，但與CK之間差異不顯著。所有處理均表現(xiàn)出在后熟期開始至第45天達(dá)第1個(gè)峰值，隨后降低，在第70天達(dá)最小值，隨后急劇上升，在第105天時(shí)達(dá)第2個(gè)峰值，隨后又下降。

2.2.2 不同生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)對(duì)白靈菇不同生長(zhǎng)階段半纖維素酶活性的影響 從圖2可以看出，噴施生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)后，白靈菇不同生長(zhǎng)發(fā)育階段半纖維素酶活性均有提高，但總體趨勢(shì)與CK保持一致，即現(xiàn)蕾前較低，現(xiàn)蕾后迅速升高。蕓苔素內(nèi)酯對(duì)半纖維素酶影響最大，噴施之后在各個(gè)階段均能顯著提高其活性，在第105天時(shí)達(dá)44.3 U，與CK之間差異極顯著，隨后115 d時(shí)，急劇下降為6.23 U，此時(shí)半纖維素酶活性與CK之間差異仍達(dá)顯著水平。

其次為3-吲哚乙酸和三十烷醇，對(duì)半纖維素酶活性影響二者之間差異不顯著，與CK之間差異顯著，在第105天時(shí)均達(dá)最大值，分別為44.3，45.9 U，隨后又分別急劇降至5.1，5.23 U。6-芐氨基嘌呤、赤霉素和萘乙酸對(duì)白靈菇各生長(zhǎng)階段的半纖維素酶影響與CK之間差異不顯著。所有處理均表現(xiàn)出在第35天時(shí)達(dá)第1個(gè)峰值，隨后降低，在第65天時(shí)達(dá)最小值，隨后急劇上升，在第105天時(shí)達(dá)第2個(gè)峰值，隨后又下降。

3 結(jié)論與討論

不同種類的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)施用可明顯促進(jìn)白靈菇菌絲生長(zhǎng)，縮短發(fā)菌和現(xiàn)蕾時(shí)間，使出菇相對(duì)集中，提高產(chǎn)量，改善品質(zhì)。本研究結(jié)果表明，蕓苔素內(nèi)酯對(duì)白靈菇生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)節(jié)作用較大，可使現(xiàn)蕾期提前13 d左右，同時(shí)有效改善白靈菇現(xiàn)蕾前需低溫處理的條件。三十烷醇和3-吲哚乙酸對(duì)白靈菇生長(zhǎng)發(fā)育的調(diào)節(jié)作用次之，對(duì)白靈菇的提前現(xiàn)蕾和提高出菇率也有促進(jìn)作用。這些結(jié)果應(yīng)該與生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)能夠促進(jìn)白靈菇細(xì)胞分裂，進(jìn)而增強(qiáng)胞外酶活性有關(guān)[20]。

雖然本研究為解決白靈菇現(xiàn)蕾不均勻、現(xiàn)蕾率低、后熟期太長(zhǎng)、需要低溫促熟等生產(chǎn)實(shí)際問題提供了依據(jù)，但本研究只針對(duì)單一生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)噴施后的影響進(jìn)行了研究，尚未對(duì)復(fù)合型生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)的影響做進(jìn)一步研究，另外，關(guān)于生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)使用的最佳時(shí)期和濃度還有待于進(jìn)一步探索。